Разработка и валидация количественного метода анализа молекул ДНК TREC и KREC для диагностики первичных иммунодефицитных состояний
Список принятых сокращений…………………………………………………………………………………………………6
Введение…………………………………………………………………………………………………………………………………9
Глава 1. Развитие скрининга новорожденных и его место в диагностике первичных
иммунодефицитных состояний (Обзор литературы)……………………………………………………………….17
1.1……………….Раннее начало скрининга новорожденных……………………………………..17
1.1.1 Фенилкетонурия: открытие, лечение и скрининг
1.1.2 Признание важной роли скрининга в здоровье населения
1.1.3 Расширение программ скрининга новорожденных
1.1.4 Методики скрининга новорожденных
1.1.5 Программы скрининга новорожденных по всему миру
1.1.6 Первичные иммунодефицитные состояния
1.1.7 Созревание и дифференцировка Т и Влимфоцитов, образование TREC и
KREC ………………………………………………………………………………………24
1.2 История скрининга новорожденных на ПИД…………………………………..29
1.2.1 Скрининг на ТКИН
1.2.2 Скрининг на наличие врожденных дефицитов Влимфоцитов
1.2.3 Параллельный скрининг на тяжелые формы первичного иммунодефицита,
проявляющегося Т и Влимфопенией
1.2.4 Ограничения применяемых стратегий скрининга на ПИД в настоящее время 35
1.2.5 Текущее состояние скрининга новорожденных на ПИД во всем мире
1.2.6 Диагностика ПИД у взрослых (за пределами скрининга новорожденных)
1.3 Будущее скрининга новорожденных на ПИД………………………………….41
1.3.1 Скрининг нарушений комплемента и гранулоцитов на основе белковых
методов ………………………………………………………………………………………41
1.3.2 Скрининг на семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз
1.3.3 Скрининг на ПИД с помощью модифицированной массспектрометрии
(протеомный подход)
1.3.4 Роль секвенирования следующего поколения (NGS) в скрининге
новорожденных на ПИД
1.3.5 Пренатальный скрининг
1.3.6 Развитие неонатального скрининга на ПИД без дорогостоящих
секвенирования и массспектрометрии
1.3.7 Дальнейшие диагностические действия после скрининга при его
положительном результате
Глава 2. Материалы и методы………………………………………………………………………………………………..53
2.1 Пациенты
2.1.1 Сухие пятна крови новорожденных
2.1.2 Сухие пятна крови от умерших детей (архивные)
2.1.3 Создание искусственных сухих пятен с известными данными
иммунофенотипирования
2.2 Материалы
2.2.1 Олигонуклеотидные праймеры
2.2.2 Реактивы
2.2.3 Буферные растворы
2.2.4 Ферменты
2.2.5 Комплекты реагентов для экстракции нуклеиновых кислот
2.2.6 Комплекты реагентов для секвенирования по Сэнгеру
2.2.7 Комплекты реагентов для полноэкзомного секвенирования (NGS)
2.2.8 Флуоресцентномеченые антитела к антигенам дифференцировки
2.2.9 Дополнительные материалы
2.3. Методы………………………………………………………………………………60
2.3.1 Выделение ДНК из клинических образцов
2.3.2 Получение калибраторов
2.3.3 Количественный анализ TREC и KREC методом ПЦРРВ
2.3.4 Фенотипическая характеризация пациентов методом проточной
цитофлюорометрии
2.3.5 Секвенирование по Сэнгеру гена BTK у больных с Хсцепелнной
агаммаглобулинемией
2.3.6 Полноэкзомное секвенирование и биоинформационный анализ
2.3.7 Плавление с высоким разрешением (HRM) для выявления мутации
c.3061G>A в гене PIK3CD
2.3.8 Градиентная ПЦР и плавление с интеркалирующим красителем
2.3.9 Методы статистического анализа
Глава 3. Разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме “реального
времени” для количественного анализа TREC и KREC, а также однокопийного нормировочного
локуса в геноме человека ………………………………………………………………………………………………………67
3.1.1 Получение стандартных плазмидных образцов.
3.1.2 Выбор олигонуклеотидных праймеров и зондов, оптимизация условий
мультиплексной ПЦР
3.1.3 Подбор оптимальной температуры отжига праймеров
3.1.4 Определение оптимальной концентрации ионов Mg2+ в ПЦРсмеси
3.1.5 Определение оптимальной концентрации праймеров и зондов в ПЦРсмеси
3.1.6 Оптимизация метода «цифровой» ПЦР для абсолютного определения
количества TREC и KREC
3.1.7 Исследование влияние энхансеров ПЦР на эффективность работы
предложенных систем праймеров и зондов
Глава 4. Аналитическая характеризация разработанной системы для количественного анализа
TREC и KREC……………………………………………………………………………………………………………………….86
20.1. Аналитическая чувствительность
4.2 Оценка чувствительности набора реагентов с учетом экстракции ДНК
4.3 Оценка эффективности применения термофильных ДНКполимераз различных
производителей
4.4 Аналитическая специфичность
4.5. Определение линейного диапазона
4.6. Определение воспроизводимости измерения TREC и KREC
4.7. Оценка вариации работы системы TREC/KREC/ALB
4.8. Выбор метода экстракции ДНК из сухих пятен крови
Глава 5. Диагностическая характеризация разработанного набора реагентов ……………………….105
5.1. Определение референсных интервалов TREC и KREC для скрининга
новорожденных
5.2 TREC и KREC в сухих пятнах крови от умерших детей (архивные)
5.3 TREC и KREC в цельной крови умерших детей
5.4 ТКИН
5.5 Хсцепленная агаммаглобулинемия
5.6 Дефекты репарации ДНК
5.6.1 Атаксия телеангиэктазия (синдром ЛуиБар)
6.1.2 Синдром Ниймеген
5.7 Синдром делеции 22й хромосомы (del 22q11.2) или синдром Ди Джорджи
5.8 Синдром Дауна или трисомия по 21 хромосоме
5.9 ОВИН
5.10 ГиперIgM синдром
5.11 Селективный IgA дефицит
5.12 Синдром Кавасаки
5.13 Тяжелые состояния (не ПИД)
5.14 Многоцентроое исследование разработанной системы праймеров и зондов
Глава 6. Молекулярная диагностика для пациента с диагнозом “ОВИН?”
