Оценка свойств пробиотических и аутопробиотических штаммов лактобацилл разными методами

Актуальность темы исследования
Организм человека содержит триллионы микроорганизмов, общее
количество которых более чем в 10 раз превышает число его собственных
клеток, при этом общая масса всей микробиоты человека составляет от 1 до
3% массы его тела. Видовое разнообразие микробиоты измеряется
четырехзначным числом (более 1000 видов), а совокупное количество ее
генов (микробиом) – семизначным (около 3,3 млн. генов), превышая по
численности геном человека в 150 раз [92]. Среди биотопов человека
кишечник имеет особое значение, поскольку около 70% микроорганизмов,
населяющих организм человека, обитают в толстой кишке, которая
выполняет важнейшие функции, такие как адсорбция, секреция электролитов
и воды, поддержание гомеостаза и многие другие [116].
Проблемы становления, формирования и функционирования
нормальной микробиоты человека, а также возможности ее восстановления
после нарушений различной степени тяжести, издавна являются важными в
микробиологических исследованиях. Эта микробиота чрезвычайно важна для
сохранения гомеостаза организма, повышения устойчивости во внешней
среде. Все это достигается как за счет антагонистической функции
нормальной микробиоты по отношению к патогенам, так и опосредованно
через включение механизмов иммунной системы. [38, 59].
Особую роль в поддержании гомеостаза организма играет нормальная
микробиота кишечника. Это одна из наиболее заселенных экологических
ниш макроорганизма, где, по различным данным, живет от 200 до 500
различных видов микроорганизмов. Одной из наиболее значимых групп
микроорганизмов кишечника являются лактобациллы, широко используемые
в качестве пробиотических препаратов для коррекции дисбактериозов
человека [112, 135].
Лактобациллы и их роль, а также использование, особенно для
коррекции дисбактериозов кишечника человека, являются одной из наиболее
обсуждаемых проблем при оценке значимости микробиоты
макроорганизмов. В последние годы появилось много новых лекарственных
препаратов с различными штаммами лактобацилл. Вместе с тем отмечается,
несмотря на высокий терапевтический эффект, последующая элиминация из
кишечника внесенных лактобацилл, входящих в состав примененного
препарата. Причины и механизмы данного явления до настоящего времени
не вполне расшифрованы [10].
Как известно, исследование бактериальной популяции возможно на
трех уровнях организации биологической системы: клеточном, клеточно-
популяционном и популяционном.
На клеточном уровне изучаются отдельные клетки, их
морфофизиологические особенности роста и развития в различных условиях
среды культивирования [133].
На клеточно-популяционном уровне учитывается гетерогенность
клеточной популяции по различным свойствам составляющих популяции
клеток, а также причины возникновения этой гетерогенности.
На популяционном уровне изучается динамика поведения микробных
популяций в целом и особенности взаимодействия популяций
микроорганизмов между собой при совместном культивировании [143].
Степень разработанности темы исследования
За последние десятилетие достигнуты значительные успехи в
разработке и применении пробиотических продуктов и препаратов на основе
лактобацилл. Однако с расширением спектра показаний для назначения
пробиотиков стала накапливаться информация, что положительный эффект
даже при длительном применении нередко носит временный характер или
полностью отсутствует. Появились отдельные сообщения о возникновении у
лиц, длительно принимающих живые пробиотические микроорганизмы,
различных осложнений 110, 139. Разработка новых пробиотиков активно
продолжается, и исследования в этом направлении являются
перспективными для обеспечения человека новыми биологическими
препаратами. 123.
Одной из главных причин неэффективности пробиотиков является
чужеродность для человека входящих в их состав микроорганизмов.
Клинико–экспериментальные работы по коррекции дисбактериозов показали,
что лучший эффект достигается либо при индивидуальном подборе
донорских штаммов, либо при использовании собственной микробиоты .
Длительное использование аутоштаммов лактобацилл позволяет достигать
максимального эффекта при восстановлении нормальной микробиоты
кишечника. Создание общедоступных технологий выделения аутоштаммов
лактобацилл для получения молочнокислых продуктов индивидупльного
получения крайне важно для устранения микроэкологических нарушений
кишечника.
Отечественными исследователями предложен способ получения
аутопробиотиков, содержащих живые бифидобактерии и лактобациллы .
