Неинвазивная диагностика колоректального рака на основе молекулярно-генетического анализа ДНК, выделенной из фекалий

Материалы и методы. Отбор и транспортировка образцов. Образцы
фекалий были предоставлены ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, ФГБУ «НИИ
онкологии им. Н.Н. Петрова» и ГБУЗ «Санкт-Петербургский клинический
научно-практический центр». Образцы были получены у 116 человек, из них 82
пациента с КРР и 34 добровольца без новообразований желудочно-кишечного
тракта (контрольная группа).
Около 5 г фекалий было отобрано у каждого индивидуума. Пробу
помещали в герметичный пластиковый контейнер, содержащий 1 мл буферного
раствора 0,5 М ЭДТА при рН=8,0, транспортировали и хранили при +4ºС.
Выделение геномной ДНК производили в течение 24 часов после отбора пробы.
Для пациентов с КРР были предоставлены демографические данные,
диагнозбылподтвержденгистологическииполученыклинико-
патологоанатомические данные опухолей.
Наличие или отсутствие опухоли у пациентов и контрольной группы было
установлено методом колоноскопии.
Продолжительность срока и условия хранения образцов фекалий. Была
проанализирована эффективность метода диагностики в зависимости от
продолжительности и условий хранения образцов фекалий. Десять образцов
фекалий от пациентов с КРР и здоровых волонтеров инкубировали в течение
десяти дней при +4ºС с последовательным отбором части проб и выделением
ДНК их них через каждые трое суток. Выделенная ДНК была охарактеризована
методами спектрофотометрии и ПЦР с последующим электрофорезом. По
итогам проделанной работы было рекомендовано хранить образцы до семи
суток.
ВыделениеДНК.ВыделениегеномнойДНКпроизводилис
использованиемнабора«ДНК-сорб-В»фирмы«АмплиСенс»ЦНИИЭ
Роспотребнадзора (Москва).
ПЦР-анализ. С целью проверки успешности выделения ДНК и отсутствия
ингибирования ПЦР предварительно проводили амплификацию двух коротких
фрагментов длиной менее 200 н.п. из разных участков генома: фрагмент гена
ТР53 длиной 141 н.п. и фрагмент гена BLM длиной 153 н.п.
ДляоценкицелостностигеномнойДНКметодомПЦР-анализа
использовали два протяженных фрагмента: фрагмент гена ТP53 длиной 800 н.п.
(ТР53 800) и фрагмент гена MLH1 длиной 2340 н.п. (MLH1 2340).
Полимеразную цепную реакцию проводили при помощи набора «Encyclo Plus
PCR kit» («Евроген», Москва) в соответствии с инструкциями производителя.
Визуализация полученных результатов. Для визуализации полученных
продуктов амплификации проводили одномерный электрофорез в 6%-м ПААГ с
последующим окрашиванием нитратом серебра.
Для анализа полученных изображений использовали ПО ImageJ.
Real-Time PCR. Для образцов от 40 пациентов была проведена
полимеразная цепная реакция в реальном времени. Для проведения реакции
использовали HS Taq ДНК-полимеразу («Евроген», Москва) при амплификации
коротких фрагментов (ТР53 141 и BLM 153) и набор «Encyclo Plus PCR kit» при
амплификации протяженных фрагментов (ТР53 800 и MLH1 2340). Для
визуализации результатов использовали интеркалирующий краситель SYBR
Green I («Евроген», Москва). Реакцию проводили на детектирующем
амплификаторе CFХ96 (BioRad, США). В качестве стандарта в ПЦР-РВ
применяли коммерческую ДНК человека («Евроген», Москва).
Анализ эффективности проводили с использованием программного
приложения CFХ96 («BioRad», США).