6.1 Клиническое описание
6.2 Количественная оценка молекул TREC и KREC
6.3 Молекурногенетический анализ
Заключение …………………………………………………………………………………………………………………………205
Выводы ……………………………………………………………………………………………………………………………….206
Практические рекомендации………………………………………………………………………………………………..207
Список литературы ……………………………………………………………………………………………………………..208
Приложение ………………………………………………………………………………………………………………………..246
Разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции в
режиме “реального времени” для количественного анализа TREC и KREC, а также однокопийного нормировочного локуса в геноме человека
Первым этапом нашей работы стало клонирование протяженных (более 200 п.н.) фрагментов TREC, KREC, генов IL17RA и альбумина для создания плазмидных стандартные ДНК, которые необходимы как для оптимизации условий ПЦР, так и для определения динамического диапазона измерений, лимита квантификации (LOQ) и лимита детекции (LOD). Полученные рекомбинантные плазмиды линериазовали эндонуклеазами рестрикции, измеряли концентрацию флюорометрически и с помощью ddPCR (см. Материалы и Методы), разводили до концентраций 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 копий плазмиды на мкл для использования в дальнейших этапах работы
Мы протестировали олигонуклеотидные праймеры и зонды для TREC, описанные во многих работах по скринингу на ТКИН (Baker, 2009; Borte, 2012) и констатировали недостаточную эффективностью амплификации (менее 85% при использовании
четырех разведений в четыре раза двух случайных ДНК здоровых детей с возрастом не более года). В экспериментах с плавлением с интеркалирующим красителем EvaGreen® и при любой температуре отжига праймеров было показано наличие неспецифичных продуктов амплификации. Таким образом, необходимо было подобрать другую пару праймеров и зондов для мишени TREC, отличающуюся более высокой специфичностью и позволяющей достичь лучших показателей эффективности амплификации.
При выборе праймеров и зондов для мишени KREC также были проанализированы предложенные ранее структуры (van Zelm, 2007). Ввиду наличия большого количества их вторичных структур, разброса в температурах отжига, было необходимо подобрать другую пару праймеров и соответствующий им зонд, которые бы при мультиплексировании с мишенями TREC и нормировочного локуса показывали адекватную эффективность ПЦР и не взаимодействовали друг с другом.
Часто используемый в указанных выше работах обратный праймер на геномный локус beta-actin 5’- CGTCACACTTCATGATGGAGTTG-3’, используемый для оценки количества геномной ДНК человека, показал 100% гомологию с псевдогенами на различных хромосомах человека. Это может увеличивать вероятность образования неспецифичных продуктов ПЦР, что также побудило нас найти новый референсный ген и подобрать к нему пару олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченный зонд.
Праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом нуклеотидных последовательностей TREC и KREC таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК (перестроенной и не перестроенной в Т- и В-лимфоцитах и в любых других клетках человека не лимфоцитарного ряда), а также с учетом минимизации образуемых в мультиплексной реакции праймер-димеров. Структуры разработанных и в дальнейшем используемых олигонуклеотидных праймеров и зондов приведены в разделе «Материалы и методы». Оптимальную температуру отжига праймеров, при которой в эксперименте не наблюдается образования неспецифических продуктов, но наблюдается высокая эффективность амплификации, подбирали с помощью градиентной
ПЦР с использованием как флуоресцентного зонда, так и интеркалирующего красителя (EvaGreen®) с последующим анализом кривых плавления. Оптимальную концентрацию ионов Mg2+ в реакционной смеси определяли, тестируя коммерчески доступные буферы для ПЦР с различной его концентрацией, она составила 3,5 мМ. Также нами были определены оптимальные концентрации праймеров и зондов, обеспечивающие максимальную эффективность амплификации всех типов ампликонов в области как больших, так и малых концентраций геномной ДНК человека (табл. 1).
Таблица 1. Оптимальные параметры разработанной системы: олигонуклеотидный состав
Выявляемая мишень
Название олиго- нуклеотида
Конечная концентрация в реакции, мкМ
Размер ампликона
sjTREC (T cell receptor excision circles)
sjKREC (k- deleting recombination excision circles)
ВКО – Homo sapiens ген альбумина
TREC2 forward TREC2 reverse
TREC2 probe KREC3 KREC4
KREC4 probe
Alb-U
Alb-R Alb-PR
от 0,45 до 0,65 от 0,6 до 0,85
0,15-0,25 от 0,6 до 0,85 от 0,6 до 0,85
0,15-0,25
0,25-0,35 0,25-0,35 0,1-0,15
144 п.н.
112 п.н.
98 п.н.
Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен “горячий старт”, который обеспечивался как использованием химически модифицированной Taq-полимеразы, так и с использованием специфических к Taq-полимеразе моноклональных антител. С целью увеличения чувствительности без снижения специфичности был оценен вклад различных соединений, способных улучшать ПЦР: бетаин, ДМСО, БСА, коммерческая ПЦР-смесь “Синтол” с энхансерами (Frackman, 1998), однако, они не оказали существенного влияния на эффективность ПЦР.
Аналитическая характеризация разработанной системы
Для определения LOD (limit of detection – минимальное количество ДНК матрицы, при котором результаты ПЦР положительны в 95% повторов) и LOQ (limit of quantification – наименьшее количество аналита, которое может быть измерено с приемлемой точностью) был проведен мультиплексный анализ 4х разведений стандартных образцов ДНК TREC, KREC и ALB в 20 повторах с построением калибровочной кривой на 4х повторах этих же стандартных ДНК. В проведенном анализе только при концентрации 5 копий на реакцию одна из 20 реплик по каналу TREC (FAM) являлась ложно-негативной. Таким образом, LОD (95%) для мишени TREC составил 5 копий на реакцию. Дальнейший анализ коэффициента вариации на всех 3 мишенях показал, что при концентрации 10 коп/реак коэффициент вариации составил для TREC – 38,3%, что близко к 35% стандартному значению, а для KREC и ALB %) – 27,5 и 29,9% (менее 35%), соответственно. Таким образом, LОQ составил 10 копий измеряемых ДНК мишеней на реакцию.
Надежность (robustness) – это мера способности аналитической процедуры не менять свои аналитические характеристики при незначительных, но вероятных вариациях. К одной из наиболее значимых таких вариаций относится выполнение анализа на схожих по назначению, но разных (по производителю) приборах. В связи с этим, надежность оценивалась в постановках на приборах CFX96 (Bio-rad), ABI7500 (Applied Biosystems), RG3000 (Corbett Research) и Light Cycler 96 (Roche). Анализ показал, что вне зависимости от используемого прибора сохраняется определенный ранее уровень детекции по всем трем мишеням – не хуже 6 копий на реакцию.
Для того, чтобы оценить чувствительность разработанного набора реагентов для амплификационной части и для этапа экстракции ДНК совместно, был проведен эксперимент, заключающийся в создании пулированных образцов крови, полученных от детей с установленными диагнозами ТКИН и агаммаглобулинемия, подтвержденными данными проточной цитометрии, добавлением к ним крови здоровых детей того же возраста в разном соотношении, и экстракции ДНК из 100 мкл полученных пулированных образцов. Образцы пулированной крови были разбавлены кровью от больного с ТКИН или агаммаглобулинемией в различных соотношениях от
10% до 100%. Анализ показал, что система позволяет воспроизводимо оценивать количество молекул TREC/KREC в модельных образцах крови, содержащих всего 10% крови здоровых детей. Следовательно, можно заключить, что 10 мкл крови достаточно для проведения подобного анализа.
