Поиск новых свойств эндофитных бактерий Bacillus subtilis Cohn.

Объектом исследования служили штаммы бактерий из коллекции ИБГ УФИЦ РАН: B. subtilis 26Д (ВНИИСХМ 128), B. thuringiensis ssp. thuringiensis (ВКПМ B-5689), B. thuringiensis ssp. kurstaki (ВКПМ B-6066), B. thuringiensis ssp. kurstaki (ВКПМ B-5351) и другие. Выделение изолятов из растительных тканей проводили по методу, описанному Благовой (2014). Культуры бактерий выращивали на твердых агаризованных средах LB (Bertani, 1951), или картофельно-глюкозном агаре (Himedia, Россия), или полусинтетической среде (Недорезков, 2002). В качестве жидкой питательной среды использовали указанные выше среды, исключая агарозу. Окрашивание по Граму осуществляли по классической методике. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства оценивали по определителю Берджи (1997). Оценку эндофитности проводили с использованием стерильных микрорастений картофеля. Для оценки распространения колонии бактерий скольжением по агаризованной поверхности использовали методику, описанную в работе (Bridier, 2011). Антагонистическую активность бактерий по отношению к фитопатогенам оценивали методом двойной культуры (Whipps, 1987). Оценку наличия вирусной инфекции в растениях картофеля проводили с использованием набора для иммунохроматографии (ФИЦ Биотехнологии, Россия). Способность бактерий к деструкции феруловой кислоты анализировали по методу, предложенному (Degrassi, 1995). Бактериальную активность РНКаз на твердой питательной среде оценивали по формированию зоны гало вокруг бактериальной колонии на среде с дрожжевой РНК (Hole, 2004), в жидкой культуре – по методу, описанному Маргулис (2012). Выделение высокомолекулярной бактериальной ДНК проводили по Graham (1978) с модификациями. Выделение плазмидной ДНК, подготовку компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Sambrook с соавт. (1989). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК (Синтол, Россия). В экспериментах по клонированию генов применялись штаммы компетентных клеток E. coli – NEB10. Для получения экспрессионных конструкций использовалась плазмида широкого круга хозяев pDG1662. Родовую принадлежность изолятов идентифицировали с использованием специфичных праймеров Видовую принадлежность определяли секвенированием 16s рРНК. Статистическую обработку проводили с использованием программ Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение эндофитных бактерий из растений разных видов, оценка влияния механических повреждений и межмикробных взаимоотношений
эндофитных бактерий в растительных тканях
Всего было выделено 266 бактериальных изолятов, после оценки которых RAPD-анализом было отобрано 110 штаммов (табл. 1). Затем, используя стерильные микрорастения картофеля и инокулируя их без механических повреждений клетками бактерий, анализируя через 14 дней визуально здоровые растения было установлено, что 90% штаммов являются эндофитными, т.е. способны проникать в растительные ткани без их поранения и не вызывать симптомы болезни. Некоторые из таких новых эндофитных штаммов использовали в дальнейших исследованиях.
Таблица 1 – Количество выделенных изолятов, отличавшихся по RAPD- анализу
Растение
Петрушка Укроп Морковь Огурец Редис Салат Капуста Яблоня Слива Пшеница Всего
Всего взято в анализ
76
6
7
24
33
Количество различающихся изолятов
Абсолютное значение 4
26
8
7
2
110
Доля, % 14,8 35,5 70,2 66,7 22,8 57,4 36,8 37,5 100,0 57,5 41,3
Чаще всего из растительных тканей выделялись представители рода Bacillus. Псевдомонады изолировались с меньшей частотой в сравнении с бациллами. Выделены и идентифицированы также редко встречающиеся виды Pantoea sp., Variovorax sp. Microbacterium testaceum.
