Оптимизация и использование флуоресцентной in situ гибридизации для изучения эволюции хромосом и селекции лука репчатого (Allium cepa L.)

Семена растений поздних поколений гибридов между A. cepa и A. fistulosum были предоставлены Всемирным центром овощных культур (World Vegetable Center) в рамках совместного научного проекта. Межвидовой гибрид F1 между A. cepa и A. fistulosum (донор устойчивости к стемфилиозу) принудительно самоопыляли в течении пяти поколений для получения линии 1275 (S5F1). Беккроссированные линии луков были получены с использованием линии 1275 (S5F1) в качестве материнского растения и лука
репчатого (A. cepa) в качестве отцовского растения.
Инбредные линии лука репчатого (A. cepa) (2n = 2C = 16) были получены
из генетической коллекции ООО «Селекционная станция имени Н. Н. Тимофеева». A. roylei Stearn (2n = 2C = 16) был получен из Центра генетических ресурсов в Нидерландах и использовался в качестве донора устойчивости к пероноспорозу.
Семена растений лука репчатого, сорт Халцедон и лука-батуна (A. fistulosum), сорт Русский зимний были приобретены в компании «Гавриш».
Приготовление препаратов митотических хромосом. Для Tyr-FISH препараты хромосом были приготовлены из суспензии клеток корневой меристемы методом раскапывания “SteamDrop” (Kirov et al., 2014). Для GISH давленные препараты хромосом кончиков корневой меристемы были приготовлены по методике Khrustaleva and Kik (2001).
Получение проб для Tyr-FISH. Были сконструированы праймеры для получения интрон-экзонных ПЦР-продуктов. Геномные ампликоны были клонированы в вектор pAL2-T (Evrogen) и инокулированы в штамм E. coli XL1- Blue (Evrogen). Отбор колоний с интересующей вставкой осуществлялся с помощью бело-голубой селекции. Плазмидную ДНК выделяли с использованием

6
набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific) и секвенировали по Сэнгеру. Выделенная плазмидная ДНК была помечена с помощью DIG-Nick Translation Mix (Roche) или Biotin-Nick Translation Mix (Roche).
Получение проб для GISH. ДНК лука репчатого использовали в качестве блока, а ДНК лука-батуна и A. roylei использовали для приготовления меченной пробы. Пробы для GISH были приготовлены согласно стандартному протоколу Nick-translation (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).
GISH. Выполнение эксперимента осуществлялось по методу Khrustaleva and Kik (1998).
Tyr-FISH. Tyr-FISH картирование осуществлялось в соответствии с протоколом Kudryavtseva et al. (2021).
Микроскопия и анализ изображений. Для DIC микроскопии использовался микроскоп Imager.D1 (http://www.zeiss.com) с иммерсионным объективом x100 с DIC. Препараты после Tyr-FISH и GISH анализировали под микроскопом Zeiss AxioImager M2. Микрофотосъемку осуществляли с помощью цифровой камеры Hamamatsu C13440-20CU (http://www.hamamatsu.com). Обработка изображений выполнялась с помощью программного обеспечения для анализа изображений Zen 2.6 (blue edition). Кариотипирование и определение положения сигналов Tyr-FISH проводили с помощью программы DRAWID (Kirov et al., 2017).
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Оптимизация двухцветного Tyr-FISH
3.1.1. Приготовление и мечение пробы. Увеличение отношения сигнал/фон.
Для создания зонда были выбраны два маркера (Unigene572 и Unigene5305) из карты транскриптома, относящейся к хромосоме 2 (Fujito et al. 2021). Мы выровняли последовательности маркеров Unigene572 и Unigene5305 на базу данных TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) Allium cepa, чтобы найти полные последовательности транскриптов. Для идентификации границ экзонов в последовательности транскриптов использовали черновой вариант сборки генома A. cepa (черновой вариант сборки генома A. cepa был получен от профессора Shigyo). Идентификация мобильных элементов, повторов или их фрагментов, целевая последовательность была выполнена с помощью инструмента CENSOR. Информация о координатах и длинах интронов, фрагментов повторов и мобильных элементах была использована для создания праймеров и получения экзон-интронного ПЦР-продукта. Продукты ПЦР были клонированы и секвенированы. Создание меченого зонда для in situ гибридизации было выполнено с помощью Nick -трансляции.