Для проверки аналитической специфичности разработанной ПЦР использовали ДНК клеточных линий нелимфоидного происхождения, несущих неперестроенные Т- и В-клеточные рецепторы, а именно – HEK293, HeLa, Н460, а также образцы гДНК из мочи и слюны. По результатам проведенного тестирования специфичность составила 100%.
Линейный диапазон количественного определения копийности TREC, KREC и ALB определяли с помощью ПЦР на разведениях стандартных плазмид от 109 коп/мл до 103 коп/мл. В области исследуемых концентраций для всех трех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Сt от концентрации с коэффициентом корреляции R2 не хуже 0,98.
Для оценки вариации значений Ct по всем трем мишеням были рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение по 120 запускам на приборе Rotor-Gene 3000 и 50 запускам на приборе CFX96 для калибратора No2 (К2) с концентрацией 3х105 копий на мл, соответственно, всего было произведено 170 измерений этой точки. В случае набора реагентов EnliteTMNeonatal TREC производитель оценил вариацию путем 108 измерений Ct 7-ми образцов сухих пятен, SD для TREC колебалось от 0,65 до 0,87 (EnLite Neonatal TREC kit). В работе Audrain в многоцентровом исследовании на территории Франции диапазон SD для TREC составил 0,25 – 0,45 (Audrain, 2018). Значения Ct для К2 в 120 постановках на амплификаторе Rotor-gene по TREC характеризовались разбросом Ct от 19,93 до 22,72 (среднее Ct – 21,77 [95% CI 21,68– 21,85]) и стандартным отклонением 0,47, что меньше, чем заявлено в инструкции к набору реагентов производства PerkinElmer, и близко к значению SD, полученному во Франции.
Определение референсных интервалов TREC и KREC для скрининга новорожденных
Сухие пятна крови представляют собой небольшую каплю капиллярной крови, полученной из прокола пальца или из пятки
новорожденных ланцетом, помещенную на бумажный фильтр и затем высушенную. Данный способ получения клинического образца для проведения дальнейших диагностических процедур имеет низкую себестоимость, менее инвазивный, чем отбор венозной крои из локтевой вены, и не требует специальных условий хранения. Для определения референсных интервалов требуется группа клинически здоровых индивидуумов с целью установления «нормальных» значений тестируемого аналита. Определение референсных норм у новорожденных стоит в ряду организационно сложных задач, для которых популяционные подходы с минимальным отбором на стадии формирования выборки и дальнейшим статистическим анализом целевого аналита являются методом выбора (Poole, 2016). Особенно это применимо для редких заболеваний, для которых попадание «больных» субъектов в референсную группу имеет низкую вероятность. К такой группе заболеваний относятся первичные иммунодефицитные состояния (ПИД), и в частности, ТКИН.
Мы использовали популяционную выборку сухих пятен крови новорожденных на картах Гатри размером 2739 индивидуальных образцов для определения референсных интервалов значений молекул ДНК TREC и KREC. Медиана полученных абсолютных значений TREC и KREC составила 195 (CI95%: 185-206) и 185 (CI95%: 176-197) копий на мкл, соответственно, нормированных значений для TREC – 2780 (CI95%: 2690-2840) и для KREC – 2790 (CI95%: 2700-2900) копий на 2×105 копий гена альбумина или 105 ядросодержащих клеток. Референсный интервал рассчитывался для 99 и 99,9 перцентилей всех величин TREC и KREC. Для фильтрации «выпадающих» значений был применен критерий Тьюки после логарифмической трансформации данных, ввиду их несимметричного распределения. При анализе абсолютных значений (TREC/KREC на мкл крови) не было идентифицировано «выпадающих» значений TREC, для KREC из дальнейшего анализа было исключено 18 значений (от 9,8 до 13,5). В нормированных значениях TREC/KREC «выбросов» не выявлено. Полученные нижние референсные значения TREC и KREC (на уровне 0,1 перцентиля) составили 458 и 32 на 105 ядросодержащих клеток, 23 и 17 на мкл крови новорожденных соответственно.
TREC и KREC в сухих пятнах крови от умерших детей.
В ретроспективное исследование вошли образцы от 24 детей, умерших на первом году жизни от генерализованных вирусных и бактериальных инфекций, что позволяет заподозрить у них ПИД. Для проверки этой гипотезы из ГБУЗ «НПЦ ПЗДП им. Г.Е. Сухаревой ДЗМ» были получены карты новорожденных от этих детей, содержащие сухие пятна крови. Из 24 образцов ДНК присутствовала и была пригодна для анализа для 22 образцов. Из них в 18 образцах ТРЕК и КРЕК превышали граничное значение. Из четырех образцов, в которых полученные значения TREC оказались сниженными, трое принадлежали недоношенным детям, для которых незрелость иммунной системы является временным фактором, обусловленным гестационным возрастом. Исследование выявило одного ребенка, в сухом пятне крови которого отсутствовали TREC, а KREC находились на нижней границе нормы. В возрасте 1,5 месяцев пациенту было проведено иммунофенотипирование, подтвердившее результаты анализа TREC и KREC и диагноз ПИД, ТКИН. Несмотря на относительно раннюю постановку диагноза, этот ребенок умер в связи с генерализацией ЦМВ-инфекции.
Установление пороговых значений TRECn и KRECn для различных ИДС
ТКИН – генетически неоднородная группа заболеваний (более 15 генетических вариантов), но все пациенты имеют общую составляющую: полное отсутствие или очень низкий уровень функциональных Т-лимфоцитов из-за нарушения развития Т-клеток в тимусе, что приводит к выраженным дефектам клеточных и гуморальных параметров иммунитета (Buckley, 2004). Х-сцепленная агаммаглобулинемия (XLA) характеризуется ограниченным количеством или отсутствием зрелых В-лимфоцитов или секретирующих антитела плазматических клеток, острые и хронические заболевания легких являются ведущей причиной смерти (41% случаев) при этом заболевании.
Для определения пороговых нормированных значений TREC для диагноза ТКИН и KREC для диагноза XLA был проведен ROC- анализ, в который вошли образцы цельной крови от 40 детей с ТКИН и 23 детей с XLA. Группу сравнения для ТКИН составил 181
ребенок в возрасте до 1 года, для XLA – 171 ребенок той же возрастной группы.
Таблица 2. Пороговые значения TREC/KREC для ТКИН и XLA
Диагноз
Диагностическое граничное значение TRECn Диагностическое граничное значение KRECn Чувствительность
Специфичность
ТКИН XLA 94 –
– 12 97,50% 96,65% 100,0% 100,0%
Аналогично, ROC-анализ для установления пороговых значений TRECn и KRECn был проведен для 37 детей с атаксией- телеангиэктазией, 28 детей с синдромом Ниймеген, 75 детей с синдромом Ди Джорджи, 13 детей с синдромом Дауна, 136 детей с ОВИН, 11 детей с гипер-IgM синдромом, 45 детей с селективным дефицитом IgA, 10 детей с синдромом Кавасаки.