Чаще всего из листьев выделялись эндофиты растений яровой пшеницы (частота выделения из образцов – 77%) и капусты (60%). Из листьев укропа и петрушки, а также редиса, салата, огурца, эндофиты выделялись реже (средняя частота выделения 18%). Эндофиты были выделены лишь из 2 образцов плодов огурца или сливы, из тканей чистотела не удалось выделить бактерии (табл. 2).
Таблица 2 – Частота выделения эндофитов из тканей различных видов растений
Яблоко (плоды) 40 24 60 Огурец (плоды) 20 2 10 Слива (плоды) 22 2 9 Чистотел 12 0 0 (черешок листа)
Известно, что огурец, слива и чистотел при поранении тканей выделяют экссудат, закупоривающий раны. Полученные данные подтверждают наше предположение о том, что в тканях растений, выделяющих такие вещества, должно встречаться меньше эндофитов в сравнении с другими видами растений.
Наибольшим разнообразием штаммов характеризовались эндофиты, выделенные из растений сливы, моркови, огурца и салата. Разнообразие штаммов в тканях огурца, сливы и салата можно объяснить особенностью этих растений закупоривать образующиеся раны, что способствует минимальной вероятности проникновения бактерий в ткани, меньшему количеству выделяемых изолятов, что повышает вероятность встретить разные штаммы и/или виды бактерий среди числа эндофитов. Высокое разнообразие штаммов из корнеплодов моркови объясняется, вероятно, высокой вероятностью повреждения тканей в почве и, таким образом, большей вероятностью попутного проникновения «не эндофитных» бактерий.
Для оценки влияния механических повреждений на проникновение бактерий в растительные ткани было поставлено несколько опытов. В одном из экспериментов редис выращивали в открытом и закрытом (в лабораторных условиях) грунтах на одинаковом образце почвы. Установлено, что в листьях редиса, выращенного в открытом грунте, количество эндофитов в 1 г ткани было в 24 раза больше, чем в листьях редиса, растущего в лабораторных условиях. Этот факт мы связываем с повреждением растительных тканей насекомыми и проникновением различных микроорганизмов в местах поранений. В другом эксперименте анализировали плотность популяции бактерий в тканях молодых и стареющих листьев укропа. Было выявлено, что в молодых растениях КОЕ бактерий в 75 раз меньше, чем в зрелых.
Возможность проникновения бактерий в растения через раны и движения по сосудам оценивали в эксперименте со срезанными листьями петрушки примерно одинакового возраста и размера. В стаканы с нестерильной водопроводной водой помещали отрезки листьев петрушки (табл. 3). Через 24 ч удаляли часть черешка листа, которая находилась в воде, далее черешок делили на три части, из которых выделяли бактерии. Показано четкое распределение
Плоды
Всего образцов, ед.
Выделено изолятов эндофитов, ед.
Частота выделения, %

популяции клеток по длине черешка – наибольшая плотность наблюдалась в нижнее части и наименьшая в верхней.
Таблица 3 – Плотность популяции бактерий в черешках срезанных листьях петрушки (КОЕ/г)
Часть черешка листа Верхняя
Средняя
Нижняя
КОЕ бактерий, кл. /г 30±2
340±30 6000±520
В научной литературе имеются сообщения о том, что совместная инокуляция растений определенным видом или штаммом бактерий может облегчать проникновение другого вида или штамма бактерий в растительные ткани. Например, Wells и Butterfield (2011) приводят результаты эксперимента, в котором нанесение на ткани моркови, картофеля или перца бактерий Pseudomonas viridiflava совместно с бактериями Salmonella typhimurium или бактерий Erwinia carotovora с S. typhimurium приводило к трехкратному увеличению численности сальмонеллы тканях растений в сравнении с моноинокуляцией тканей только сальмонеллой
Для выявления способности эндофита облегчать проникновение других видов бактерий в растительные ткани был проведен эксперимент, в котором стерильные микрорастения картофеля инокулировали 10 мкл смеси клеток суточных культур бактерий, указанных в табл. 4 в количестве, 1 млн. клеток/лист. В варианте использования неэндофитного штамма листья одних микрорастений повреждали стерильным пинцетом, других – не повреждали. Выявлено, что без повреждений неэндофитный штамм не обнаруживался в тканях стерильных растений, тогда как при нанесении эндофитного штамма B. subtilis 26Д без повреждений бактерии обнаруживались в растительных тканях после поверхностной стерилизации (табл. 4). Так был выявлен интересный факт, подтверждающий данные цитируемых выше авторов о том, что одни виды (штаммы) бактерий могут способствовать проникновению в растительные ткани микроорганизмов других видов.