7

3.1.2. Приготовление препаратов хромосом – ключевой шаг в успешном применении Tyr-FISH
Одним из ключевых шагов в получении надежного флуоресцентного сигнала Tyr-FISH является метод приготовления препаратов хромосом. Было изучено, как метод приготовления препаратов хромосом влияет на частоту детекции сигнала и чувствительность Tyr-FISH детекции сигнала. С помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии (DIC) был проведен сравнительный анализ двух методов приготовления препаратов митотических хромосом растений: (1) метод давленных препаратов хромосом (Khrustaleva and Kik, 2001) и (2) метод «SteamDrop» (Kirov et al., 2014). DIC микроскопия позволяет получить объемное рельефное изображение, соответствующее изменению оптической плотности образца, подчеркивая линии и границы.
В результате DIC-микроскопии было выявлено, что препараты хромосом «SteamDrop» показали более выраженную рельефную структуру с четкими краевыми контурами хромосом (рис. 1а), в то время как давленные препараты митотических хромосом были более плоскими и плотными (рис. 1b). Было показано, что целевая ДНК хромосом, приготовленных методом «SteamDrop», более доступна для ДНК-зонда, чем хромосомы, полученные давленным методом. Частота детекции сигнала на «SteamDrop» препаратах была 77,4%, а на давленных препарата – 35,3% (см. раздел 3.1.4.)
Рисунок 1. Дифференциально-интерференционная контрастная (DIC) микроскопия митотических метафазных хромосом Allium cepa приготовленные «SteamDrop» (а) и давленным методом (b); Шкала – 10 мкм.
3.1.3. Ингибирование эндогенной и экзогенной пероксидазы (HRP)
Метод Tyr-FISH основан на использовании фермента пероксидазы хрена (HRP), который катализирует осаждение молекул тирамидов, меченных флуорофором, рядом с иммобилизованной HRP.
В Tyr-FISH (в отличие от FISH) невозможно провести одновременное обнаружение двух зондов, так как в обоих случаях используется один и тот же фермент HRP: стрептавидин-HRP и анти-дигоксихенин-HRP. Поэтому в методе
8

Tyr-FISH детекция ДНК-зондов осуществляется последовательно, так как необходимо ингибировать активность пероксидазы от первого зонда перед детекцией второго.
Полное ингибирование активности пероксидазы наблюдалось при обработке 3% H2O2 в течение 30 минут (рис. 4), тогда как при низкой концентрации H2O2 (0,3% в течение 30 минут) активность фермента сохранялась (рис. 2с).
Рисунок 2. Оценка ингибирования пероксидазы хрена (HRP) на двухцветном препарате Tyr-FISH «SteamDrop». Ингибирование 0,3% H2O2 в течение 30 мин: (а) визуализация двух зондов – объединенное изображение; (b) визуализация Unigene572, детектированного тирамидами-Cy3, с использованием Cy3-фильтра (красный); (c) визуализация Unigene5305, детектируемого с помощью Tyr-FITC с использованием FITC-фильтра (зеленый), стрелки указывают на сигналы, возникающие от Unigene572, поскольку активность HRP после первого шага детектирования не была подавлена.
Анализ наличия эндогенной пероксидазы на препаратах лука репчатого не выявил характерных флуоресцентных сигналов, что позволило нам удалить пункт ингибирования эндогенной пероксидазы из протокола Tyr-FISH.
3.1.4. Картирование одновременно двух проб на физической хромосоме с помощью двухцветной флуоресцентной in situ гибридизации (Tyr-FISH)
Была выполнена двухцветная флуоресцентная in situ гибридизация (Tyr- FISH) на препаратах митотических хромосом, приготовленных «SteamDrop» и давленным методами. Геномный ампликон Unigene572 (3,2 т.п.н.) был мечен биотином-16-dUTP и детектирован тирамидами-Cy3 (красная флуоресценция), а геномный ампликон Unigene5305 (1,6 т.п.н.) был мечен дигоксигенином-11- dUTP и детектирован с помощью тирамидов-FITC (зеленая флуоресценция) (рис. 3).
Двухцветный Tyr-FISH выявил сигналы на длинном плече хромосомы 2, для Unigene5305 и в коротком плече хромосомы 2, для Unigene572 (рис. 3). Частота обнаружения каждого из сигналов на препаратах «SteamDrop» составила 77,4% и 51,6% для Unigene572 и Unegene5305 соответственно (рис. 3с, d). В отличие от «SteamDrop» препаратов, на давленных хромосомах частота обнаружения Unigene572 составляла 35,3%, а Unigene5305 – только 14,7%.