Таблица 3. Пороговые значения TREC/KREC для различных ИДС
Диагноз
Атаксия- телеанги- эктазия
Синдром Ниймеген
Синдром Ди Джорджи
Синдром Дауна
Диагност. граничн. значение TRECn Чувствительность Специфичность
Диагност. граничн. значение KRECn Чувствительность Специфичность
Диагност. граничн. значение TRECn Чувствительность Специфичность Диагност. граничн. значение KRECn Чувствительность Специфичность
91,89% 97,18% 230
86,49% 96,61%
36,03% 90,64% 146
25,00% 92,40%
93,33% 95,32% 85
80,00% 97,66%
>1939
81,82% 48,02% 1070
9,09% 70,06%
499
64,00% 85,83% 679
84,00% 24,87%
>1414
53,33% 70,18% >445
82,22% 37,43%
84,62% 93,79% 209
92,31% 59,89%
1270
50,0% 71,75% 899
10,00% 75,71%
ОВИН
Гипер-IgM синдром
Селект. дефицит IgA
Синдром Кавасаки
Следовательно, для разных ИДС исследование TREC и KREC имеет разную диагностическую значимость, а для некоторых – селективный дефицит IgA, гипер-IgM синдром и синдром Кавасаки – не применимо вовсе.
Тяжелые состояния. В 2018-2019 гг. было проведено проспективное обсервационное исследование, в которое вошли пациенты в возрасте до 1 года, кому по тяжести состояния потребовалась госпитализация в отделение ИОРИТ в виду необходимости респираторной поддержки, нарушения сердечного ритма или органной недостаточности, гипоперфузии. Статистический анализ распределения значений TRECn, KRECn, СРБ и ПКТ в группах новорожденных «тяжело болеющих» (1-я группа) и «умерших» (2-я группа) с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и введением поправки Бонферрони позволил выявить статистически значимое снижение TREC (p = 0,0004) и увеличение уровня прокальцитонина (p = 0,004) во второй группе («умершие»). Распределение значений TRECn в группах – популяционная норма, тяжело болеющие и умершие дети – имело статистически значимые отличия (p<0,0001). Разница медиан для TRECn в исследуемых группах также оказалась высоко статистически значима (p < 0,001). различий в количестве KREC в цельной крови в группах «тяжелых состояний» и «умерших» выявлено не было: медианы нормированных значений KREC составили 742,4 и 501,3 копий KREC на 105 лейкоцитов соответственно (р = 0,3963).
Молекулярная диагностика для пациента с диагнозом "ОВИН?".Полноэкзомное секвенирование было проведено с целью установления окончательного диагноза 17-летнему мальчику, имевшему в анамнезе признаки общей вариабельной иммунной недостаточности (ОВИН), рецидивирующие легочные инфекции, хроническую виремию ЭБВ, лимфаденопатию, снижение субкласса IgG3 и отсутствие субкласса IgG4, и количество TRECn на нижней границе нормы, многократно госпитализированного в отделение иммунопатологии многопрофильного стационара. Мы показали наличие гетерозиготной миссенс-мутации E1021K в гене PIK3CD, кодирующем p110d (c.3061G > A [p.E1021K]). Присутствие данной мутации в геноме пациента было подтверждено с помощью секвенирования по Сэнгеру, а ее отсутствие в образцах ДНК от
родителей пациента свидетельствует о возникновении этой мутации de novo. Другие мутации в генах, задействованных в функционировании иммунной системы, также были подтверждены секвенированием по Сэнгеру, включая TLR3 p.L412F, TNFRSF1A p.R121Q (rs4149584), ассоциированные с периодической болезнью. В результате полноэкзомного секвенирования диагноз “ОВИН?” был уточнен и изменен на “синдром активированной фосфоинозитол 3-киназы-δ”, для которого описаны возможные таргетные пути терапии. Для выявления мутации в PIK3CD нами был предложен тест на основе HRM, что позволило исследовать выборку образцов ДНК от пациентов с диагнозами ОВИН, гипогаммаглобулинемия и гипер-IgM синдром (96 пациентов). Ни у одного обследуемого не была выявлена эта мутация.
Выводы
1. Разработанный нами метод мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» для количественного анализа молекул ДНК TREC, KREC, гена альбумина показал приемлемые аналитические характеристики (специфичность – 100%, LОD (95%) для 3 мишеней – 5 копий на реакцию, LОQ (95%) для 3 мишеней – 10 копий на реакцию, высокую робастность), позволяющие применить его в клинико- диагностической практике.
2. С использованием разработанного метода нами определены референсные значения TREC и KREC в сухих пятнах крови на картах Гатри (медианы полученных нормированных значений для TREC – 2780 (CI95%: 2690-2840), для KREC – 2790 (CI95%: 2700- 2900) копий на 105 ядросодержащих клеток; нижние границы (99.9% референсный интервал) – 458 TREC и 32 KREC копий на 105 ядросодержащих клеток), которые можно рассматривать как отправную точку для организации программ неонатального скрининга ПИД, базирующихся на анализе количества TREC/KREC в крови новорожденных.
3. Валидация предложенного метода количественного анализа TREC и KREC на образцах крови пациентов с ТКИН и агаммаглобулинемией показала высокую диагностическую эффективность. Анализ TREC для выявления ТКИН – AUC=0,975 (ДИ95% 0,945 – 0,991), SE – 97,50%, SP – 100,0%, cut-off < 94 копий
TREC/105 лейкоцитов; анализ KREC для выявления агаммаглобулинемии - AUC=0,996 (ДИ95% 0,973 - 1,000), SE - 95,65%, SP - 100,0%, cut-off < 12 копий KREC/105 лейкоцитов.
4. Скрининг на основе анализа TREC/KREC эффективен для выявления пациентов с синдромами Луи-Бар (TREC AUC=0,984 (0,957 - 0,996) TRECn-D < 318, SE=91,9% и SP=97,2%; KREC AUC=0,961 (0,926 - 0,983) KRECn-D < 230, SE=86,5% и SP=96,6%) и Ниймеген (TREC AUC=0,980 (0,950 - 0,995) TRECn-D < 209, SE=93,33% и SP=95,32%; KREC AUC=0,881 (0,828 - 0,923) KRECn- D < 85, SE=80,0% и SP=97,66%). Несмотря на меньшую диагностическую чувствительность в изолированном варианте, дополнительная квантификация KREC может увеличивать чувствительность скрининга. В динамике, в течение нескольких лет, значения TREC и KREC могут стабильно сохраняться на уровне ниже референсных значений.
5. Cкрининг на основе анализа TREC позволяет выявлять значимые количество пациентов с синдромами ДиДжоржи и Дауна, не информативен для пациентов с общим вариабельным иммунодефицитом, гипер-IgM синдромом, избирательным дефицитом иммуноглобулина A.
6. Впервые охарактеризованы в отношении количества TREC пациенты с болезнью Кавасаки. Несмотря на описанный ранее дисбланс субпопуляций Т-клеток, содержание TREC в крови этих пациентов не отличается от популяционного контроля и не может являться диагностическим маркером (AUC=0,533 (0,459 - 0,606).
