Особенности строения и репаративного гистогенеза поперечнополосатой скелетной мышечной ткани у мышей с генетически обусловленным дефицитом дисферлина

Исследование было проведено
на самцах мышей линии Bla/J с мутацией в гене DYSF (n=30) и линии C57Bl/6 (контрольная группа, n=30). Проведение исследований одобрено локальным этическим комитетом Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования “Казанский (Приволжский) федеральный университет” (протокол No14 от 08.02.2019).
С целью подтверждения гомозиготной мутации в гене DYSF перед началом эксперимента было проведено генотипирование 20 мышей линии Bla/J и мышей линии C57Bl/6 в качестве контроля.
Экспериментальная часть работы включала в себя оценку состояния скелетных мышц в постнатальном онтогенезе мышей с дисферлинопатией, а также оценку репаративной регенерации в ответ на острое химическое повреждение. Для изучения особенностей естественного течения заболевания на светооптическом уровне были изучены гистологические срезы икроножных мышц мышей двух линий в возрастах от 1 сут. до 18 мес. (всего 14 мышей каждой линии) постнатального онтогенеза, на электронномикроскопическом уровне – икроножная мышца, медиальная широкая мышца бедра и диафрагма мышей линии Bla/J в возрастах 1 сут., 20 сут., 3 мес. и 12 мес. Для оценки реактивности скелетных мышц в ответ на острое повреждение была выбрана химическая модель. В медиальную головку правой икроножной мышцы всем животным вводили 100 мкл 0,5% раствора новокаина (Renewal®, серия No421115, Россия) через кожный разрез. Кожа рассекалась, миотоксический агент вводился прецизионно инсулиновым шприцом под контролем зрения. Затем кожа ушивалась. Животные находились под комбинированным золетил-медитиновым наркозом. Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 2, 4, 10 и 14 сут. (n=4 из каждой группы для каждого срока, всего 32 животных). После извлечения икроножных мышц проводилась стандартная гистологическая пробоподготовка.
Парафиновые срезы были окрашены гематоксилином и эозином, по Маллори, на срезах были проведены иммуногистохимические реакции с антителами (Ат) к альфа-гладкомышечному актину (α-SMA, разведение 1:50, клон 1A4, DAKO, США), Ki-67 (разведение 1:200, ab16667, Abcam, Великобритания), миогенину (разведение 1:100, клон F5D, DAKO, США), быстрым (разведение 1:500, ) и медленным изоформам тяжелых цепей миозина (разведение 1:2000,
Sigma, США). Контрастирование ядер проводилось гематоксилином. Для предотвращения неспецифического фонового окрашивания при
клон My-32, Sigma, США
клон NOQ7.5.4D,
использовании мышиных первичных антител на срезах мышиной ткани использовался коммерческий набор Animal Research Kit (DAKO, США) с обязательным отрицательным контролем реакций. С целью обнаружения синтеза дисферлина на криосрезах мышц голени была произведена иммунофлуоресцентная реакция Ат к дисферлину (ab124684, 1:200, Abcam, Великобритания), вторичные Ат Alexa Fluor 647 (1:2000, Invitrogen, США). Контрастирование ядер проводилось DAPI.
Для изучения ультраструктуры скелетных мышц образцы икроножной, медиальной широкой мышцы бедра и диафрагмы размерами 1×1×5 мм фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида, разведенном в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) и постфиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия. После дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и ацетонах материал заливали смесью эпоксидных смол Epon (Epon 812, Epon DDSA, Epon MNA, DMP, Fluka Chemie AG, Швейцария). Ультратонкие срезы контрастировали на сетках уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали в электронном микроскопе JEM-100 СХ. Пробоподготовку и электронную микроскопию проводили в лаборатории электронной микроскопии патологоанатомического отделения Национального медицинского исследовательского центра хирургии им. А.В. Вишневского под руководством доктора биологических наук И.А. Чекмаревой.