9

Рисунок 3. Двухцветный Tyr-FISH на митотических метафазных хромосомах Allium cepa, с пробами Unigene572 (красный) и Unigene5305 (зеленый): (а) препарат хромосом «SteamDrop»; (b) препарат давленных хромосом; (c) хромосомы 2 из метафаз препаратов хромосом «SteamDrop»; (d) хромосомы 2 из метафаз, приготовленных давленным методом.
Была также проанализирована частота обнаружения сигналов одновременно двух проб на физической хромосоме 2 (рис. 4). Среди препаратов «SteamDrop» были обнаружены метафазы как с сигналами двух проб на обоих гомологах, как и на одном (варианты 1, 2 и 3, рис. 4). У давленных препаратов хромосом встречались метафазы с сигналами двух проб только на одном гомологе (варианты 1, 2 и 3, рис. 4).
Рисунок 4. Схема вариантов детектируемых сигналов на паре гомологичных хромосомах 2 у «SteamDrop» и давленных препаратов.
Низкая частота детекции Tyr-FISH сигналов на давленных препаратах может быть объяснена использованием водного раствора 45-60% уксусной кислоты в процессе приготовления давленных препаратов хромосом. Иммобилизация тирамидов происходит за счет реакции с богатыми электронами фрагментами белков. Боковые цепи электрон-богатых аминокислот – гидрофобные и в водных условиях заворачиваются внутрь белка, тем самым становятся менее доступными для тирамидов. Гидрофобные условия спиртового раствора в методе «SteamDrop» делают боковые цепи гидрофобных аминокислот более доступными для ковалентного связывания с тирамидами.
3.2 Картирование маркеров ACM082 и API18 с помощью двухцветной флуоресцентной in situ гибридизации (Tyr-FISH)
Ранее было показано нарушение коллинеарности генов семейства аллиназ у двух близкородственных видов A. cepa и A. fistulosum (Киров, 2015). Было выдвинуто предположение, о крупной перецентрической инверсии, возникшей после расхождения этих близкородственных видов от общего предка.
С целью выяснения механизма нарушения коллинеарности и подтверждения или опровержения ранее выдвинутого предположения были взяты дополнительные маркеры (ACM082 и API18) из генетической карты хромосомы 4 A. cepa (Martin et al., 2005; McCallum et al., 2012; Masuzaki et al., 2006).
Двухцветный Tyr-FISH с геном аллиназы луковицы и ACM082 показал, что сигнал гибридизации ACM082 расположен на коротком плече хромосомы 4 у обоих видов (рис. 5B, D), в то время как ген аллиназы луковицы у A. cepa находился на длинном плече, а у A. fistulosum на коротком плече. ACM082 располагался проксимальнее (ближе к центромере) по сравнению с геном аллиназы луковицы у A. fistulosum.
Рисунок 5. Tyr-FISH детекция маркеров, генетически картированных на хромосоме 4. Верхний ряд митотические метафазы A. cepa: (А) двухцветный tyr-FISH с использованием API18 (зеленый) и гена аллииназы луковицы (красный) (В) двухцветный tyr-FISH с ACM082 (зеленый) и геном аллииназы луковицы (красный); нижний ряд – митотические метафазы A. fistulosum (С) двухцветный tyr-FISH с API18 (зеленый) и ген аллииназы луковицы (красный) (D) двухцветный tyr-FISH с ACM082 (зеленый) и геном аллииназы луковицы (красный). Масштабные линейки = 10 мкм.
Двухцветный Tyr-FISH с геном аллиназы луковицы и API18 показал, что API18 у A. cepa локализован на коротком плече в то время, как ген аллиназы луковицы был расположен на длинном плече. У A. fistulosum API18 располагался на коротком плече, как и аллиназа луковицы (рис. 5С, F). Положение API18 на хромосоме было более дистальным по сравнению с ACM082 и более проксимальным по сравнению с геном аллиназы луковицы.