Таблица 4 – Влияние совместной с лактобациллами инокуляции микрорастений картофеля эндофитным штаммом B. subtilis 26Д на проникновение бактерий в растительные ткани
No п/п 1
3
5
Вариант
B. subtilis 26Д – без повреждения
L. plantarum 3L – без повреждения
L. plantarum 3L – повреждение
L. plantarum 3L* +B. subtilis 26Д** – без повреждения Контроль (без нанесения бактерий)
КОЕ/г ткани 50±10
0
7±1* + 42±4** 0

Исходя из полученных нами результатов, а также на основе анализа имевшейся в нашем распоряжении научной литературы о способности одних бактерий облегчать проникновение других неэндофитов в растительные ткани мы уточнили определение термина «эндофитные бактерии»: эндофитные бактерии – бактерии, способные жить внутри растений, не нанося им вреда, проникая во внутренние растительные ткани без повреждений, вызванных воздействием других факторов, и без помощи других микроорганизмов.
В связи с полученными результатами возник вопрос о том, как может меняться популяция клеток эндофитных бактерий, чей рост и размножения подавляется другими эндофитами. Для ответа из коллекции выделенных эндофитов были выбраны бактерии, колонии которых хорошо отличались при росте на агаровых средах (табл. 5).
Таблица 5 – Антагонизм некоторых штаммов бацилл по отношению к различным эндофитам (зона подавления роста, мм)
No Тест-объекты
B. subtilis26Д
2 B. subtilis 49РН
9 Variovorax sp. Ч’4
12 Pantoea sp. М23
* – антагонизм не проявляется
Бактерии – антагонисты 26Д 49РН
3±0,36
–
– 9±0,61 – 6±0,7
В эксперимент включали эндофитные штаммы B. subtilis, отличающиеся степенью проявления антагонизма по отношению к новым эндофитам Variovorax sp. Ч’4 и Pantoea sp. М23: антагонистичный по отношению к ним штамм B. subtilis 49РН и не антагонистичный – B. subtilis 26Д. На основания стеблей стерильных микрорастений картофеля, не касаясь агара, на расстоянии 5-10 мм от его поверхности микрокаплей наносили по 105 клеток бактерий B. subtilis 26Д и B. subtilis 49РН. Через 7 дней в одном из вариантов выше места нанесения бацилл наносили микрокапли, содержащие 105 клеток Variovorax sp. Ч4 и Pantoea sp. M23. Через 7 дней вырезали черенки стеблей выше на 2 см от места нанесения микрокаплей и ниже на 2 см от вершины растений. В асептических условиях определяли массу черенков, поверхностно стерилизовали и растирали в чашках Петри в аликвоте физраствора. Затем делали серию десятикратных разведений и высевали на поверхность агаризованной питательной среды LB. При инокуляции растений бактериями B. subtilis штамма 26Д, не проявляющего антагонизм к указанным эндофитам, и штамма 49РН, подавляющего рост их колоний in vitro, количество клеток Pantoea sp. М23 в тканях стебля картофеля остается, примерно, равным (табл. 6). В отличие от этого, неожиданно, при предобработке растений бактериями B. subtilis штамма 26Д количество клеток Variovorax sp. Ч’4 было в 12 раз меньше, чем при обработке растений клетками антагонистичного in vitro штамма 49РН.