Окрашенные гистологические срезы фотографировали с помощью светового микроскопа Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия), а также сканировали с помощью сканера предметных стекол Aperio CS2 (Leica Microsystems, Германия). Полученные изображения анализировали с использованием программ Aperio ImageScope (Leica, Германия) и ImageJ (NIH, США). Морфометрия производилась по 10 микрофотографиям со срезов икроножных мышц. При морфометрии оценивали следующие показатели:
1. Cредняя площадь поперечного сечения МВ;
2. Доля центральноядерных МВ;
3. Доля некротизированных МВ;
4. Соотношение МВ, синтезирующих тяжелые цепи быстрых и медленных миозинов;
5. Поздняя миогенная дифференцировка;
6. Индекс пролиферации (ИП): 1) отношение Ki-67 позитивных ядер в мышечных клетках к общему числу ядер в мышечных клетках; 2) отношение Ki-67 позитивных ядер в эндотелиоцитах к общему числу ядер в эндотелиоцитах; 3) отношение Ki-67 позитивных ядер в СТ к общему числу ядер в СТ;
7. Сосудистая плотность; 8. Доля фиброза.
Результаты морфометрического анализа выражали в виде медианы (1-й квартиль; 3-й квартиль). Статистическую достоверность различий средних величин двух линий экспериментальных животных оценивали в программе Statistica 13.3 критерием Краскела-Уоллиса для нескольких независимых выборок cо значением p<0,05 в качестве уровня значимости. Результаты исследования и их обсуждение Структура и ультраструктура поперечнополосатой скелетной мышечной ткани мышей линии Bla/J в разные периоды онтогенеза. В икроножной мышце мыши линии Bla/J на ультраструктурном уровне были выявлены признаки повреждения клеток миогенного дифферона: нарушение целостности сарколеммы, мозаичные просветления матрикса митохондрий, выраженная вакуолизация саркоплазмы, высокая складчатость ядер, расширение цистерн гранулярной ЭПС. В скелетной мышечной ткани были обнаружены капилляры с патоморфологическими изменениями: истончением базальной мембраны, вакуолизацией эндотелиоцитов и глыбчатостью цитоплазмы в них. Не исключено, что эти проявления связаны с нарушением синтеза дисферлина и в эндотелиоцитах. При исследовании ультраструктуры скелетных мышц в условиях отсутствия дисферлина через 20 сут. после рождения были обнаружены патологические изменения различных компартментов мышечных волокон: набухание плазматической мембраны, инвагинации и фрагментарное нарушение целостности сарколеммы, изменения в организации сократительного аппарата МВ (расширение промежутков между истонченными миофибриллами, дезорганизация Z-линий, множественная вакуолизация СПР). Кроме того, было обнаружено субсарколеммное скопление полиморфных митохондрий, увеличение одних митохондрий наряду с деструктивными изменениями других, выявлено уплотнение крист. Степень дегенерации МВ в скелетных мышцах мыши линии Bla/J 3 мес. жизни усиливалась: в некоторых волокнах наблюдался выраженный отек саркоплазмы с дезорганизацией миофибрилл в виде их истончения, аномалий Z-линий, разрывами миофибрилл на пучки и отеком межпучковых пространств, деформированные и полиморфные митохондрии сливались в единую биоэнергетическую цепь. При изучении ультраструктуры мыши линии Bla/J в возрасте 12 мес. были обнаружены многочисленные некротизированные МВ со следующими признаками дегенерации: миолиз с множественной вакуолизацией саркоплазмы, отсутствие границ исчерченности, отек саркоплазмы, разрывы и фрагментация пучков миофибрилл, полиморфизм митохондрий. В местах разрывов сарколеммы наблюдается скопление малых везикул, предположительно, сформированных «патчей». В мышцах изучаемой возрастной группы выявлены скопления коллагеновых волокон, что на светооптическом уровне соответствует фиброзу мышечной ткани. В этот период изменения как на светооптическом, так и на электронномикроскопическом уровнях были наиболее выраженными по сравнению с другими (более ранними) изучаемыми возрастами. Результаты морфометрического исследования поперечнополосатой скелетной мышечной ткани в период молочного кормления мышей линий Bla/J и C57Bl/6. В обеих линиях данной возрастной группы на светооптическом уровне отсутствовали некротизированные МВ (в отличие от ультраструктурного уровня) и ЦЯМВ. Площадь поперечного сечения МВ возрастала с 1 сут. жизни, однако она была выше у мыши линии Bla/J (57,56 (43,84;73,56) мкм2) в два раза по сравнению с животным дикого типа (28,59 (20,19;37,38) мкм2, p<0,01). К 20 сут. показатель был примерно одинаковым у мышей обеих линий (185,15 (139,81;245,23) мкм2 у Bla/J и 205,52 (155,80;256,80) мкм2, у C57Bl/6, p=0,061. Показатель сосудистой плотности на 1 сут. жизни оказался выше у C57Bl/6. К 20 сут. у мышей дикого типа показатель снижался, а у линии с дефицитом дисферлина, наоборот, возрастал и достоверно отличался (40,00 (27,13;44,99)% у линии мышей Bla/J и 16,44 (14,81;18,14)% у линии мышей C57Bl/6, p=0,0029). Результаты морфометрического исследования поперечнополосатой скелетной мышечной ткани в период полового созревания мышей линий Bla/J и C57Bl/6. В этом периоде были изучены мышцы мышей 1 и 2 мес. жизни. На первом мес. в икроножных мышцах обеих линий животных были выявлены единичные некротизированные МВ – 1,06 (0;2,31)% у C57Bl/6 и 0 (0;1,03)% у Bla/J, p=0,55, но уже в 2 мес. показатель значительно повысился у мышей с мутацией в гене DYSF и составил 7,31 (6,82;11,90)%, у дикого типа он был равен 0 (0;1,32)%, p=0,067. При ультраструктурном исследовании гибнущие МВ в мышцах линейных мышей были выявлены на более ранних сроках. ИП мышечных клеток в икроножной мышце мыши дикого типа был ниже в 1 мес. по сравнению с дисферлиндефицитной линией и составил 0 (0;0,49)%, у Bla/J – 0 (0;0,77)%, p=0,86. У мышей линии Bla/J доля ЦЯМВ повышалась с 0 (0;0,8)% в 1 мес. до 2,22 (0;2,4)% в 2 мес., p=0,1. Вероятно, есть обратная зависимость между долей некротизированных и центральноядерных МВ. Другой показатель, который значительно возрос у сарколеммы, потеря поперечной линейных животных к 2 мес. – это средняя площадь поперечного сечения МВ, которая увеличивалась с 282,29 (208,15;379,95) мкм2 в 1 мес. до 768,63 (425,9;1158,72) мкм2 в 2 мес., p<0,01. Аналогичная динамика прослеживалась у мышей с мутацией в гене DYSF и в соотношении быстрых и медленных МВ; доля медленных МВ возрастала с 0 (0;0,48)% в 1 мес. до 5,09 (0;11,34)% в 2 мес., p=0,043, в то время как у мышей дикого типа показатель был равен 0 (0;0)%. Появление медленных МВ у мышей линии Bla/J может быть результатом реактивности скелетных мышц в ответ на повреждение. Показатели поздней миогенной дифференцировки и сосудистой плотности в описываемой возрастной группе были выше у мышей линии C57Bl/6. Более низкая по сравнению с контролем сосудистая плотность может свидетельствовать о сниженной васкуляризации скелетных мышц у мышей, мутантных по гену DYSF, и подтверждает участие дисферлина в ангиогенезе. Снижение васкуляризации, возможно, усугубляет течение дисферлинопатии, так как развивающаяся ишемия скелетных мышц способствует усилению альтерации МВ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что 2-й мес. жизни для мышей линии Bla/J является манифестирующим по основному заболеванию. На светооптическом уровне появляются патоморфологические признаки, характерные для миодистрофического процесса: гибель (некроз МВ) и регенерация (центральноядерные МВ) скелетных мышц, гипертрофия МВ. Результаты морфометрического исследования поперечнополосатой скелетной мышечной ткани в репродуктивный период мышей линий Bla/J и C57Bl/6. На всех изучаемых сроках доля некротизированных МВ была достоверно выше у мышей линии Bla/J и составляла 9,38 (4,39;14,2)%, 7,31 (6,67;8,51)% и 6,25 (3,69;4,96)% в 3, 5 и 9 мес. соответственно. Показатель у мышей