Таким образом, основываясь на результатах Tyr-FISH-детекции генов аллиназы, гена халконсинтазы (Киров, 2015) и маркеров API18 и ACM082 у двух близкородственных видов A. cepa и A. fistulosum, можно определить границы инвертируемого участка хромосомы 4, содержащая эти гены/маркеры (рис. 6). Если предположить, что положение визуализированных генов/маркеров у предкового вида было аналогично положению современного A. cepa, то точка разрыва произошла дистальнее API18 на коротком плече и проксимальнее CHS- B на длинном плече (рис. 6а). Однако могло случиться так, что положение картированных генов/маркеров у предковых видов было сходным с положением современного A. fistulosum. В этом сценарии точка разрыва произошла между API18 и CHS-B на коротком плече и в дистальной / интерстициальной области длинного плеча (рис. 6b).
Рисунок 6. Схема перицентрической инверсии хромосомы 4 у A. cepa и A. fistulosum.
3.3 Tyr-FISH анализ хромосомного положения аллиназы луковицы у видов рода Allium.
Ранее сообщалось, что A. altaicum и A. fistulosum имеют одинаковое положение гена аллиназы луковицы в дистальной части хромосомы 4, в то время как его положение у A. schoenoprasum было на длинном плече как у A. cepa. Основываясь на филогенетическом дереве, предложенном Friesen (2006), мы провели Tyr-FISH визуализацию аллиназы у A. oschaninii и A. pskemense и A. roylei. У A. oschaninii, A. pskemense, A. roylei ген аллииназы луковицы был расположен на коротком плече хромосомы 4, как у A. fistulosum (рис. 7).
Рисунок 7. Tyr-FISH картирование гена аллииназы луковицы у видов Allium: (a) A. pskemense (мечен дигоксигенином, тирамиды-FITC); (b) A.oschaninii (мечен дигоксигенином, тирамиды-FITC); (c) A. roylei (мечен дигоксигенином, тирамиды-FITC); (c) Масштаб линейки = 10 мкм.
Согласно филогенетическому дереву (Friesen et al., 2006), раннее полученным результатам Tyr-FISH картирования (Киров, 2015) и нашим результатам, инверсия хромосомы 4 произошла у предковых видов во время дивергенции и последующего видообразования таксономической клады, включающая A. fistulosum, A. altaicum, A. oschaninii и A. pskemense, у которых ген аллиназы луковицы находился на коротком плече хромосомы 4 и таксономической клады, включающая A. cepa и A. schoenoprasum, у которых ген аллиназы луковицы находился на длинном плече хромосомы 4 (рис. 8).
Рисунок 8. Филогенетическое дерево Allium является верхней частью дерева строгого консенсуса, описанного Friesen (2006). L – расположение гена, кодирующего аллииназу луковицы, в длинном плече хромосомы 4; S – расположение гена, кодирующего аллииназу луковицы в коротком плече хромосомы 4. Стрелкой показан узел, в котором произошла перицентрическая инверсия.
3.4 Интеграция физических и рекомбинационных карт хромосомы 4 A. cepa. Для выравнивания положения визуализированных генов/маркеров в хромосомных и генетических картах мы использовали генетические карты,
построенные Martin et al. (2005) и McCallum et al. (2012) (рис. 9).
Рисунок 9. Интегрирование генетических и цитогенетических карт хромосомы 4 A. cepa. Генетическая карта (левый рисунок) представляет собой группу сцепления, описанную McCallum et al. (2012), а генетическая карта (правый рисунок) представляет собой группу сцепления, описанную Martin et al. (2005). Расстояния между маркерами показаны слева от групп сцепления в сантиМорганах (сМ). Положение картированных маркеров / генов tyr-FISH относительно центромеры на цитогенетической карте (рисунок в середине) рассчитывали, как отношение расстояния между сайтом гибридизации in situ и центромерой к длине плеча хромосомы.
3.5. GISH анализ популяции межвидовых гибридов между A. cepa и A. fistulosum, устойчивых к стемфилиозу
Структура генома линии 1275 (S5 F1), участвующая в беккроссировании. GISH анализ гибридов линии 1275 (S5F1) показал, что в данной линии присутствует 16 хромосом, принадлежащих A. cepa и 16 хромосом, принадлежащих A. fistulosum. По результатам кариотипирования следовало, что растения данной линии являются амфидиплоидами т.е. имеют полный диплоидный набор обоих родителей: 2n = 4х = 32 (16 AC + 16 AF). Рекомбинантных хромосом не обнаружено.