Статистический анализ. Для анализа данных использовали программу
Graphpad Instat. Различия между группами считали достоверными на уровне
95% вероятности при р<0,05. ROC-кривые (англ. Receiver Operating Characteristic (ROC) curve), помогающие оценить эффективность метода, были построены при помощи онлайнприложения(http://www.rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFITi.html), разработанного в Университете Джона Хопкинса (Балтимор, США). АнализнаскрытуюкровьпроводилиприпомощитестаFIT (ИммуноХром-ГЕМ-ЭкспресспроизводстваООО«МЕД-Экспресс- Диагностика»). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Возможность выделять ДНК человека из образцов фекалий и проводить ееанализбылапродемонстрированазадвапоследнихдесятилетия многочисленнымигруппамиисследователей(Carozzietal.,2013). Колоректальные раковые клетки наряду с нормальными попадают в фекалии человека, предоставляя таким образом материал для исследования. Отбор фекальных образцов у пациентов и условия их хранения до начала следующего этапа работы являются важным пунктом нашего протокола. Биомолекулы в фекальных массах подвергаются действию ряда активных соединений и разрушаются, соответственно, возможная деградация ДНК в образцах влечет за собой и снижение эффективности молекулярного анализа. Помещение образцов фекалий в стабилизирующий буферный раствор в первые минуты после отбора пробы способно предотвратить разрушение ДНК и обеспечить пригодность образцов для анализа в течение более длительного промежутка времени. Нами предложены следующие условия хранения и транспортировки образцов фекалий, обеспечивающие максимальную их сохранность до 7-ми суток в буферном растворе 0,5 М ЭДТА при рН=8,0 и +4°C. Для наиболее эффективного выделения ДНК было испытано пять различных методик. Оптимальным вариантом выделения ДНК по нашим данным является метод с использованием набора «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Москва), который и применяли в дальнейшей работе. Для ДНК, полученной из образцов фекалий, возможно ингибирование ПЦР примесями, встречающимися в пробах данного типа (Stauffer et al., 2008). С целью проверки успешности выделения ДНК и отсутствия ингибирования ПЦР предварительно производили амплификацию двух коротких фрагментов длиной менее 200 н.п. для ДНК, полученной из образцов пациентов с КРР и из контрольной группы. Полученные короткие ПЦР-фрагменты свидетельствуют о выделении достаточного количества ДНК для проведения дальнейших экспериментов (намножения протяженных фрагментов) и об отсутствии ингибированияПЦР-реакции.Примерыполученныхэлектрофореграмм представлены на рисунке 1.а. Рисунок1.Примерыэлектрофоретическогоанализапродуктов амплификации фрагментов ДНК, выделенной из стула Н1, Н2 – продукты амплификации ДНК, выделенной из стула здоровых индивидуумов; Р1, Р2, Р3, Р3, Р5 – продукты амплификации ДНК, выделенной из стула пациентов с колоректальным раком; ПК– положительный контроль амплификации; ОК – отрицательный контроль амплификации; М – маркер молекулярного веса (DNA Ladder «Евроген», Москва). а) ТР 53 141 – фрагмент ДНК длиной 141 н.п. расположен в кодирующей области гена ТP53); б) ТР53 800 – фрагмент ДНК длиной 800 н.п. Амплификациякороткихфрагментовпроисходилакаквслучае использования образцов ДНК, полученных из кала больных с колоректальным раком, так и здоровых индивидуумов. Интенсивность электрофоретических зон коротких фрагментов ДНК практически не отличалась у группы больных и контрольной группы (проанализировано при помощи ПО ImageJ). Использование двух фрагментов из разных участков генома (BLM – фрагмент гена BLM, расположенного на хромосоме 15q26.1 и В9 – фрагмент гена TP53, расположенного на хромосоме 17p13.1) позволило повысить достоверность полученных результатов. На следующем этапе методом ПЦР-анализа выявляли протяженные фрагменты ДНК, по присутствию которых судили о наличии у пациента КРР (Рисунок 1.