дикого типа был минимальным вплоть до 9 мес. (0 (0;0,5)%) (Рисунок 1). ИП мышечных ядер в обеих линиях до 5 мес. не превышал 1,58 (1,45;3,96)% (у мыши C57Bl/6 в 3 мес.). С 3 по 5 мес. показатель снижался, а к 7 мес. повысился у обеих линий животных и оставался выше у мышей дикого типа: 3,93 (1,84;5,31)% в 7 мес. и 1,72 (0;4,17)% в 9 мес. У дисферлиндефицитных мышей значения составили 0,98 (0;1,26)% (p=0,049) и 3,89 (1,71;5,50)% (p=0,23) в 7 и 9 мес., соответственно. Доля ЦЯМВ была выше у животных с дефицитом дисферлина на всех изучаемых сроках, где постепенный рост показателя наблюдался с 1 мес. (0 (0;0,88)%) до 5 мес. (17,78 (17,3;19,15)%, p=0,007). В 7 мес. показатель снизился до 6,56 (2,85;7,67)%, а в 9 мес. снова вырос и составил 18,94 (18,22;19,84)%, p=0,007. Полученный результат свидетельствует об активном репаративном процессе в МВ. Рисунок 1 – Количество некротизированных мышечных волокон в икроножной мышце в динамике постнатального онтогенеза мышей линий C57Bl/6 и Bla/J, *p<0,05. Похожей динамикой характеризуется показатель средней площади поперечного сечения МВ, который возрастал у мышей линии Bla/J до 7 мес. и на всех сроках оставался выше по сравнению с мышами дикого типа. К 9 мес. показатель снизился и составил 621,89 (392,03;935,36) мкм2 у мыши Bla/J, а у C57Bl/6, наоборот, повысился к 9 мес. – 1163,55 (895,22;1442,25) мкм2, p<0,001. Полученные данные подтверждают компенсаторную гипертрофию МВ на фоне постоянной гибели мышечных волокон в условиях отсутствия дисферлина. В изменении доли миогенин-позитивных ядер выявлена общая тенденция у мышей обеих линий: после спада в 2 мес. показатель возрастал от 3 к 5 мес., а затем снижался и в 7 мес. был равен 0,68 (0%;0,86)% у мыши с отсутствием дисферлина и 0,32 (0;0,9)% у мыши дикого типа, p=0,96. К 9 мес. доля миогенин-позитивных ядер снова возросла до 1,53 (0,9;1,6)% у дисферлиндефицитной мыши и 1,02 (0;1,7)% у мыши линии C57Bl/6, p=0,47. Можно предположить, что до этого времени пул миосателлитоцитов, способных к миогенной дифференцировке, не теряет свою функциональную способность в условиях отсутствия дисферлина, однако и не компенсирует собой гибель МВ, которая на протяжении всего онтогенеза остается выше у мышей линии Bla/J. В образцах скелетных мышц голени мышей 7 месячного возраста у представителей линии Bla/J наблюдался более низкий уровень ИП эндотелиальных клеток и клеток стромы, а также снижение сосудистой плотности. Вероятно, это свидетельствует об уменьшении активности ангиогенеза в отсутствие дисферлина. Результаты морфометрического исследования поперечнополосатой скелетной мышечной ткани в период выраженных старческих изменений мышей линий Bla/J и C57Bl/6. Было установлено, что доля некротизированных МВ возрастала с 9 до 18 мес. у мышей обеих линий, что позволяет говорить о снижении регенераторного потенциала скелетных мышц в течение постнатального онтогенеза. В 18 мес. показатель составил 3,33 (0;6,01)% у линии C57Bl/6 и 14,44 (11,96;18,07)% у мышей линии Bla/J, p<0,001, что делает очевидным вклад дисферлина в восстановление целостности сарколеммы. На фоне роста показателя некроза МВ наблюдалось и повышение доли ЦЯМВ, показатель которой также оказался выше в группе с отсутствием дисферлина (22,72 (20,37;27,21%) в 18 мес., тогда как у C57Bl/6 на этом сроке показатель составил 6,04 (3,84;13,02)%, p=0,001 и был максимальным для мышей этой линии на всех изучаемых сроках. Следовательно, существует обратная корреляция между уровнем некротизированных МВ и ЦЯМВ, что логично, т.