Структура генома беккроссированных гибридов. GISH анализ шести линий – 1278 (S5BC1), 1282 (S4BC1), 1290 (S4BC1), 1501 (S4BC1) и 1502 (S4BC1) показал, что все гибриды этих линий содержали 16 хромосом A. cepa и 16 хромосом A. fistulosum. Рекомбинантных хромосом не обнаружено. Анализ кариотипа показал наличие полных диплоидных наборов обоих родительских видов 2n = 4x = 32 (16C + 16F).
Беккроссированное поколение с отсутствием пары хромосом одного из родителей. GISH анализ растений линии 1283 (S4BC2) и AVON 1284 (S3BC1) показал, что данные гибриды содержит 30 хромосом, 14 из которых принадлежат A. fistulosum и 16 хромосом A. cepa (Рисунок 10а, 10b). Рекомбинантных хромосом не обнаружено. Анализ кариотипов показал наличие полного диплоидного набора A. cepa и 7 гомологичных пар A. fistulosum с отсутствующей 5 парой (16 AC + 14 AF) (Рисунок 10а’, 10b’).
Рисунок 10. GISH на митотических метафазных хромосомах межвидовых гибридов позднего поколения между A. cepa и A. fistulosum: (a) AVON 1283 (S4BC1); (b) AVON 1284 (S3BC1); (a’, b’) кариотипы гибридов AVON 1283 и AVON 1284, соответственно, с отсутствием одной пары гомологичных хромосом 5 A. fistulosum.
Учитывая, что анализируемые гибриды проявили устойчивость к стемфилиозу в биотесте как на естественном фоне заражения в полевых
условиях, так и при искусственном заражении конидиями в теплице, мы можем предположить, что в отсутствующей паре гомологичных хромосом 5 A. fistulosum нет гена устойчивости к стемфилиозу.
Беккроссированное поколение с рекомбинантными хромосомами. GISH- анализ и последующее генотипирование линии 1291 (S4BC1) показали, присутствие полного диплоидного набора A. cepa (8 пар гомологичных хромосом), 7 пар гомологичных хромосом A. fistulosum и одной пары хромосомы 2 A. fistulosum, которая содержала одну рекомбинантную хромосому с центромерной областью, принадлежащей A. fistulosum, и одну нерекомбинантную хромосому (16C + 15F + 1F/C) (Рис. 11, 11а’’). Сайт рекомбинации был расположен на длинном плече хромосомы 2.
GISH-анализ и кариотипирование AVON 1504 (S4BC1) показали, присутствие полного диплоидного набора A. fistulosum, 7 пар гомологичных хромосом A. cepa и одной пары рекомбинантной хромосомы 7 с центромерной областью A. cepa (16F + 14C + 2C / F) (рис. 11, 11b’’).
Сайт рекомбинации расположен в коротком плече хромосомы 7, и относительные положения сайтов рекомбинации на обеих хромосомах были одинаковыми. Эти результаты демонстрируют возможность рекомбинации между хромосомами A. cepa и A. fistulosum.
Рисунок 11. GISH на митотических метафазных хромосомах межвидовых гибридов позднего поколения между A. cepa и A. fistulosum: (a) AVON 1291, (S4BC1); (b) AVON 1504 (S4BC1); (a’), кариотип гибрида AVON1291 с одной рекомбинантной хромосомой 2; (b’) кариотип гибрида AVON1504 с двумя рекомбинантными хромосомами 7; (а’’) рекомбинантная хромосома 2: сверху – объединенные изображения фильтров DAPI и FITC, снизу – изображение фильтра FITC; (b’’) две рекомбинантные хромосомы 7: слева – изображение фильтра FITC, справа – объединение изображений фильтров DAPI и FITC; стрелки указывают на рекомбинантные хромосомы.
Итак, c помощью GISH анализ структуры хромосомного набора коллекции гибридов позднего поколения между A. cepa и A. fistulosum была установлена амфидиплоидная природа гибридов. Так как колхицинирование отсутствовало, можно говорить о спонтанной полиплоидизации, что и привело к образованию амфидиплоидных гибридов. Одним из механизмов полиплоидизации, может
быть, слияние нередуцированных гамет. Однако образование 2n-гамет для A. cepa является крайне редким событием. Альтернативной гипотезой может быть диплоидизация соматических тканей в зародышевом мешке и формирование семян (Родионов, 2013). Однако наличие рекомбинантных хромосом у двух линий (AVON 1291 (S4BC1); AVON 1504 (S4BC1)) свидетельствует о событиях кроссинговера и вероятности завязывания семян после слияния половых клеток.