7. Количество TRECn (AUC=0,822 (CI95%: 0,752 - 0,879) TRECn-D<528, SE=91,67% и SP=63,12%, р < 0,0001) лучше предсказывает летальный исход у критически больных детей на первом году жизни, чем ПКТ (AUC=0,788 (CI95%: 0,714—0,850) Пороговый уровень > 2,62 SE=83,33% и SP=70,21%, р < 0,0001).
8. Экзомное секвенирование является новым эффективным подходом для изучения молекулярных механизмов гетерогенной группы пациентов с ОВИН, что было продемонстировано на примере пациента с таким диагнозом, для которого выявлено наличие гетерозиготной миссенс-мутации E1021K в гене PIK3CD, кодирующем p110d (c.3061G>A [p.E1021K]). Дальнейший скрининг 47 пациентов с диагнозом ОВИН и «ОВИН?», 39 пациентов с диагнозом гипогаммаглобулинемия или дефицит субклассов IgG и
10 пациентов с диагнозом гипер-IgM синдром показал, что данный тип мутации отсутствует в геномах исследуемых пациентов, что может свидетельствовать о меньшем распространении этой мутации в российской популяции по сравнению с европейскими.
Результаты сформулировать клинической аллергологов:
проведенного
практические лабораторной
исследования рекомендации
диагностики,
позволяют для врачей иммунологов-
Практические рекомендации
1) Количественный анализ TREC и KREC в образцах ДНК, выделенной из мононуклеарной фракции периферической крови и пятен крови на Гатри картах, рекомендуется для диагностики пациентов с тяжелыми комбинированными иммунодефицитами и агаммглобулинемией, а также для дифференциальной диагностики Т-клеточных и Т- и В-клеточных ПИД.
2) Количественный анализ TREC и KREC в образцах ДНК, выделенной из монуклеарной фракции периферической крови и пятен крови на Гатри картах, рекомендуется в качестве дополнительного теста для скрининга пациентов с синдромами Луи-Бар и Ниймеген.
3) Рекомендуется повторное проведение количественного анализа TREC и KREC с целью исключения ПИД для детей, попавших в инфекционную реанимацию, для увеличения специфичности теста.
Перспективы дальнейшей разработки темы
Перспективно исследовать возможность применения набора реагентов при других редких состояниях, связанных с изменением количества Т- и В-лимфоцитов, например, при гемофагоцитарном лимфогистиоцитозе и других. Важна разработка алгоритмов применения анализа для определения эффективности ВААРТ у взрослых пациентов.
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Первичные иммунодефицитные состояния (ПИД) представляют собой гетерогенную
группу врожденных нарушений иммунной системы, которые впервые были описаны Огденом
Брутоном (1908–2003) в 1950х годах при обследовании мальчика с рецидивирующими
инфекциями и агаммаглобулинемией [156]. К настоящему времени выявлен широкий спектр
клинических проявлений ПИД, являющихся следствием высокопенетрантных мутаций в более
чем 300 генах [363]. Для больных с ПИД характерна предрасположенность к инфекционным
заболеваниям, в связи с чем отсроченная постановка диагноза у таких больных приводит к
значительным осложнениям и связанной с ними повышенной тяжести заболевания и
смертности. ПИД представлены спектром клинических фенотипов и обусловлены различными
патофизиологическими механизмами [33, 47, 120, 182, 358]. За последние годы из крайне
редких заболеваний с дебютом в раннем возрасте ПИД концептуально превратились в
относительно распространенные 1:10000 заболевания нарушенного контроля за иммунным
гомеостазом, которые могут проявиться самой различной симптоматикой [113].
Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность (ТКИН) – группа генетически
детерминированных синдромов, в основе которых лежат молекулярные дефекты, приводящие к
нарушениям каскада иммунных реакций, процессов пролиферации, дифференцировки и
функций иммунокомпетентных клеток. При этих нозологических формах наблюдается низкое
количество или полное отсутствие Тлимфоцитов, снижение функции Влимфоцитов, а в
некоторых случаях и отсутствие функции натуральных киллеров. что ведет к ранним, крайне
тяжелым инфекциям вирусной, бактериальной и оппортунистической природы и, в отсутствие
патогенетической терапии, смерти в первые два года жизни [95]. ТКИН является неотложным
иммунологическим состоянием и требует быстрой диагностики и лечения. Последние данные
свидетельствуют о том, что результаты лечения пациентов значительно улучшаются, если
терапия с помощью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) проводится в
возрасте до 3,5 месяцев, до появления тяжелых инфекций и других осложнений [356]. Реально
это возможно осуществить только при раннем выявлении детей с ТКИН посредством
программы скрининга новорожденных. ТКИН удовлетворяет многим общепринятым
критериям для скрининга новорожденных – так называемым «критериям Уилсона и Юнгнера»,
опубликованным в 1968 году [448]. Данное состояние не имеет клинических проявлений при
рождении, но без лечения приводит к летальному исходу на первом году жизни. У детей с
ТКИН, получивших ТГСК до развития тяжелых инфекций, отмечается лучшее выживание, с
меньшими затратами на лечение, чем у тех, чье лечение было отсрочено.
ТКИН проявляется снижением или отсутствием Тлимфоцитов, и, таким образом,
скрининг новорожденных на Тклеточную лимфопению является идеальной стратегией для
выявления заболевания. Первая предложенная стратегия включала скрининг каждого
новорожденного с полным анализом крови для определения количества лимфоцитов [157],
который, как считалось, имел недостаточную чувствительность. Впоследствии рассматривался
также скрининг пуповинной крови на популяции Тклеток методом проточной цитометрии
[178]; однако, учитывая, что такой способ отнимает много времени и требует больших
финансовых затрат, были рассмотрены другие методы скрининга для выявления Тклеточной
лимфопении.
Эксцизионные кольца Тклеточного рецептора (TREC) представляют собой небольшие
кольцевые молекулы эписомальной ДНК, которые образуются во время реарранжировки генов
Тклеточного рецептора (TCR) в наивных Тклетках и, таким образом, являются суррогатными
маркерами для клеток недавних эмигрантов тимуса. TREC были впервые визуализированы в
тимоцитах мыши с помощью электронной микроскопии в качестве кольцевой внехромосомной
ДНК в 1982 году [454], а позднее было показано, что они являются продуктом перестройки
TCR [230]. Тест на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [77] для оценки количества
TREC был разработан Douek с соавт., которые продемонстрировали, что TREC специфичны для
наивных Тклеток [204]. В 2005 году Ки Чан и Дженнифер Пак впервые описали применение
теста с TREC для скрининга в крупномасштабном исследовании – популяционном скрининге на
ТКИН и другие формы Тклеточной лимфопении [170]. В настоящее время в США скрининг на
ТКИН проводится на регулярной основе и охватывает 92% американских детей [202, 470].