к. повышение доли ЦЯМВ свидетельствует о репаративных процессах в скелетных мышцах на фоне их гибели. Показатель средней площади поперечного сечения МВ возрастал и был достоверно выше у мышей линии Bla/J до 5 мес., после чего у обеих линий продолжал снижаться до 18 мес. При этом начиная с 9 мес. показатель в контрольной группе все время оставался выше. Так, если показатель достиг своего максимума у линии Bla/J к 5 мес. и был равен 1075,73 (675,58;1725,62) мкм2, то к 15 мес. он составил 465,96 (274,51;695,44) мкм2, p<0,05. Из этого следует, что у мышей с дисферлинопатией вплоть до 9 мес. наблюдается компенсаторная гипертрофия МВ, которая в последующем сменяется атрофией ввиду истощения камбиального резерва скелетных мышц. Доля миогенин-позитивных ядер в изучаемой возрастной группе отличалась у мышей двух линий и на всех изучаемых сроках оставалась выше у мышей линии C57Bl/6. У мышей линии Bla/J показатель снижался с 1,75 (1,17;2,10)% в 12 мес. до 0,97 (0,65;1,32)% в 18 мес., что может свидетельствовать о снижении миогенного потенциала в условиях дефицита дисферлина. Похожие изменения выявлены и в динамике сосудистой плотности, где показатель у дисферлиндефицитных мышей оказался ниже в описываемой возрастной группе. По результатам сравнительного патоморфологического анализа скелетных мышц в постнатальном онтогенезе у мышей двух линий было выявлено снижение репаративных свойств скелетной мышечной ткани (более высокая доля некротизированных МВ, компенсаторная гипертрофия МВ с последующей их атрофией, снижение пролиферативной активности и уровня миогенной дифференцировки), однако процессы дегенерации у мышей с дисферлинопатией были отмечены с первых суток жизни и прогрессировали в течение жизни, в то время как у мышей контрольной линии гибель отдельных МВ и появление ЦЯМВ наблюдалось лишь на поздних сроках онтогенеза. Это подтверждает, что дисферлин выполняет ключевую функцию в репарации поврежденных МВ. Обнаружено, что скелетные мышцы в условиях отсутствия дисферлина претерпевают постоянные процессы дегенерации и регенерации МВ, постепенно снижая свои компенсаторные возможности к 9 мес. Было выявлено статистически достоверное различие в доле некротизированных МВ у мышей линии Bla/J с 3 мес. жизни с постепенным ростом показателя до 18 мес. Особенности репаративного рабдомиогенеза у мышей линий Bla/J и C57Bl/6 Химическое повреждение и воспаление мышечного регенерата. Доля некротизированных МВ – один из важнейших показателей динамики восстановления скелетной мышечной ткани после травмы. Показатель у обеих групп животных был максимальным на 2 сут. (35,13 (29,41;42,86)% у мышей линии Bla/J и 25,81 (17,85;37,42)% у линии C57Bl/6, p<0,05). У контрольной группы значения постепенно снижались к 14 сут. (2,51 (1,46;3,13)%. Показатель в экспериментальной группе снижался от 2 к 10 сут., а к 14 сут. возрос до 7,36 (5,35;9,85)%). Такая динамика показателя может быть связана со второй волной гибели МВ в результате воспалительного процесса. При мутациях в гене DYSF наблюдается сниженная секреция МВ цитокинов и хемокинов, что, в свою очередь, замедляет рекрутинг лейкоцитов и приводит к более позднему воспалительному ответу (Chiu et al., 2009; de Morree et al., 2013). Предполагается, что у макрофагов в отсутствие синтеза дисферлина нарушен процесс переключения с провоспалительных на противовоспалительные, что приводит к длительному воспалительному ответу и отсутствию реституции скелетных мышц (Baek et al., 2017). Снижение эффективности фагоцитоза при дефиците дисферлина также приводит к персистированию некротизированных МВ и увеличение их числа у мышей линии Bla/J (Chiu et al., 2009). В мышечном регенерате мышей линии Bla/J после введения новокаина была выявлена более выраженная лейкоцитарная инфильтрация по сравнению с мышами дикого типа (Рисунок 2). Рисунок 2 – Срезы икроножной мышцы мышей линии Bla/J (А) и C57Bl/6 (Б), 4 сут. после повреждения новокаином. Лейкоцитарная инфильтрация в месте инъекции (*). Синтез дисферлина в сарколемме мышей контрольной группы (стрелки). Иммунофлуоресцентная реакция с Ат к дисферлину. Докраска ядер: DAPI. Ув.: ×400. Пролиферация и