Оценка фертильности межвидовых гибридов. Фертильность пыльцы межвидовых гибридов между A. cepa и A. fistulosum оценивалась с помощью учета пыльцевых зерен, окрашенных ацетокармином. Фертильность гибридов варьировала от 60 до 95%. Растения из AVON 1291, которые обладали одной рекомбинантной хромосомой 2, показали 93% фертильной пыльцы, указывая на то, что что рекомбинантная хромосома существенно не снижала фертильность.
3.6 Анализ популяции межвидовых гибридов между A. cepa и
A. roylei устойчивых к пероноспорозу
Ранее проведенный анализ популяции S1BC2 межвидовых гибридов между
A. cepa и A. roylei с использованием молекулярного маркера выявил гомозиготное растение по гену устойчивости Pd1 (Алижанова, 2019). Мы провели GISH-анализ этого растения.
Нами было выявлено наличие трех рекомбинантных хромосом. (рис. 12а). Кариотипический анализ показал, что две рекомбинантные хромосомы являются парой гомологичных хромосом 3, несущих фрагменты A. roylei в дистальных областях длинных плеч, где ранее была установлена локализация гена устойчивости к пероноспорозу (рис. 12 б) (Scholten et al., 2007).
Рисунок 12. Геномная in situ гибридизация (GISH) растения S1BC2-8 на митотической метафазе (а) и кариотип (б). Красный сигнал – A. cepa; жёлтый сигнал – A. roylei.
У третьей рекомбинантной хромосомы 4 короткое плечо, включая центромеру, и проксимальную часть длинного плеча, принадлежали A. roylei (рис. 12а, б).
GISH анализ потомства S1BC2-8 после самоопыления позволил отобрать три растения (8-33, 8-53 и 8-59) гомозиготные по Pd1 гену расположенному в фрагментах A. roylei в паре хромосом 3. Все остальные хромосомы у этих трех растений принадлежали A. cepa. (рис. 13). Эти результаты GISH анализа потомства S1BC2-8 указывают на то, что в результате макро- и микроспорогенеза образовались гаметы, не несущие рекомбинантной хромосомы 4. Такие гаметы объединились при самоопылении в зиготу. Благодаря GISH анализу нам удалось отобрать такие генотипы, в которых фрагменты A. roylei были только на паре хромосом 3, т.е. гомозиготы по Pd1 гену, а пара хромосом 4 принадлежали A. cepa.
Рисунок 13. GISH – анализ на митотических метафазных хромосомах генотипов S2BC2 гомозиготных по гену устойчивости к пероноспорозу: (а) 8-33, (б) 8-53, (в) 8-59.
Наши результаты наглядно иллюстрируют эффективность использования GISH в межвидовой селекции. Такой мониторинг интрогрессии генетического материала от дикого сородича в геном культурного растения практически невозможно провести с использованием молекулярных маркеров, так как для этого пришлось бы создавать огромное количество маркеров, плотно покрывающих все хромосомы донора в нашем случае A. roylei.
GISH анализ локализации сайтов рекомбинации на рекомбинантных хромосомах 3 и 4 в популяции S2BC2. GISH анализ выявил восемь генотипов с рекомбинантными хромосомами 3 и 4 (рис. 14). Мы использовали эти уникальные генотипы для анализа расположения сайтов рекомбинации вдоль хромосом 3 и 4 (Таблица 1).
Рисунок 14. GISH – анализ генотипов S2BC2 гомозиготных по гену устойчивости к пероноспорозу: (а) 8-5, (б) 8-20, (в) 8-32, (г) 8-37, (д) 8-38, (е) 8-40, (ж) 8-45, (з) 8-56.
Таблица 1. Положение сайтов рекомбинации между A. cepa и A. roylei в рекомбинантных хромосомах 3 и 4 в генотипах S1BC2и S2BC2.