Одновременно обнаружено уменьшение плотности популяции клеток самого антагониста в сравнении с моноинокуляцией только этими бациллами. В отличие от этого, при инокуляции растений эндофитом B. subtilis 26Д наблюдается увеличение количества его клеток в тканях картофеля в сравнении с моноинокуляцией клетками только самого штамма 26Д. Таким образом, нами показано, что антагонистический характер одного из эндофитных штаммов бактерий in vitro по отношению к другому, in vivo может не только не проявляться аналогичным образом, но и приводить к уменьшению численности клеток самого антагониста.
Таблица 6 – Влияние совместной инокуляции эндофитами микрорастений картофеля на количество клеток бактерий внутри стеблей (КОЕ/г)
Антагонизм in vitro (размер зоны подавления роста, мм)
B. subtilis
Pant oea sp. М23
Vario- vorax sp. Ч’4
Вариант инокуляции микрорастений картофеля
B. subtilis 26Д B. subtilis 26Д
+Pantoea sp. М23 B. subtilis 26Д +Variovorax sp.Ч’4 B. subtilis 49РН
B. subtilis 49РН +Pantoea sp. М23 B. subtilis 49РН +Variovorax sp. Ч’4
к тест- штаммам* –
0 0 – 6 9
к бацил- 26Д 49РН лам**
– 2120 ±220 0 3080 ±370 0 2600 ±160
– 0 0
2260 ±700 240 ±30 1580 ±171
2440 ±280
100 ±9
1200 ±182
2880 ±110
Примечание
* – антагонизм бактерий B. subtilis к Pantoea sp. М23 или Variovorax sp. Ч’4, соответственно; ** – антагонизм бактерий Pantoea sp. М23 или Variovorax sp. Ч’4 к бактериям B. subtilis, соответственно.
Изучение влияния оксикоричных кислот и сиринговой кислоты на рост бактерий рода Bacillus
Хорошо известно, что при механических повреждениях растений на месте ран формируется защитный физико-химический барьер в виде полимера лигнина. Одним из основных мономеров лигнина является оксикоричная феруловая кислота. В синтезе лигнина принимает участие также кумаровая кислота. Вместе с тем, лигнин является характерным компонентом клеточных стенок растений, формирующихся в процессе онтогенеза. В научной литературе
имеются сведения об ингибировании размножения некоторых видов бактерий оксикоричными кислотами. Если проникновение неэндофитов может происходить при поранении растений возникает вопрос о том, как эти соединения могут влиять на распространение эндофитных бактерий. До наших исследований в известной нам научно-технической литературе такие сведения отсутствовали. В связи с этим исследовали влияние феруловой кислоты (ФК), кумаровой, а также сиринговой кислот в концентрациях, близких к характерным для содержания в ризосфере растений, на рост колоний на плотных средах и размножение в жидких, двух эндофитных штаммов бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ. В экспериментах использовали два порядка концентрации кислот – 10 и 100 мкг/л, а в некоторых экспериментах и заведомо большую – порядка 100-1000 мкг/л. На плотных агаризованных средах (1,5% агара) колонии бактерий B. subtilis 26Д лучше росли в размерах на богатой питательной среде LB, и ожидаемо хуже на обедненной белками минерализованной среде ПСС (рис. 1а). В присутствии ФК рост колоний бактерий подавлялся на всех изученных средах, достоверно при концентрации ФК 100 мкг/л, наличие которой приводило к минимальному размеру колоний.
Рисунок 1 – Влияние феруловой кислоты на рост колоний B. subtilis 26Д на плотных средах (а) и на размножение клеток (б) в жидкой среде LВ.
При культивировании микроорганизмов в жидкой питательной среде выявлен обратный эффект действия ФК на размножение бактерий (рис. 1б). Например, при концентрации ФК 100 мкг/л к 48 ч роста культуры наблюдалось шестикратное увеличение плотности клеток в сравнении с контрольной средой.