Также была описана возможность дополнительного скрининга с помощью эксцизионных
колец каппаделеционного элемента (KREC), позволяющих идентифицировать детей с
тяжелыми формами ПИД, проявляющимися Вклеточной лимфопенией. Мутации в ключевых
генах онтогенеза Влимфоцитов приводят к врожденном заболеваниям с дефицитом Вклеток,
примером которых являются Xсцепленная агаммаглобулинемия (XLA) (возникает в результате
мутации в гене BTK) и аутосомнорецессивные XLAподобные расстройства. Как и у Т
лимфоцитов гены, кодирующие рецептор у Вклеток, также подвергаются перестройке
вариабельных, разнообразных и соединяющихся доменов (V (D) Jрекомбинация) в ходе
созревания с тем, чтобы образовался уникальный Вклеточный рецептор к антигену. Этот
процесс завершается формированием функционального рецептора на поверхности В
лимфоцита и также эписомальной кольцевой ДНК, называемой Каппарекомбинационным
эксцизионным кольцом (KREC). В 2007 году van Zelm с соавт. описали этот процесс и
разработали анализ KREC на основе ПЦР [462]. В 2011 году Nakagawa с соавт. были первыми,
кто продемонстрировал возможность применения анализа KREC для выявления
новорожденных с Вклеточными дефектами, показав, что у пациентов с XLA отсутствуют
KREC в образцах цельной крови и картах Гатри [346].
Sottini с соавторами предложили одновременное определение TREC и KREC, но в
дуплексном варианте и только с использованием прибора 7500 FastRealTime PCR (Applied
Biosystems) [407]. Borte et al. в 2012 использовали систему Sottini et al., 2010 в триплекном
варианте [152]. Однако в своей работе авторы не описали многие аналитические
характеристики предложенного метода (например, нижние пределы детекции и измерений),
несмотря на заявляемые низкие пороговые уровни отсечения измеряемых аналитов – 15
TREC/мкл и 10 KREC/мкл – для скрининга врожденных иммунодефицитов. Кроме того,
имеющаяся в литературе информация о диагностической значимости одновременного
выявления TREC и KREC остается неполной и, в некоторых случаях, даже противоречивой.
Описанная авторами система не может быть использована без дальнейшего ее улучшения и
адекватной характеризации.
Таким образом, можно заключить, что разработка высокочувствительного метода для
одновременного определения концентрации TREC и KREC как в образцах ДНК из
периферической крови, так и ДНК, полученной из сухих пятен крови, собираемых в ходе
национальной программы скрининга новорожденных, является актуальной задачей, имеющей
важное научнопрактическое значение.
Цель настоящей работы:
Разработать и валидировать анализ TREC и KREC для диагностики первичных
иммунодефицитных состояний.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Разработать и валидировать метод проведения мультиплексной полимеразной цепной
реакции в режиме «реального времени» для количественного анализа молекул ДНК TREC и
KREC, а также однокопийного нормировочного локуса в геноме человека. Определить его
аналитические характеристики.
2. Оценить эффективность различных протоколов выделения ДНК из сухих пятен крови
новорожденных из карт Гатри, их совместимость с предложенным методом определения
молекул ДНК TREC и KREC.
3. Определить референсные интервалы значений TREC и KREC на популяционной
выборке сухих пятен крови новорожденных на картах Гатри.
4. Провести оценку диагностических характеристик разработанного набора реагентов с
использованием коллекций образцов от пациентов с подтвержденными диагнозами ТКИН и
агаммаглобулинемия.
5. Охарактеризовать значения TREC и KREC у пациентов разного возраста с
синдромами Ди Джорджи, повреждения Ниймегена, атаксией телеангиэктазией (ЛуиБар),
Кавасаки, Дауна, с общим вариабельным иммунодефицитом, гиперIgM синдромом,
избирательным дефицитом иммуноглобулина A.
6. Охарактеризовать информативность прогноза смертности у детей с тяжелыми
состояниями на основе количественного анализа TREC/KREC.
7. У пациента со стабильным снижением количества TREC в цельной крови с
неуточненным диагнозом “ОВИН?” провести расшифровку молекулярной этиологии
заболевания с помощью экзомного секвенирования.
Научная новизна работы
В представленной работе проведена разработка нового высокочувствительного метода
для одновременного определения нормированной концентрации TREC и KREC в образцах ДНК
из венозной крови и сухих пятен крови для выявления иммунодефицитных состояний как у
новорождённых до клинической манифестации заболевания, так и у детей более старшего
возраста с целью диагностики различных иммунодефицитных состояний (ИДС), а также с
целью дифференциальной диагностики Т и Вклеточных ПИД от других типов ИДС.
Разработан полный протокол определения TREC и KREC в сухих пятнах крови на картах Гатри
с целью проведения неонатального скрининга ПИД. Проведено определение референсных
значений TREC и KREC, характерных для Российской популяции. Впервые показано, что
количество TREC может являться значимым предиктором летального исхода у критически
больных детей на первом году жизни. Также впервые проведен анализ значений TREC и KREC
при болезни Кавасаки. Разработанный в результате выполнения протокол определения
нормированной концентрации TREC и KREC в образцах ДНК человека лег в основу первого
получившего регистрационное удостоверение Росздравнадзора набора реагентов для
клинического использования.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанный протокол лабораторной диагностики ПИД позволяет проводить
рутинный скрининг с использованием описываемого в работе отечественный набора реагентов
для ранней диагностики ТКИН и других форм первичных иммунодефицитов у новорожденных.
Продемонстрированы высокие аналитические и диагностические характеристики
разработанного набора реагентов, позволяющего количественно оценивать тимопоэз в норме,
при комбинированных и изолированных Т и Вклеточных иммунодефицитных состояниях, при
критических состояниях в отделении реанимации. Данная работа является примером того,
каким образом должно быть выстроено лабораторное обследование в диагностике ПИД:
начиная от сухого пятна крови и заканчивая применением секвенирования следующего
поколения для постановки диагноза. Разработанный набор реагентов может применяться в
КДЛ, оснащенной стандартным оборудованием для проведения ПЦР в режиме реального
времени. Полученные в настоящем исследовании данные о снижении TREC (суррогатный
маркер количества наивных Тклеток) при сепсисе и других осложнениях инфекционного
процесса у детей могут являться отправной точкой для дальнейших фундаментальных
исследований особенностей ответа иммунной системы при таких типах тяжелых состояний
пациентов.
Методология и методы исследования
В работе применялись стандартные методы выделения ДНК, генной инженерии, ПЦР в
реальном времени, капельной ПЦР, а также различные методы статистической обработки
полученных данных в соответствии с типом анализируемых данных и проверяемой гипотезы.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанная тестсистема на основе метода мультиплексной полимеразной цепной
реакции в режиме «реального времени» для определения нормированного количества ДНК
TREC, KREC соответствует требованиям, предъявляемым к аналитическим характеристикам
клиникодиагностических тестов.
2. Референсные значения TREC и KREC в сухих пятнах крови на картах Гатри
определены по международным клиникодиагностическим стандартам и могут быть
использованы для программы неонатального скрининга ПИД в РФ.
3. Разработанный метод количественного анализа TREC и KREC имеет высокую
диагностическую эффективность для установления диагнозов тяжелая комбинированная
иммунная недостаточность и агаммаглобулинемия.