Недостатками данного способа было использование всего по одному штамму
выделенных отдельно бифидобактерий и лактобацилл из всего многообразия
видов этих индигенных микроорганизмов (до 5 видов бифидобактерий и
более 10 видов лактобацилл). Кроме того, при данном способе выделения
аутоштаммов велика вероятность того, что выделенные культуры являются
клонами чужеродных для хозяина микроорганизмов, случайно попавших в
пищеварительный тракт с пищей и водой, а также возможность случайного
отбора среди культур лактобацилл и бифидобактерий не самых активных в
антагонистическом отношении штаммов.
В последние годы перспективным направлением является разработка
новых технологий выделения аутопробиотиков на основе естественного
комплексного микробиоценоза бифидобактерий и лактобацилл толстой
кишки человека. Полученный аутопробиотик может быть использован для
коррекции дисбактериоза и заболеваний, связанных с нарушениями
нормальной микробиоты кишечника у человека . Поэтому создание
общедоступных технологий выделения аутоштаммов лактобацилл для
получения пробиотиков индивидуального потребления крайне важно для
устранения микроэкологических нарушений кишечника и требует
дальнейшего изучения.
Несмотря на широкое и успешное использование лактобацилл для
коррекции дисбактериоза кишечника [4, 46, 71], морфофункциональные
особенности взаимодействия их со средой обитания, особенно на ранних
стадиях образования колоний, изучены слабо. Однако изучение начальных
стадий образования колоний (до этапа формирования устойчивой биопленки)
чрезвычайно важно, поскольку здесь может быть получен новый материал
для понимания процессов закрепления, функционирования и устойчивости
лактобацилл в составе микробиоценоза кишечника. Вместе с тем
исследования клеточного и клеточно-популяционного уровней протекания
биологических процессов, несомненно, даст основу для понимания
популяционных взаимодействий лактобацилл и другой микробиоты в
сложной структуре микробиоценоза кишечника при культивировании в
различных условиях.
Цель работы: оценить свойства аутопробиотического комплекса
лактобацилл с использованием различных методов исследования бактерий.
Для достижения выше указанной цели были поставлены следующие
задачи:
Задачи исследования:
1. Определить наиболее информативный физиологический показатель
состояния клеток лактобацилл на различных уровнях развития (клеточном,
видовом и популяционном).
2. Установить межвидовую биосовместимость лактобацилл и оценить
влияние условно-патогенной микробиоты на представителей рода
Lactobacillus.
3. Оценить действие природных биологически активных веществ на
различные штаммы лактобацилл.
4. Изучить влияние иммунных факторов слюны на клетки лактобацилл
in vitro.
5. Разработать способ выделения аутоштаммов лактобацилл, выбрать
методы оценки степени чистоты и сохранения жизнеспособности культур
полученного аутопробиотического комплекса для контроля его качества.
6. Сравнить аутопробиотические комплексы кишечника родственников
разного возраста для их возможного использования внутри семейной группы.
Научная новизна исследования
Установлен физиологический показатель, позволяющий
охарактеризовать состояние популяции лактобацилл на клеточном уровне –
время генерации для первого и второго поколений клеток. Наиболее
информативным показателем оказалось время размножения клеток
лактобацилл второго поколения, в котором зафиксирован жизненный цикл
отдельной клетки.
Показано, что пробиотические штаммы лактобацилл обладали
различным спектром антагонистической активности как в отношении друг
друга, так и в отношении штаммов условно-патогенной микробиоты
кишечника человека. Информация о биосовместимости культур необходима
при конструировании новых биопрепаратов (про- и симбиотиков) для
коррекции дисбиотических нарушений кишечной микробиоты.
Выявлено, что пробиотические лактобациллы, обладавшие
антагонистической активностью, идентичны у генетически близких
родственников.
Впервые установлено, что биологически активные вещества сока и
порошка гриба Шиитаке на 40 – 75% стимулируют рост лактобацилл.
На основании полученных данных при изучении свойств лактобацилл
разными методами разработан новый аутопробиотический комплекс (АПК).
Доказано, что лактобациллы аутопробиотического комплекса при минус
20 °С в условиях длительного хранения (24 месяца) не снижали
жизнеспособность.