Аналогичный эффект наблюдался при внесении кумаровой кислоты в среды роста бактерий. Наличие в агаризованной среде фенольной сиринговой кислоты также приводило к торможению роста колоний бактерий. В жидкой среде стимуляция размножения клеток на 24 ч наблюдалась при внесении в среду этого соединения с концентрацией в 100 раз больше, чем феруловой или кумаровой. Аналогичный характер указанных соединений наблюдался также в случае действия их в среде на другой штамм бациллы – B. subtilis 11ВМ.
Для исследования возможности распространения бактерий по поверхности твердой среды по типу скольжения и, одновременно, распространению, возможно, благодаря хемотаксису, использовали
полутвердую среду LB (0,7% агара) с градиентом ФК. Выявлено, что на такой среде, содержащей ФК, размеры колоний бактерий многократно увеличивались (таб. 7).
Таблица 7 – Размеры колоний бактерий (мм) на агаризованной (0,7%) среде LB
Концентрация кумаровой кислоты, мкг/л
Контроль 10
Штаммы B. subtilis 11ВМ 26Д 132 72
598 506 756 899
При этом не выявлен преимущественный рост колоний в сторону увеличения концентрации ФК – колонии формировались правильной круглой формы. На среде LB без ФК клетки формировали типичные для штамма B. subtilis 26Д сухие, морщинистые колонии с четко очерченными фестончатыми краями. На среде с ФК колонии «расплывались», края были нечеткими, лучистыми, были, примерно, от полутора до двух раз больше в диаметре в сравнении с колонией на контрольной среде без ФК.
В связи с тем, что в жидких средах наблюдали активацию размножения бактерий B. subtilis 26Д мы провели анализ наличия в геноме этого микроорганизма гена фермента декарбоксилазы фенольных кислота (Phenolic Acid Decarboxylase, PAD). С использованием ПЦР установлено наличие в геноме бактерии B. subtilis 26Д последовательности нуклеотидов, аналогичных гену PAD. На основании этих данных была проведена оценка способности бактерий разрушать молекулу ФК. Для этого оценивали изменение спектра поглощения ФК в среде с живыми и инактивированными клетками. Спектры поглощения растворов ФК с живыми клетками бактерий в начале реакции (линия 1), а также в суспензии инактивированных клеток бацилл после инкубации (линия 2) совпадали (рис. 2).
Рисунок 2 – Изменение спектра поглощения ФК в среде с клетками B. subtilis 26Д. 1 – спектр поглощения раствора ФК в среде с живыми клетками в начале реакции; 2 – спектр поглощения ФК после инкубации 120 мин в среде с инактивированными клетками; 3 – спектр поглощения раствора ФК через 120 мин инкубации в среде с живыми клетками.

Уменьшение показателя оптической плотности раствора ФК в суспензиях клеток можно объяснить частичной адсорбцией вещества на стенках клеток. Инкубация кислоты с живыми клетками меняла спектр поглощения ФК, что согласуется с данными других авторов, объясняющих этот эффект деструкцией вещества. Спектр поглощения ФК при инкубировании в среде с инактивированными клетками не изменялся. Таким образом, установлено, что бактерии штамма способны метаболизировать ФК.
Итак, нами впервые выявлено, что при наличии в среде оксикоричных кислот – феруловой и кумаровой, в концентрациях, характерных для секреции корнями растений при увеличении влажности твердой среды рост и скорость распространения колоний бактерий B. subtilis по поверхности может возрастать. Впервые установлена способность бактерий штамма 26Д B. subtilis к деструкции ФК.
Активность РНКаз и способность эндофитов защищать растения картофеля от вирусных инфекций
Механические повреждения растений «открывают ворота» не только микроорганизмам, но и вирусным частицам. В научной литературе пока недостаточно сведений о влиянии инокуляции растений эндофитными штаммами бактерий на распространение вирусной инфекции. Известно, что вирусы, поражающие растения, относятся к РНК-вирусам. Наличие РНК-аз у эндофитных штаммов бактерий может способствовать противостоянию растений в сообществе с такими микроорганизмами вирусам. До наших работ системных исследований наличия РНКазной активности у эндофитных штаммов бактерий мы не встречали в литературе, в связи с чем была поставлена задача оценки наличия и сравнительного уровня активности экзоРНКаз в культурах эндофитов.