4. Использование метода количественного анализа TREC и KREC имеет клиническое
значение как для скрининга, так и для дифференциальной диагностики пациентов с синдромами
ЛуиБар, Ниймеген, Ди Джорджи и Дауна.
Личный вклад
Представленные в работе экспериментальные данные получены лично автором, либо
при его непосредственном участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Сбор образцов, систематизация данных, планирование экспериментов и самого дизайна набора
реагентов, экстракция нуклеиновых кислот, проведение анализа и его интерпретация
выполнялись автором лично. Оформление результатов и статистический обсчет выполнены
лично автором. Автор принимал непосредственное участие в подготовке публикаций.
Особую признательность автор выражает к.б.н. М.Л. Филипенко и сотрудникам
лаборатории Фармакогеномики ИХБФМ СО РАН, которые конструировали калибраторы для
разарботанного набора реагентов.
Иммунофенотипирование с помощью проточной цитометрии было выполнено врачами
КЛД Н.В. Давыдовой, А.С. Лебедевой и Д.Б. Акимовой.
Степень достоверности результатов
Достоверность полученных результатов исследования обеспечена обоснованностью
исходных теоретических позиций, статистически обоснованными объемами исследуемых
выборок, использованием современных лабораторных методов, воспроизводимостью
результатов исследований, применением адекватных статистических методов и критериев.
Объем выборки для определения референсных интервалов был выбран учетом распределения
значений аналита TREC и KREC, которое имеет значительную асимметрию и не соответствует
нормальному, и составил 2739 образцов сухих пятен крови. В параллели с методом «золотого
стандарта» проточной цитометрией с определением популяций лифоцитов CD3+, CD3+CD4+,
CD3+CD8+ и CD19+ было проведено 1533 исследования TREC и KREC у детей разного
возраста и с разными диагнозами, что позволило оценить характеристики разработанного
набора реагентов по отношению к результатам иммунофенотипирования.
Апробация
Результаты работы были представлены на конференциях: Объединенный
иммунологический форум, Нижний Новгород, 2013 г.; V Всероссийская с международным
участием школаконференция по клинической иммунологии «Иммунология для врачей»,
Пушкинские Горы, Псковская область, 2014 г.; The 16th Biennial Meeting of the European Society
for Immunodeficiencies (ESID 2014), Прага, 2014 г.;XX Всероссийская научнопрактическая
конференция «Достижения и перспективы развития лабораторной службы России», Москва,
2015 г.; The 17th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies (ESID 2016),
Барселона, 2016 г.; I междисциплинарная научная конференция «Аутоиммунные и
иммунодефицитные заболевания», Москва, 2016 г.; XVI Всероссийский научный форум с
международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт
Петербурге», СанктПетербург, 2017 г.; XVII ассамблея «Здоровье Москвы», Москва, 2018 г.;IV
московский городской Съезд педиатров с международным участием «Трудный диагноз» в
педиатрии. Междисциплинарный подход. Москва, 2018 г.;The 18th Biennial Meeting of the
European Society for Immunodeficiencies Лиссабон, Португалия, 2018 г.; Национальная
конференция «Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы»,
Москва, 2019 г.; X Конгресс НОДГО «Актуальные проблемы и перспективы развития детской
гематологиионкологии в Российской Федерации», Сочи, 2019 г.; Объединенный
иммунологический форум, Новосибирск, 2019 г.; ХIX Конгресс детских инфекционистов
России с международным участием, Москва, 2020 г.
Внедрение результатов исследования
Разработанный набор реагентов успешно прошел клинические испытания в ФГБУ
«ННПЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (лицензия на осуществление
медицинской деятельности от 28 декабря 2017 г. № ФС 9901009465. Письмо Федеральной
службы по надзору в сфере здравоохранения (Росздравнадзор) №0115607/14 от 29 июля 2014
года о включении клинической организации в Перечень медицинских организаций,
проводящих клинические испытания (исследования) медицинских изделий).
Получено регистрационное удостоверение №РЗН 2018/7447 на медицинское изделие
«набор реагентов для диагностики in vitro «БиТтест» для количественного определения ДНК
TREC и KREC методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по ТУ
21.20.23001176087752017».
Получено регистрационное удостоверение РКИМН5№017228, которое позволяет
использовать разработанный набор реагентов на территории Казахстана.
Различные аспекты диссертационной работы явились основанием для планирования
новых научных исследований. Разработанный набор реагентов был применен в научной работе
С.С. Дерябиной в лаборатории иммунологии воспаления ФГБУН Института Иммунологии и
Физиологии Уральского отделения РАН, по итогам работы защищена кандидатская
диссертация по специальности 14.02.09 клиническая иммунология, аллергология “Роль
количественного определения кольцевых участков ДНК Tклеточного и Bклеточного
рецепторов лимфоцитов в оценке функционирования иммунной системы новорожденных и
детей первого года жизни”. Результаты исследования внедрены в научноисследовательскую
работу лаборатории иммунологии воспаления Института иммунологии и физиологии УрО
РАН, г. Екатеринбург.
Разработанный набор реагентов был использован в научной работе И.В. Образцова на
базе отдела оптимизации лечения иммунодефицитов ФГБУ «НМИЦ детской гематологии,
онкологии и иммунологии им. Д. Рогачёва» Минздрава РФ, по итогам которой была защищена
кандидатская диссертация по специальности 14.03.09клиническая иммунология, аллергология
“Клиническое значение определения наивных Т и Вклеток у больных с опухолями иммунной
системы”. Предложено выполнение исследование уровня эксцизионных колец у детей в первом
остром периоде и в ремиссии ОЛЛ для оценки риска развития инфекционных осложнений в
интенсивной фазе лечения и для оценки восстановления созревания наивных Т и Вклеток на
этапе поддерживающей терапии.
Научные положения и практические рекомендации внедрены в клиническую практику
клиникодиагностического центра детской иммунологии и аллергологии и первого
педиатрического отделения (иммунология и аллергология) ГБУЗ “ДГКБ №9 им.
Г.Н. Сперанского ДЗМ”, а также в работу молекулярногенетической лаборатории МОНИКИ
им. М.Ф. Владимирского ДЗМО и НИИ Матери и Ребенка г. Кишинев, Молдова.
Результаты полученные в ходе диссертационного исследования используются в процессе
обучения врачей на циклах усовершенствования и профессиональной переподготовки врачей
ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени
И. М. Сеченова МЗ РФ (Сеченовский Университет).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 11
в рецензируемых научных изданиях, в которых должны быть опубликованы основные научные
результаты диссертации, 2 публикации в международных журналах, индексируемых в базах
данных Web of Science и Scopus, 1 патент.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка
процитированной литературы, приложений. Работа изложена на 264 страницах, содержит 72
рисунка и 67 таблиц. Список процитированной литературы включает 529 источников.