б). Данные фрагменты ДНК были обнаружены в фекалиях 63-х из 82-х пациентов с КРР, в том числе фрагменты гена ТP53 – в 53-х случаях, гена MLH1 – в 50-ти случаях. В контрольной группе из 34-х человек протяженные фрагменты ДНК в фекалиях были выявлены в одном случае. Визуализация результатов с помощью электрофореза является более наглядной, так как позволяет оценить длину фрагментов, в то время как использование ПЦР в реальном времени ускоряет процесс анализа. Результаты, полученные при анализе протяженных фрагментов с использованием ПЦР-РВ (группа из сорока пациентов), были идентичны результатам, полученным для той же группы пациентов при проведении стандартной ПЦР. Таким образом, была продемонстрирована возможность применения предлагаемого способа диагностики как с использованием техники ПЦР-электрофореза, так и техники ПЦР-РВ. Рисунок 2. Кривые флуоресценции протяженного фрагмента TP53 для пяти образцов фекальной ДНК (краситель SYBR Green I) Зеленые линии– продукты амплификации ДНК, выделенной из фекалий пациентов с колоректальным раком;. синие линии – продукты амплификации ДНК, выделенной из фекалий здоровых индивидуумов (фрагмента ТР53 800). Были проанализированы эффективность амплификации и возможное ингибирование примесями в фекальной ДНК. Для расчета эффективности реакции применяли программное обеспечение Bio-Rad CFX. Эффективность ПЦР протяженных фрагментов составила 80-88 % для ДНК-матриц от разных биообразцов, что является хорошим показателем, учитывая большой размер фрагмента и то, что фекальная ДНК является сложным объектом для амплификации. Анализ возможного ингибирования ПЦР проводили в двух вариантах: последовательным разбавлением исходной матрицы и с использованием стандартов ДНК. По результатам проведенной работы можно говорить об отсутствиизначимогоингибированияПЦР.Припроведениитеста рекомендуется использовать полученный при выделении раствор ДНК без разбавлений. Итоговая схема предлагаемого способа диагностики представлена на рисунке 3. Рисунок 3. Основные этапы предложенного способа диагностики Полученные результаты были статистически обработаны при помощи программы Graphpad Instat. Для пациентов, входящих в тестируемую группу, были подсчитаны следующие параметры: Р - вероятность случайности (определенная с использованием точного метода Фишера), чувствительность, специфичность,позитивныеинегативныепредсказательныезначения. Полученные данные представлены в таблицах 1,2 и 3. Таблица 1. Статистические данные по стадиям заболевания и эффективности использования фрагментов генов в тесте Стадии заболеванияФрагменты генов ПараметрыПациенты I-IIIII-IVTP53MLH1 Вероятность случайности (Р)1<0,0001<0,0001<0,0001<0,0001<0,0001 Чувствительность20,76830,76320,772700,64630,6098 95% CI0,6624 –0,5980 –0,6219 –0,5325 –0,4955 – 0,85410,88570,88540,74840,7160 Специфичность30,97060,97060,97060,97060,9706 95%CI0,8467 –0,8467 –0,8467 –0,8467 –0,8467 – 0,99930,99930,99930,99930,9993 Позитивное предсказательное0,98440,96670,97140,98150,9804 значение4 95% CI0,9161 –0,8276 –0,8508 –0,9010 –0,8955 – 0,99960,99920,99930,99950,9995 Негативное предсказательное0,63460,78570,76740,53230,5077 значение 5 95% CI0,4892 –0,6315 –0,6139 –0,4008 –0,3804 – 0,76400,89710,88240,66060,6338 Примечания: 1 - представлены значения вероятности (P), определенной с использованием точного метода Фишера; 2 - чувствительность - доля истинных положительных случаев, которые были правильно идентифицированы тестом; 3 - специфичность - доля истинных отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы тестом; представлены средние значения и 95%-ный доверительный интервал. 