Позиция сайта рекомбинации, %
Хромосома 3
Хромосома 4
Растение
Гомолог 1
(крупный фрагмент) Среднее значение ±
SD
Гомолог 2
(малый фрагмент) Среднее значение
± SD
Гомолог 1
Среднее значение ± SD
Гомолог 2
Среднее значение ± SD
S1BC2-8 (родительская
форма)
42,8 ± 2,25
22,3 ± 1,73
A. cepa
54,0L ± 1,73
S2BC2
8-5 38.6 ± 1,38 8-20 24,2 ± 1,73
8-32 41,5 ± 1,20
8-33 39,7 ± 1,56
8-37 42,4 ± 1,56
8-38 39,1 ± 1,0
8-40 38,2 ± 2,25 8-45 39,4 ± 1,60 8-53 42,3 ± 1,56
8-56 39,0 ±1,0 8-59 41,8 ± 1,56
20,3 ± 0.69 20,9 ± 1,21 31,2 ± 1,00 22,5 ± 4,02 22,5 ± 0,69
27,0 ± 1,40
24,7 ± 1,56 24,1 ± 1,40 24,1 ± 1,65
24,2 ± 2,0 23,0 ± 1,38
A. cepa A. cepa A. cepa A. cepa A. cepa
54,0L ± 2,00
A. cepa A. cepa A. cepa
A. cepa A. cepa
54,0L ± 1,73 44,5S ± 2,76 54,0L ± 2,00 A. cepa 54,0L ± 1,73 46,2S±2,60 52,4L±2,40 54,0L ± 1,73 54,0L ± 2,00 A. cepa 51,0S ± 2,00 54,6L ± 2,00 A. cepa
Было установлено шесть типов рекомбинантных хромосом 3 и три типа рекомбинантных хромосом 4. (рис. 15). У двух потомков S2BC2 положение сайтов рекомбинации в гомологичной хромосоме 3 с большим фрагментом A. roylei значительно уменьшился по сравнению с таковым в родительском геноме. Положение сайтов рекомбинации в гомологичной хромосоме 3 с небольшим фрагментом также значительно отличалось у двух потомков S2BC2 по сравнению с таковым в родительском геноме, а именно, размер фрагментов A. roylei был больше. Таким образом, GISH – анализ указывает, по крайней мере, на два
события рекомбинации между рекомбинантными хромосомами 3. Также GISH выявил одно событие рекомбинации между рекомбинантной хромосомой 4 и не рекомбинантным гомологом A. cepa (растение 8-38) (рис. 15).
Рисунок 15. Варианты рекомбинантных хромосом 3 и 4 в потомстве S2BC2.
* Положение сайта рекомбинации — это отношение расстояния между дистальным концом плеча хромосомы и сайтом рекомбинации к общей длине плеча (%).
Итак, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является самым мощным инструментом для изучения структуры, реорганизации и эволюции не только отдельных хромосом, но и целых геномов. Стремительный прогресс в области биоинформатических и геномных технологий ставит новые вызовы, требующие совершенствования и оптимизация методов молекулярной цитогенетики. Метод Tyr-FISH способен детектировать короткие последовательности ДНК на физической хромосоме, но из-за низкой воспроизводимости и частоты детекции редко применяется для растительных хромосом. В данной работе были изучены факторы, влияющие на частоту детекции сигнала с помощью Tyr-FISH на растительных хромосомах. Результаты работы показали, что основными факторами, определяющими успех Tyr-FISH являются: 1) создание ДНК-зонда, 2) метод приготовления препаратов хромосом, 3) ингибирование экзогенной пероксидазы (HRP). Детальное изучение этих факторов позволило нам оптимизировать протокол двухцветного Tyr-FISH. Благодаря высокой частоты обнаружения сигналов на физической хромосоме, протокол двухцветного Tyr-FISH, найдет широкое применение в изучении эволюции хромосом растений, создании интегрированных генетических и физических карт, верификации сборки геномов.
С использованием сверхчувствительного метода Tyr-FISH было установлено нарушение коллинеарности генов посредством визуализации генов / маркеров на физических хромосомах у представителей рода Allium. Сравнительное целевое картирование генов семейства аллиназ и маркеров EST на митотических хромосомах A. cepa и A. fistulosum выявило большую перицентрическую инверсию, включающую ген аллиназы луковицы, ген аллиназы корня (ALL1) и ген халконсинтазы (CHS-B), которая произошла после расхождения A. cepa и A. fistulosum от общего предка. Это открытие указывает
на то, что хромосомные перестройки могли играть роль в видообразовании и эволюции геномов рода Allium.