Мы провели анализ активность РНКаз у 175 эндофитных штаммов бактерий, выделенных из разных видов растений, а также из коллекции лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УФИЦ РАН. Все штаммы бактерий, отнесенных нами к роду Bacillus, продуцировали ферменты, способные разрушать РНК на твердых средах. У бактерий Pseudomonas sp. такая активность проявлялась у 85% образцов, у Enterobacter sp. – у 64%. 32 неидентифицированных штамма также были способны секретировать РНКазы в окружающую среду. Зона вокруг колонии бактерии, в которой разрушалась дрожжевая РНК (зона гало), была больше у всех представителей рода Bacillus – в среднем 5,71 мм. Размер зоны гало у представителей Pseudomonas и Enterobacter был, примерно, одинаковый и составлял 1,84 и 1,74 мм, соответственно. Анализ способности эндофитов к деструкции РНК показал, что высокая активность этого фермента характерна для представителей рода Bacillus, тогда как многие представители Enterobacter не проявляют такой активности в постановке экспериментов на твердых агаризованных средах.
Анализ связи между активностью РНКаз в твердой среде и в жидкой культуре (табл. 8) выявил слабую положительную корреляции между этими показателями (коэффициент корреляции r=0,50).
Таблица 8 – Активность РНКаз в твердой среде и в жидкой культуре
Вид
B. subtilis
B. thuringiensis Enterobacter sp.
Штамм Активность РНКаз
Титр клеток, КОЕ×103/г сырой массы 120,0±14,2 3,5±0,1 350,0±15,6 90,0± 2,3 90,0±13,4 70,0±12,3 3,0±0,11 0,01±0,001
оптическая плотность/(мин×мл)
TS2 6,45±1,03 STL7 5,87±0,96 26Д 3,97±0,77 11ВМ 3,04±0,55 ВКПМ-6066 6,02±0,86 ВКПМ-5351 1,32±0,08 ВКПМ-5689 2,64±0,04
BC-8 0
зона гало, мм 3,0 6,5 4,5 7,0 4,0 2,0 5,0
Среди штаммов, проявляющих высокую активность РНКаз на твердых средах в виде зон гало встречались также штаммы, характеризующиеся одновременно и высокой антагонистической активностью к фитопатогенным грибам.
Совместно с сотрудниками лаборатории ИБГ УФИЦ РАН, а также Татарского НИИСХ КНЦ РАН, указанных в наших публикациях, установлено, что обработка растений картофеля препаратом, содержащим клетки В. subtilis 26Д – основу биофунгицида Фитоспорин-М, привела к уменьшению поражения растений вирусом М, а при обработке смесью штаммов бактерий B. subtilis 26Д, B. ssp. thuringiensis (ВКПМ B-5689) и B. thuringiensis ssp. kurstaki (ВКПМ B- 6066), статистически достоверно уменьшилось распространение YBK и SBK на 57% и 44%, соответственно по сравнению с контролем. Подавление вирусной инфекции у картофеля при использовании препарата, содержащего три штамма бактерий, из которых два вида относятся к инсектотоксичным, могло проявиться благодаря как подавлению распространённости насекомых – переносчиков вирусов и уменьшению ими повреждения, так и наличию РНКаз.
Выявлено, что оба штамма B. thuringiensis продуцировали РНКазы, наибольшей активность характеризовался штамм ВКПМ-6066, наименьшей – ВКПМ-5351. Сходным образом обработка растений картофеля уменьшала степень распространения вирусов в условиях БНИИСХ УФИЦ РАН. Так, если на контрольных делянках было поражено 60% растений, то при обработке препаратом бактерий В. subtilis 26Д выявлено 18% больных растений, бактериями В. thuringiensis В-5689 – 33%.