4 - позитивное предсказательное значение - доля истинно положительных результатов среди всех положительных значений теста; 5 - негативное предсказательное значение - доля истинно отрицательных результатов среди всех отрицательных значений теста. Отдельно для фрагмента TP53 чувствительность составила 65%, а для фрагмента MLH1 61%. При использовании двух фрагментов совместно чувствительность повышалась. Диагностические параметры для комплекса из двух маркеров составили соответственно 77% для чувствительности и 97% для специфичности (P <0,0001). Для оценки эффективности теста были построены ROC-кривые (Receiver Operator Characteristic) и вычислены площади под ними (Area Under Curve, AUC) (см. Рис.4). Для обоих фрагментов совокупно величина AUC составляет 0,87, тогда как при использовании одного фрагмента площадь составляла 0,8 для ТР53 800 и 0,79 для MLH1 2340. Рисунок4.ХарактеристическиеROCкривые,построенныедля рассматриваемого метода Примечания. Красная линия – кривая для двух фрагментов суммарно. Зеленая линия – для фрагмента ТР53 800. Синяя линия – для фрагмента MLH1 2340. Таблица 2. Статистические данные по полу и возрасту пациентов ВозрастПол ПараметрыПациенты >50 лет<50 летЖМ Вероятность случайности (Р)<0,0001< 0.0001< 0.0001<0,0001<0,0001 Чувствительность20,76830,78130,72220,78950,7500 95% CI0,6624 – 0,85410,6603 –0,4655 –0,6264 –0,5971 – 0,87480,90300,90440,8681 Специфичность30,97060,97060,97061,0000,9286 95% CI0,8467 – 0,99930,8467 –0,8467 –0,8317 –0,6611 – 0,99930,99931,0000,9982 Позитивное предсказательное0,98440,98040,92861,00000,9706 значение4 95% CI0,9161 – 0,99960,8955 –0,6611 –0,8843 –0,8467 – 0,99950,99821,0000,9993 Негативное предсказательное0,63460,70210,86840,71430,5417 значение 5 95% CI0,4892 – 0,76400,5510 –0,7195 –0,5135 –0,3285 – 0,82670,95580,86760,7448 Примечания: см. примечания к Таблице 1 С уровнем статистической достоверности более 95% не выявлено статистически значимых различий между чувствительностью метода для пациентов с I–II (76%) и III –IV (77%) стадией (P=1,0000), что демонстрирует возможности метода для ранней диагностики КРР. С уровнем статистической достоверности более 95% не выявлено статистически значимых различий между чувствительностью метода для пациентов разного возраста (P=0,7523) и пола (P=0,7948). Многимиисследователямипоказано,чтоправостороннийи левосторонний рак толстой кишки имеют различную клиническую картину и биологические особенности и должны рассматриваться как два различных заболевания.Мыпроанализировализависимостьчувствительности разработанного метода диагностики КРР от локализации опухоли (Бутрович и др., 2018). Для получения статистически достоверного результата объединили данные по сигмовидной, слепой, поперечно-ободочной, восходящей ободочной и нисходящей ободочной кишке. В нашей выборке встречаемость КРР, определенная методом колоноскопии в разных отделах, была следующей: прямая кишка – 59 %, остальные отделы толстой кишки – 41%. Выявлена статистическая значимая разница в чувствительности метода диагностики для прямой кишки по сравнению с другими отделами толстой кишки (Р=0,0314)– 85% против 65 % (Табл. 3). Это в определенной степени ожидаемый результат, принимая во внимания принцип действия рассматриваемого метода. Очевидно, что происходящие из наиболее удаленных от анального отверстия отделов толстой кишки раковые клетки находятся в просвете кишечника существенно большее время, чем клетки из прямой кишки и, по- видимому, в большей степени подвергаются разрушительному действию ферментов, в результате чего их ДНК расщепляется сильнее. Это и определяет несколько меньшую чувствительность метода для опухолей, локализованных в проксимальных отделах кишечника. Таблица 3. Статистические данные по клинико-патологоанатомическим характеристикам опухолей ЛокализацияНекрозНаправление роста Остальные ПараметрыПрямаяотделы ЕстьНетЭкзоЭндо кишкатолстой кишки Вероятность <0,0001<0,0001<0,0001<0,0001<0,0001<0,0001 случайности (Р)1 Чувствительность20,85420,64710,88680,55170,80000,7188 95% CI0,7221 –0,4647 –0,7695 –0,3570 –0,6631 –0,5325 – 0,93940,80260,95730,73570,89980,8627 Специфичность30,97060,97060,97060,97060,97060,9706 95% CI0,8467 –0,8467 –0,8467 –0,8467 –0,8467 –0,8467 – 0,99930,99930,99930,99930,99930,9993 Позитивное0,97620,95650,97920,94120,97560,9583 предсказательное значение4 95%CI0,8742 –0,7807 –0,8893 –0,7133 –0,8715 –0,7886 – 0,99940,99890,99950,99850,99940,9989 Негативное0,82500,73330,84620,71740,76740,7857 предсказательное значение5 95% CI0,6722 –0,5808 –0,6945 –0,5658 –0,6139–0,6315 – 0,92660,85410,94130,84030,88240,8971 Примечания: см. примечания к Таблице 1. Чувствительность метода диагностики КРР при выявленном в опухоли некрозе составила 89 %, а в отсутствие некроза – 55%; однако статистически значимых различий между чувствительностью метода для пациентов с некрозом опухоли и без него (Р=0,0562) не выявлено. Тем не менее, можно говорить о наличии выраженной тенденции повышения чувствительности в случае некроза. Невыявленостатистическизначимыхразличиймежду чувствительностью метода в отношении опухолей с эндофитным или экзофитным ростом (Р=0,4302). Метод, который обеспечивает анализ целостности ДНК в образцах фекалийпациентов,позволяетпроводитьнеинвазивнуюдиагностику колоректального рака. Степень сохранности ДНК в таких образцах напрямую зависит от корректной работы апоптотических механизмов. Поскольку одной из характеристик осуществления апоптоза может быть расщепление ДНК на фрагменты около 200 н.п. (Boynton et al., 2003), наличие высокомолекулярных фрагментов ДНК в стуле раковых больных может указывать на то, что определенная популяция клеток избежала апоптоз-индуцированной деградации ДНК. Одно из возможных предположений состоит в том, что это явление может быть следствием защиты от нуклеаз. Хроматиновая структура раковых клеток не может быть деградирована и, таким образом, ДНК оказывается недоступной для вызванного нуклеазами расщепления. Процедура диагностики КРР, основанная на анализе целостности фекальной ДНК, привлекла внимание исследователей быстротой, дешевизной и возможностью проводить неинвазивную диагностику КРР. В работе Yehya A.H. с соавторами (Yehya et al., 2012) для анализа протяженных фрагментов ДНК использовали фрагмент гена TP53 (1476 н. п.), при этом чувствительность и специфичность метода при выявлении КРР составили 56,3% и 100% соответственно. В данном исследовании для определения целостности геномной ДНК в качестве маркеров используются два протяженных (молекулярный вес которых превышает 800 н.п.) фрагмента (генов ТР53 и MLH1), что обеспечивает более высокую чувствительность теста. Целесообразность применения двух маркеров связана с наличием двух преимущественных путей развития КРР, в которые вовлечены две разные группы генов. Характерными представителями этих путей и являются гены ТР53 и MLH1, одновременное повреждение которых встречается с небольшой вероятностью (Fearon, 2011). Так, если у пациента поврежден ген ТР53, фрагмент этого гена может не амплифицироваться, однако в предложенном нами тесте будет выявляться фрагмент гена MLH1, что уменьшает вероятность ложноотрицательного заключения (Бутрович и др., 2016; Бутрович и др., 2017). В исследовании Zhang Y. с соавторами (Zhang et al., 2015) для скрининга КРР проводили ПЦР-анализ протяженных (800 п. о.) фрагментов генов APC, KRAS, BRAF и ТР53. Чувствительность анализа для диагностики КРР с использованием комбинации из четырех фрагментов была выше чем при использовании каждого фрагмента по отдельности. Тем не менее, общая чувствительность не превысила 56%. Специфичность составила 96% (Р <0,0001). Высокая специфичность в упомянутых работах объясняется в том числе и выборомфрагментавысокойпротяженности,что,возможно,снижает чувствительность,нозадаетвысокийпорогдляотсеченияложно положительных результатов. Было проведено сравнение предлагаемого теста с таким вариантом диагностики КРР, как FIT. Анализ был проведен для 30-ти пациентов с диагнозом КРР и контрольной группы. На основе полученных результатов были подсчитаны чувствительность и специфичность с использованием критерия Фишера. Чувствительность составила 73,3 %, специфичность 90% (P=0,0007). Кроме того, была построена ROC-кривая и подсчитана площадь под ней (см. рисунок 5). Рисунок5.