В настоящей работе нами был разработан простой метод определения нормированного
количества ДНК TREC, KREC, обладающий высокими аналитическими характеристиками, а
также сравнительно не высокой себестоимостью проведения анализа. Разработанный метод
показал высокую эффективность для диагностики пациентов с различными формами ПИД, был
адаптирован для практической процедуры неонатального скрининга и лег в основу набора
реагентов, получившего регистрацию для использования в диагностических целях в
клинических учреждениях.
Данную разработку в качестве положительного примера для увеличения возможностей
современной лабораторной диагностики приводит в своих работах главный внештатный
специалист по инфекционным болезням у детей, заведующая кафедрой детских инфекционных
болезней ГОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования, проф.
д.м.н. Л.Н. Мазанкова [65]. Внедрения неонатального скрининга на ПИД ожидают не только
специалисты, но и пациентские организации, осознающие значимость анализа TREC/KREC в
сухих пятнах крови [524]. Дальнейшие исследования возможности автоматизации данного типа
лабораторных исследований должны сделать неонатальный скрининг в РФ повседневной
реальностью.
Однако потенциал предложенного инструмента оценки статуса иммунной системы не
ограничивается только первичными иммунодефицитными состояниями. Доступность реагентов
для надежного количественного анализа TREC (в том числе, разработанных в данной работе и
зарегистрированных для клинического применения) должна стимулировать исследования
возможности его применения для вторичных иммунодефицитов, среди которых пациенты со
СПИД, другими инфекционными и онкологическими заболеваниями. Таким образом, можно
ожидать дальнейшего более широкого влияния результатов представленной нами работы на
фундаментальные и диагностические аспекты иммунной системы при различных заболеваниях
человека.
ВЫВОДЫ
1. Разработанный нами метод мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме
«реального времени» для количественного анализа молекул ДНК TREC, KREC, гена альбумина
показал приемлемые аналитические характеристики (специфичность – 100%, LОD (95%) для 3
мишеней 5 копий на реакцию, LОQ (95%) для 3 мишеней 10 копий на реакцию, высокую
робастность), позволяющие применить его в клиникодиагностической практике.
2. С использованием разработанного метода нами определены референсные значения
TREC и KREC в сухих пятнах крови на картах Гатри (медианы полученных нормированных
значений для TREC 2780 (CI95%: 26902840), для KREC 2790 (CI95%: 27002900) копий на
105 ядросодержащих клеток; нижние границы (99.9% референсный интервал) – 458 TREC и 32
KREC копий на 105 ядросодержащих клеток), которые можно рассматривать как отправную
точку для организации программ неонатального скрининга ПИД, базирующихся на анализе
количества TREC/KREC в крови новорожденных.
3. Валидация предложенного метода количественного анализа TREC и KREC на
образцах крови пациентов с ТКИН и агаммаглобулинемией показала высокую
диагностическую эффективность. Анализ TREC для выявления ТКИН AUC=0,975 (ДИ95%
0,945 0,991), SE 97,50%, SP 100,0%, cutoff < 94 копий TREC/105 лейкоцитов; анализ KREC
для выявления агаммаглобулинемии AUC=0,996 (ДИ95% 0,973 1,000), SE 95,65%, SP
100,0%, cutoff < 12 копий KREC/105 лейкоцитов.
4. Скрининг на основе анализа TREC/KREC эффективен для выявления пациентов с
синдромами ЛуиБар (TREC AUC=0,984 (0,957 0,996) TRECnD < 318, SE=91,9% и SP=97,2%;
KREC AUC=0,961 (0,926 0,983) KRECnD < 230, SE=86,5% и SP=96,6%) и Ниймеген (TREC
AUC=0,980 (0,950 0,995) TRECnD < 209, SE=93,33% и SP=95,32%; KREC AUC=0,881 (0,828
0,923) KRECnD < 85, SE=80,0% и SP=97,66%). Несмотря на меньшую диагностическую
чувствительность в изолированном варианте, дополнительная квантификация KREC может
увеличивать чувствительность скрининга. В динамике, в течение нескольких лет, значения
TREC и KREC могут стабильно сохраняться на уровне ниже референсных значений.
5. Cкрининг на основе анализа TREC позволяет выявлять значимые количество
пациентов с синдромами ДиДжоржи и Дауна, не информативен для пациентов с общим
вариабельным иммунодефицитом, гиперIgM синдромом, избирательным дефицитом
иммуноглобулина A.
6. Впервые охарактеризованы в отношении количества TREC пациенты с болезнью
Кавасаки. Несмотря на описанный ранее дисбланс субпопуляций Тклеток, содержание TREC в
крови этих пациентов не отличается от популяционного контроля и не может являться
диагностическим маркером (AUC=0,533 (0,459 0,606).
7. Количество TRECn (AUC=0,822 (CI95%: 0,752 0,879) TRECnD<528, SE=91,67% и
SP=63,12%, р < 0,0001) лучше предсказывает летальный исход у критически больных детей на
первом году жизни, чем ПКТ (AUC=0,788 (CI95%: 0,714—0,850) Пороговый уровень > 2,62
SE=83,33% и SP=70,21%, р < 0,0001).
8. Экзомное секвенирование является новым эффективным подходом для изучения
молекулярных механизмов гетерогенной группы пациентов с ОВИН, что было
продемонстировано на примере пациента с таким диагнозом, для которого выявлено наличие
гетерозиготной миссенсмутации E1021K в гене PIK3CD, кодирующем p110d (c.3061G>A
[p.E1021K]). Дальнейший скрининг 47 пациентов с диагнозом ОВИН и «ОВИН?», 39 пациентов
с диагнозом гипогаммаглобулинемия или дефицит субклассов IgG и 10 пациентов с диагнозом
гиперIgM синдром показал, что данный тип мутации отсутствует в геномах исследуемых
пациентов, что может свидетельствовать о меньшем распространении этой мутации в
российской популяции по сравнению с европейскими.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Результаты проведенного исследования позволяют сформулировать практические
рекомендации для врачей клинической лабораторной диагностики, иммунологоваллергологов:
1) Количественный анализ TREC и KREC в образцах ДНК, выделенной из
мононуклеарной фракции периферической крови и пятен крови на Гатри картах, рекомендуется
для диагностики пациентов с тяжелыми комбинированными иммунодефицитами и
агаммглобулинемией, а также для дифференциальной диагностики Тклеточных и Т и В
клеточных ПИД.
2) Количественный анализ TREC и KREC в образцах ДНК, выделенной из
монуклеарной фракции периферической крови и пятен крови на Гатри картах, рекомендуется в
качестве дополнительного теста для скрининга пациентов с синдромами ЛуиБар и Ниймеген.
3) Рекомендуется повторное проведение количественного анализа TREC и KREC с
целью исключения ПИД для детей, попавших в инфекционную реанимацию, для увеличения
специфичности теста.
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
5 (21 отзыв)
4.8 (17 отзывов)
5 (8 отзывов)
4.8 (211 отзывов)
5 (174 отзыва)
5 (22 отзыва)
5 (1241 отзыв)
4.9 (343 отзыва)
5 (9 отзывов)