дифференцировка структур мышечного регенерата. Пролиферативные процессы после повреждения характерны не только для МВ, но и для других элементов в составе скелетной мышцы, в частности, сосудов и стромы, поэтому в ходе исследования целесообразно было оценить и их репаративную способность. Ki-67 экспрессируется во всех стадиях клеточного цикла. При анализе ИП мышечных клеток было выявлено, что доля Ki-67-позитивных ядер в МВ снижалась в обеих изучаемых группах в интервале от 2 до 14 сут., однако на всех сроках, кроме 10 сут., этот показатель оказался выше у мышей линии C57Bl/6, что указывает на сниженную пролиферативную активность при отсутствии дисферлина. К 14 сут. показатель в обеих группах не превышал 1%, таким образом, пролиферация мышечных клеток у мышей обеих линий была завершена к концу 2 недели после повреждения. Важно отметить, что динамика снижения ИП отличалась у мышей разных линий: у мышей линии Bla/J показатель быстрее снижался в интервале между 2 и 4 сут. (примерно на 8-9%, в контрольной группе – на 3- 4%), а у мышей линии C57Bl/6 наиболее активное снижение показателя пришлось на 4 и 10 сут. (приблизительно на 14%, у Bla/J – на 0-2%). Полученный результат свидетельствует о менее интенсивном и более * позднем завершении пролиферации у мышей линии Bla/J. Вероятно, это может быть связано с истощенным пулом миосателлитоцитов, которые постоянно активируются при естественном течении миодистрофии (Politi et al., 2006). Пролиферация ядер в эндотелиоцитах, в отличие от показателей пролиферации в строме и мышечных клетках, не сопровождалась постепенным снижением синтеза Ki-67 ни в контрольной, ни в экспериментальной группах. Однако значения были ниже у мышей линии Bla/J с 4 по 14 сут., что вновь подтверждает предположение о снижении пролиферативной активности в отсутствие дисферлина, в том числе и в сосудистом компоненте скелетных мышц. Если у животных контрольной группы рост показателя со 2 к 4 сут. возрастал с 10,72 (0;21,58)% до 28,23 (20,91;35,84)%, то в экспериментальной группе – лишь с 13,33 (11,76;26,79)% до 15,38 (11,11;22,22)%, p<0,05. Следовательно, камбиального резерва для пролиферации эндотелиоцитов у дефицитных по дисферлину мышей недостаточно. Это может быть связано с отсутствием дисферлина в эндотелиоцитах, где доказано его участие в ангиогенезе (Sharma et al., 2010). Доля миогенин-позитивных клеток у мышей линии C57Bl/6 была выше на всех сроках наблюдения. Тенденция к снижению показателя у мышей линии Bla/J свидетельствует о нарушенной миогенной дифференцировке в отсутствии дисферлина. Наблюдалась обратная корреляция между числом миогенин-позитивных ядер и долей некротизированных МВ в поврежденных мышцах у мутантных животных. Из этого можно заключить, что миогенная дифференцировка в отсутствии дисферлина активируется, но остается незавершенной. Также нельзя исключить, что у мышей линии Bla/J регенеративный потенциал может быть снижен вследствие того, что в их онтогенезе и так непрерывно происходит репарация поврежденных МВ. Интернализация ядер в клетках миогенного дифферона отражает процессы внутриклеточной регенерации МВ, при этом ядра МВ с периферии волокна смещаются к центру. Кроме того, центральное расположение ядер наблюдается во вновь формирующихся МВ (Roman et al., 2018). Так как данная локализация ядер снижает сократительную способность МВ, после слияния миобластов ядра мигрируют на периферию (Cadot et al., 2012). Поэтому при подсчете доли ЦЯМВ учитывались не только регенерирующие МВ, но также мышечные трубочки. Показатель доли ЦЯМВ был минимальным для обеих линий мышей на 2 сут., у мышей линии Bla/J оставался ниже по сравнению с контрольной группой до 10 сут. включительно, что свидетельствует о более позднем начале и меньшей интенсивности репаративных процессов в условиях отсутствия дисферлина. К 14 сут. у мышей дикого