ХарактеристическиеROCкривые,построенныедля рассматриваемого метода и теста FIT.Красная кривая- метод протяженных фрагментов. Зеленая кривая - тест FIT. Для теста на скрытую кровь величина AUC была равна 0,82, что согласуется с данными литературы; так, в работе Guimaraes значение AUC для FIT составила 0,8 (Guimaraes et al., 2019). Для разработанного в данном исследовании метода протяженных фрагментов значение AUC составляет 0,87. Данные результаты позволяют говорить о большей эффективности метода протяженных фрагментов. ВЫВОДЫ 1.ФрагментыДНКразмеромболее800п.н.встречаются преимущественно в фекалиях людей со злокачественными новообразованиями из эпителиальной ткани толстой кишки. Фрагменты ДНК размером менее 200 н.п. выявляются как в фекалиях людей, больных колоректальным раком, так и у людей, не имеющих новообразований толстой кишки. 2. Одновременное применение двух протяженных фрагментов ДНК, повреждения которых обычно взаимно исключают друг друга, повышает общую чувствительность диагностики по сравнению с использованием в качестве маркера одного фрагмента. 3. Разработан способ неинвазивной ПЦР-диагностики колоректального рака, основанный на оценке целостности ДНК, имеющейся в фекалиях пациента. Он включает способ хранения и транспортировки образцов, позволяющий дистанционный анализ пациента, выделение ДНК из фекалий и анализ ее целостности. 4. Чувствительность разработанного способа диагностики составила 77%, а его специфичность 97%. На чувствительность разработанного теста не оказывают влияние возраст, пол пациентов и направление роста опухоли (экзофитный или эндофитный тип), а также стадия заболевания, что делает возможным раннее выявление данной патологии. 5. Чувствительность разработанного способа диагностики зависит от локализации новообразования в толстой кишке. При локализации опухоли в прямой кишке чувствительность выше и составляет 85%. 6. Произведено сравнение эффективности разработанного способа диагностики и теста на скрытую кровь (ИммуноХром-ГЕМ-Экспресс). Площадь AUC под характеристическими кривыми составляет 0,87 для представленного теста и 0,82 для теста на скрытую кровь, что свидетельствует о большей эффективности метода протяженных фрагментов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Терапевтам, хирургам, гастроэнтерологам и онкологам в рамках установленных сроков диспансеризации для всего населения, а также при обследовании лиц из группы риска развития КРР (возраст более пятидесяти лет, наследственные синдромы, отягощенный семейный анамнез, перенесенный ранееколоректальныйракилиполипы,воспалительныезаболевания кишечника) рекомендуется использовать способ диагностики на основе анализа протяженных фрагментов ДНК в фекалиях пациентов в качестве альтернативы (или дополнительно) к анализам кала на скрытую кровь (FOBT или FIT). Обнаружение протяженных фрагментов в кале пациентов свидетельствует о возможномналичиизлокачественныхновообразованийэпителиального происхождения в толстой кишке пациента с 77%-ой чувствительностью и 97%- ой специфичностью. Следует учитывать, что тест обладает меньшей чувствительностью при выявлении новообразований в верхних отделах кишечника. В случаях положительного результата ДНК-теста, независимо от результата теста на скрытую кровь, если оба теста были использованы совместно, рекомендуется назначение фиброколоноскопии. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ В качестве следующего этапа работы планируется дальнейшая апробация предложенного способа диагностики методом двойного слепого тестирования на базе поликлиники СПб больницы РАН. Отдельно планируется оценить эффективность разработанного теста на группе пациентов с доброкачественными новообразованиями толстой кишки. .