Геномная in situ гибридизация (GISH) является незаменимым методом для мониторинга интрогрессии генетического материала на уровне хромосом, поскольку способен различать родительские геномы в межвидовых гибридах. В данной работе мы использовали GISH в межвидовой селекции лука репчатого (A. cepa L.) устойчивого к ложной мучнистой росе (Peronospora destructor [Berk.] Casp.). С помощью GISH были отобраны гомозиготные линии лука репчатого по гену устойчивости к пероноспорозу (Pd1) и не несущие нежелательный генетический материал от дикорастущего донора устойчивости A. roylei.
Благодаря возможности идентификации родительских геномов, GISH является уникальным инструментом визуализация сайтов рекомбинации на хромосомах у межвидовых гибридов. С помощью GISH мы провели анализ локализации сайтов рекомбинации на рекомбинантых хромосомах межвидовых гибридов между A. cepa и A. roylei. Сравнительный анализ положения сайтов рекомбинаций у родительской формы S1BC2-8 и ее потомства S2BC2 позволил установить, что гомеологичные рекомбинантные хромосомы часто рекомбинируют.
GISH позволяет установить количество копий гомологичных хромосом у полиплоидных гибридов. С использованием GISH анализа популяции межвидовых гибридов между A. cepa и A. fistulosum мы определили, что гибридные формы S5F1, S3BC1, S4BC1, S5BC1 и S4BC2 были амфидиплоидами. Учитывая тот факт, что в селекционном процессе не использовали колхицинирование для удвоения числа хромосом, диплоидизация гибридов произошласпонтанно.Такаяполногеномнаядупликация межвидовыхгибридов известный путь видообразования в природе, например, при формировании геномов видов рода Brassica (Родионов и др. 2019). Мы предполагаем, что полногеномная дупликация скорее всего произошла во время самоопыления гибридов F1 между A. cepa и A. fistulosum. Результаты данных исследований ярко демонстрируют важность GISH сопровождения селекционного процесса при использовании межвидовой гибридизации. Использование GISH позволило бы уже на ранних этапах отобрать только диплоидные формы гибридов между A. cepa и A. fistulosum с целью переноса гена устойчивости к стемфилиозу от A. fistulosum в геном A. cepa.
Были идентифицированы рекомбинантные хромосомы между A. cepa и A. fistulosum. Это многообещающий результат, свидетельствующий о возможности интрогрессии генетичеcкого материала от A. fistulosum в геном A. cepa, т.е. возможности использования A. fistulosum в качестве донора хозяйственно ценных генов для улучшения генофонда лука репчатого (A. cepa).
ВЫВОДЫ
1. Оптимизированный протокол одновременной визуализации двух генов/маркеров с помощью двухцветного Tyr-FISH позволяет успешно картировать на хромосомах короткие последовательности ДНК (1,6Kb) с высокой частотой детекции (49,1%).
2. Установлено, что метод приготовления препаратов «SteamDrop» обеспечивает высокую доступность целевой ДНК хромосом для гибридизации с ДНК-зондом, что связано с доступностью богатых электронами фрагментов белковых остатков для ковалентного связывания с тирамидами, по сравнению с давленным методом приготовления препаратов хромосом.
3. С помощью Tyr-FISH картирования маркеров ACM082, API18 и гена аллиназы луковицы A. cepa (L48614. 1) определены границы крупной перицентрической инверсии, приведшей к нарушению коллинеарности генов хромосомы 4 у представителей рода Allium.
4. Установлена спонтанная полногеномная дупликация в популяции S5F1, S3BC1, S4BC1, S5BC1 и S4BC2 гибридов между A. cepa и A. fistulosum.
5. Установлено, что хромосома 5 A. fistulosum не содержит локус устойчивости к стемфилиозу, так как отсутствие обоих гомологов хромосомы 5 в гибридных линиях 1283 и 1284 не повлияло на их устойчивость к стемфилиозу.
6. Установлено наличие рекомбинантных хромосом между A. cepa и A. fistulosum, что указывает на возможность использования A. fistulosum в качестве донора ценных генов для улучшения генофонда лука репчатого.
7. Показано успешное применение GISH в сопровождении селекционного процесса с использованием межвидовой гибридизации, что позволяет быстро и точно отбирать селекционные формы, несущие в гомозиготе целевой ген без нежелательного генетического материала дикорастущего донора.