Теоретическая и практическая значимость
Изучены биологические особенности развития лактобацилл при
различных (оптимальных и экстремальных) условиях культивирования.
Получены данные о межвидовых взаимоотношениях лактобацилл на
клеточном и популяционном уровнях, расширяющие представления об их
симбиотических взаимодействиях с условно-патогенными
микроорганизмами и нормальной микробиотой кишечника человека, что
явились основой разработки аутопробиотического комплекса.
Установлена длительность хранения лактобацилл без потери их
жизнеспособности и активности на протяжении не менее двух лет в условиях
низкой температуры (минус 20 °C). Это в перспективе может стать основой
для создания криобанка аутоштаммов при получении продуктов
индивидуального потребления.
Показана перспективность использования натуральных биологически
активных компонентов гриба Шиитаке для стимуляции роста лактобацилл в
пробиотических препаратах и аутопробиотических комплексах.
По результатам проведенных исследований получены патенты РФ
«Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и
лактобациллы» 2014 г. и «Способ получения препарата эубиотика
Лактобактерин с добавлением сока или порошка гриба Шиитаке» 2018 г.
На основании полученных данных издано и используется в курсе
лекций учебное пособие для студентов «Дисбактериоз кишечника. Причины,
симптомы, современная диагностика и эффективное лечение», 2016 г.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех
этапах диссертационного исследования. Основная идея и планирование
научной работы, формулировка цели и задач, определение методологии и
общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с
научным руководителем д.б.н. Кузнецовым О.Ю. Лично автором выполнены
микробиологические и нефелометрические исследования, а также анализ
полученных масс-спектров методом MALDI TOF. Данные, полученные в ходе
выполнения работы, статистически обработаны и проанализированы автором.
Методология и методы исследования
Объектами исследования являлись пробиотические и
аутопробиотические штаммы лактобацилл.
Предметом исследования были физиологические свойства разных
лактобацилл и оригинального аутопробиотического комплека (показатели
размножения, антагонизм, биосовместимость и др.).
Теоретической основой исследований стали литературные сведения о
фундаментальных и прикладных разработках в области микробиологии и
микроэкологии.
Методологической основой работы являлись бактериологические
методы (культивирование, микрокультивирование, тестирование на
антагонизм), инструментальные методы исследования (нефелометрия,
MALDI TOF), статистический анализ и другие специальные методы.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Время деления клеток второго поколения, установленное методом
микрокультивирования, характеризует физиологическое состояние
лактобацилл в норме и при измененных условиях выращивания, а также под
влиянием других бактериальных культур на клеточном и популяционном
уровнях.
2. Разработанный способ выделения, накопления и хранения комплекса
лактобацилл служит основой для получения пробиотика индивидуального
потребления, предназначенного для восстановления микробиоценоза
человека.
3. Метод MALDI TOF может быть использован для быстрого
определения чистоты выделенного АПК (отсутствие посторонних
бактериальных контаминантов) при исследовании групп близких
родственников: детей и взрослых.
4. Биологически активные вещества (сок и порошок) гриба Шиитаке
стимулируют рост лактобацилл при культивировании пробиотических
штаммов.
Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность научных положений и выводов, представленных в
работе, подтверждается применением широкого спектра сертифицированных
микробиологических методов, характеризующихся высокой
воспроизводимостью, чувствительностью и специфичностью, а также
адекватным статистическим анализом полученных данных.
Результаты проведенных исследований доложены на 92-ой ежегодной
научно – практической конференции студентов и молодых ученых «Неделя
науки», посвященной 110-летию со дня рождения профессора С.Д. Носова (г.
Иваново, 2012); Молодежном научно-инновационном конкурсе «УМНИК
2013», I этап (г. Иваново, 2013); II этап (г. Ярославль 2013).
Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедр
микробиологии и вирусологии с другими кафедрами ФГБОУ ВО ИвГМА
Минздрава России (протокол № 2 от 28 апреля 2021 г.).
Объем и структура диссертации
Текст диссертации изложен на 180 страницах компьютерного текста и
состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных
исследований, содержащих описание объектов и методов исследования,
заключения, выводов, списка сокращений и библиографического указателя,
включающего 80 работ отечественных и 76 работ зарубежных источников.
Работа иллюстрирована 15 рисунками и 17 таблицами.