типа репаративная регенерация завершилась, в то время как для мутантных животных в данной точке наблюдалось максимальное значение показателя: (48,98 (33,33;54,32)% у мышей линии Bla/J и 46,15 (34,30;58,46)% у мышей линии C57Bl/6, p=0,45). Меньшая доля ЦЯМВ у мышей линии Bla/J в ответ на повреждение может быть связана со снижением числа миобластов как результат истощения пула миосателлитоцитов и нарушением слияния миобластов. Другим показателем, отражающим состояние МВ, является средняя площадь поперечного сечения МВ. Этот параметр на всех сроках был выше у мышей Bla/J, что можно трактовать как компенсаторную гипертрофию сохранивших жизнеспособность МВ на фоне их постоянной гибели. У мышей контрольной линии изучаемый показатель снижался к 4 сут. и составил 255,56 (165,39;650,67) мкм2, что связано с появлением большего по сравнению с экспериментальной группой количества миотуб. У мышей линии Bla/J содержание медленных мышечных волокон было выше на всех изучаемых сроках. По-видимому, это связано с преимущественной гибелью волокон, экспрессирующих быстрые изоформы тяжелых цепей миозина, за которой следует образование медленных МВ, более устойчивых к повреждению в условиях дефицита дисферлина. Ранее было описано уменьшение количества быстрых МВ у мышей SJL с мутацией в гене DYSF (Kobayashi et al., 2012), а также преимущественная потеря быстрых мышечных волокон у пациентов с дисферлинопатиями (Grounds et al., 2014). Вероятно, большая сохранность медленных МВ связана с наличием в них большего числа митохондрий, которые выступают буфером для ионов кальция (Santo-Domingo et al., 2010). Наличие липидных капель в этих волокнах у пациентов с дисферлинопатиями (Grounds et al., 2014) может быть результатом нарушения метаболизма жирных кислот в митохондриях. Ремоделирование и функциональная адаптация мышечного регенерата. Завершающий этап в восстановлении морфофунциональной способности поврежденной ткани, который находит отражение в фиброзировании и васкуляризации. Сосудистая плотность повышалась со 2 сут. после введения новокаина в обеих группах и достигла своего максимума к 14 сут. (22,22 (18,42;26,09)%) в контрольной группе и 19,61 (15,64;24,00)% в экспериментальной группе, p<0,05). Отставание показателей у последних, вероятно, связано со сниженной экспрессией дисферлина в эндотелиоцитах. Различия в доле соединительной ткани (СТ) хоть и были статистически достоверны во всех изучаемых сроках, однако едва превышали 0,05% у мышей Bla/J (максимум 0,06 (0,01;0,12)% на 10 сут.). Таким образом, внутримышечное введение новокаина не оказывает фиброзирующего влияния на скелетные мышцы изучаемых линий мышей в первые 14 сут. после инъекции. Результаты описанной работы показывают, что репаративный гистогенез в условиях отсутствия дисферлина проходит те же стадии, что и в нормальной скелетной мышечной ткани, однако с некоторыми отличиями: альтерация протекает интенсивнее с большей долей некроза, процессы восстановления замедлены, пролиферативная активность снижена, дифференцировка отсроченная. Эти процессы обусловлены еще и тем, что естественное течение мышечной дистрофии создает неблагоприятные условия для восстановления скелетных мышц после острого повреждения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В представленной диссертационной работе впервые проведена комплексная и количественная оценка основных показателей состояния скелетных мышц у мышей с мутацией в гене DYSF на протяжении постнатального гистогенеза. Было выявлено, что первые деструктивные изменения в ППСМТ на электронномикроскопическом уровне появляются с первых суток жизни, а на светооптическом – со второго месяца. Установлено, что в условиях напряженно протекающей физиологической и репаративной регенерации ППСМТ у мышей линии Bla/J химическое повреждение скелетной мышцы приводит к снижению