В других экспериментах (получены совместно с соавторами статьи Sorokan et al, 2020) было выявлено, что обработка растений картофеля препаратами бактерий с более высокой активностью РНКаз в сравнении с другими штаммами эффективнее защищали растения от вирусов. Наименьший
процент инфицированных растений был выявлен при обработке картофеля бактериями Bacillus sp. TS2, STL7, B. subtilis 26Д и B. thuringiensis ВКПМ 6066. Достоверно высокий коэффициент корреляции между титром клеток бактерий в тканях растений картофеля и распространенностью вирусов выявлен при
инфицировании вирусом S (r=−0,865972) и вирусом Y (r=−0.76322, через 17 дней и r=−0,5734 через 29 дней после обработки растений бактериями).
Создание рекомбинантного штамма B. subtilis 26ДCryChS и оценка его свойств
В нашей работе одним из основных объектов исследований был эндофитный штамм B. subtilis 26Д – основа коммерческого биофунгицида Фитоспорин-М, применяющегося в России на посевах сельскохозяйственных культур на протяжении нескольких десятилетий. Известно, что эта бактерия характеризуется антагонистической активностью к фитопатогенным грибам, и, как показано нами, способностью продуцировать РНКазы. Так как штамм является эндофитным, т.е. проникает в растения без механических повреждений, и безопасным согласно паспорту, возникло предположение о возможности трансформации его геном, кодирующим синтез инсектотоксичного белка, например, семейства Cry с целью получения штамма, проявляющего комплекс хозяйственно-полезных свойств. На этом основании нами была предпринята попытка трансформации этого штамма путем введения в геном бактерии указанного выше инсектотоксичного гена совместно с к.б.н. Благовой Д.К.
Для трансформации B. subtilis была использована интегративная плазмида pDG1662 (рис.3).
Рисунок 3 – Схема клонирования гена Cry1Ia.
В трансформации были получены линии с частотой 200 КОЕ/мкг плазмидной ДНК. Для проверки экспрессии данного гена в рекомбинантном штамме использовалась ОТ-ПЦР (рис. 4).
Рисунок 4 – Результат ОТ-ПЦР рекомбинантного штамма B. subtilis 26ДCry. Дорожки: 1 – РНК B. subtilis 26Д; 2 – к-ДНК B. subtilis 26Д; 3 – РНК B. thuringiensis ВПКМ-5351; 4 – к-ДНК B. thuringiensis ВПКМ-5351; 5 – РНК B. subtilis 26ДCry; 6 – к-ДНК B. subtilis 26ДCry; М – маркер молекулярной массы (Sibenzim).

Как видно на рис. 4, рекомбинантный штамм 26ДCry содержал кДНК, аналогичную по размерам ДНК, кодирующую белок Cry у штамма B. thuringiensis ВПКМ-5351. Способность заселять ткани растений у рекомбинантного штамма осталась такая же, как и у дикого штамма B. subtilis 26Д. Количество КОЕ/г B. subtilis 26Д в растениях картофеля, составило 4×105±2×102, а B. subtilis 26ДCry – 5,2×105±1,8×102.
Наличие генов устойчивости к антибиотикам, которые не присутствуют в естественных условиях в природных штаммах B. thuringiensis, но требуются для отбора рекомбинантов, считается проблемой с точки зрения экологической безопасности трансформированных штаммов. В связи с этим в дальнейших экспериментах ген cat, который определяет устойчивость трансформированных линий к хлорамфениколу, был удален перед трансформацией с использованием эндонуклеаз EcoR1 и Sphl. Таким образом, селективным свойством трансформированных бактерий является только утрата способности гидролизировать крахмал.
Трансформированные линии выявляли на среде LB, содержащей 1% крахмала после воздействия паров йода (рис. 5).
Рисунок 5 – Колонии бактерий Bacillus на среде LB, содержащей 1% крахмала, под действием паров йода.