пролиферации эндотелиоцитов, снижению пролиферации клеток стромы и увеличению степени фиброза в месте повреждения по сравнению с мышами дикого типа. Из вышесказанного следует, что отсутствие дисферлина в реактивно измененных скелетных мышцах замедляет не только скорость репаративной регенерации МВ, но и компонентов стромального и сосудистого дифферонов. Таким образом, белок дисферлин вносит существенный вклад в постоянно протекающие процессы постнатального гистогенеза и регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани. В отсутствии продукта экспрессии гена снижается не только репаративная способность сарколеммы, но и сосудистая плотность. Последнее, в свою очередь, способствует ишемии скелетных мышц и усугублению ведущего патофизиологического процесса, развивающегося на тканевом и органном уровнях. Полученные данные можно использовать в дальнейшем для создания и развития этиотропной или патогенетической терапии. Выводы 1. Постнатальный гистогенез поперечнополосатой скелетной мышечной ткани в условиях генетически обусловленного дефицита дисферлина характеризуется более высокой долей некротизированных мышечных волокон – 14,49 (11,96;18,1)%, p<0,05, в 18 мес., компенсаторной гипертрофией мышечных волокон с последующей их атрофией, снижением пролиферативной активности и уровня миогенной дифференцировки миогенных клеток-предшественниц – 0,97 (0,66;1,32)% в 18 мес. по сравнению с мышами дикого типа. 2. Строение мышцы (как органа) у животных с мутацией в гене дисферлина характеризуется понижением васкуляризации, начиная с 5 мес. по сравнению с мышами дикого типа (40,91 (29,41;51,0)% у мышей линии Bla/J и 56,05 (42,34;67,89)% у мышей линии C57Bl/6, p <0,05). Доля стромального компонента с возрастом повышается у мышей линии Bla/J. 3. Выявлено, что в мышцах животных с мутацией в гене DYSF происходят те же процессы, что и у мышей контрольной группы, однако альтерация у первых выражена значительнее, что проявляется большей долей некротизированных мышечных волокон (35,13 (29,41;42,86)% у мышей линии Bla/J и 25,81 (17,85;37,42)% у C57Bl/6) на 2 сут. после повреждения, p<0,05), а пролиферация и миогенная дифференцировка происходят с меньшей интенсивностью по сравнению с контрольной группой: процент миогенин-позитивных ядер составил 3,2 (0,06; 6,9)% на 4 сут. после повреждения у мышей линии Bla/J и 6,3 (1,3;15,3)% у мышей линии C57Bl/6, p=0,046. 4. В условиях напряженно протекающей физиологической и репаративной регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани обширный химический некроз мышцы приводит к снижению пролиферации эндотелиоцитов (8,33 (0;16,44)% у мышей линии Bla/J и 21,18 (14,29;26,79)% в контрольной группе, p<0,05, на 14 сут. после повреждения), снижению пролиферации клеток стромы (0 (0;2,43)% у мышей линии Bla/J и 10,56 (1,93;26,32)% у мышей C57Bl/6, p<0,05, 4 сут. после повреждения) и увеличению фиброза в месте повреждения. 5. Модель химического повреждения мышц мышей линии Bla/J в возрасте 5 мес. с последующим морфометрическим анализом показателей альтерации, пролиферации, миогенной дифференцировки, васкуляризации и степени фиброза является достоверной для оценки действия кандидатов для терапии дисферлинопатий, поскольку учитывает изменения не только миогенного, но и других дифферонов в составе поперечнополосатой скелетной мышечной ткани, а также позволяет провести количественную оценку изменений. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Рекомендовать внедрение в лабораторную практику предложенную модель химического повреждения скелетных мышц линейных мышей с последующим морфометрическим и статистическим анализом показателей альтерации, пролиферации, миогенной дифференцировки, васкуляризации и степени фиброза для оценки действия препаратов, направленных на этиотропную и патогенетическую терапию дисферлинопатий.