Колонии исходного штамма B. subtilis 26Д (амилаза+) проявляли светлые ореолы на среде. Активности амилазы и светлого ореола вокруг колоний рекомбинантных линий не наблюдалось.
Рекомбинантные линии B. subtilis 26DCryChS не отличались по культурально-морфологическим признакам от исходного штамма B. subtilis 26Д. Плотность популяции клеток этой линии во внутренних тканях листьев картофеля составляла 5,1×105 КОЕ/г, что не меньше количества штамма B. subtilis 26Д (4×105 КОЕ/г). И штамм B. subtilis 26Д, и линия B. subtilis 26DCryChS обладали фунгистатическими свойствами по отношении к фитопатогену S. nodorum. Донор штамма Btcrylla – штамм B. thuringiensis B- 5351 не подавлял рост S. nodorum. Антагонистическая активность in vitro против фитопатогена Ph. infestans, вызывающего фитофтороз картофеля, была на 20% больше, чем у исходного штамма B. subtilis 26Д. Обработка семян пшеницы бактериями штамма 26ДCryChS стимулировала рост проростков; сохранилась также фосфатмобилизирующая активность клеток.

Новым свойством для модифицированного потомства бактерии B. subtilis 26ДCryChS является высокая инсектицидная активность, существенно (примерно, в 2 раза) превышающая таковую по сравнению с исходным штаммом B. subtilis 26Д, сопоставимая, для сравнения, по значению с инсектицидными свойствами B. thuringiensis В-5351 по смертности тлей (61% и 58%, соответственно, табл. 21, данные получены совместно с соавторами статьи Maksimov, 2020) и превышающая значения у штамма B. thuringiensis В-5351 по смертности личинок колорадского жука в тесте с предварительной обработкой целых растений препаратами (26% и 62%, соответственно, данные получены совместно с соавторами статьи Sorokan, 2020). По данным научно-технической и патентной литературы модифицированный штамм раннее не был известен, что, в совокупности, позволило депонировать его в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ВНИИСХМ РАН под номером RCAM04928 и далее запатентовать.
ВЫВОДЫ
1. Из поверхностно стерилизованных тканей различных органов разных видов растений выделено 110 штаммов бактерий, идентифицирован род у 73 штаммов, установлен вид у 17 микроорганизмов. Показано, что частота выявления эндофитов в тканях растений, выделяющих экссудат, закупоривающий раны при повреждениях, меньше, чем у растительных культур других видов.
2. Впервые показано, что совместная инокуляции растений эндофитной бактерией B. subtilis 26Д способствует проникновению в растительные ткани клеток неэндофитной бактерии Lacobacillus plantarum 3L. На основе полученных данных предложено уточнение эндофитных бактерий, как микроорганизмов, способных самостоятельно проникать в растительные ткани.
3. Впервые установлено, что феруловая, кумаровая и сиринговая кислоты влияют на скорость распространения колоний эндофитных бактерий B. subtilis на поверхности агаризованных питательных сред, увеличивая ее на полутвердых средах (0,7% агара).
4. У эндофитной бактерии B. subtilis 26Д – основы биофунгицида Фитоспорин-М, впервые выявлена способность к деструкции феруловой кислоты.
5. Показана способность эндофитных бактерий, продуцирующих РНКазы, защищать растения картофеля от вирусных инфекций. Выявлено наличие достоверной обратной корреляции между плотностью в тканях картофеля клеток эндофитных бактерий B. subtilis 26Д, новых штаммов Bacillus sp TS2, STL7, а также B. thuringiensis ВКПМ6066 и степенью распространения вирусной инфекции, вызванной вирусами S и Y.
6. Создан рекомбинантный штамм бактерии B. subtilis 26ДCryChS, несущий ген инсектотоксина и обладающий комплексной биологической активностью по отношению к растениям. На примере бактерии B. subtilis 26Д показана возможность использования эндофитов в качестве векторов для придания растениям устойчивости к вредным насекомым.