Разработка методов криоконсервации спермы трутней для сохранения генофонда Apis mellifera L.

2.1 Материалы и методы исследования

Исследования по теме диссертационной работы выполняли с 2013 по
2020 гг. Общая схема исследований представлена на рисунке 1. Объекты
исследований – трутни, пчелиные матки. Материалом исследований была
сперма трутней серой горной кавказской породы, породного типа
“Приокский” среднерусской породы и породы пчел карника. С 2013 по 2016
гг. в ФНЦ пчеловодства проводили исследования по выявлению
оптимальных условий воспроизводства половозрелых трутней породного
типа «Приокский» среднерусской породы пчел (способ одновременного
выращивания трутней и неплодных маток в пчелиной семье-
воспитательнице). Изучали функциональные показатели (концентрация,
подвижность и активность ферментов сперматозоидов дегидрогеназ)
половозрелых трутней разного возраста (17, 22 и 30 сут.). С 2017 по 2018 гг.
анализировали качество спермы трутней после 5 летней консервации в
жидком азоте, заложенной на криохранение в 2013 г., а также 7 и 25 летней
консервации из криобанка ФНЦ пчеловодства («Приокский» породный тип).

Рисунок 1 – Общая схема проведения исследований
С 2018 по 2019 гг. изучали способы хранения спермы трутней серой горной
кавказской (КОСП, г. Сочи) и породы пчел карника («ППХ Майкопское», г.
Майкоп) без криоконсервации (в течение 30, 60 сут. при 3 ºС; 24 – 26 ºС).
Также, исследовали репродуктивные показатели пчелиных маток после
инструментального осеменения спермой разных способов ее сохранения. С
2019 по 2020 гг. в ФНЦ пчеловодства проводили испытание различных
разбавителей и криопротекторов для длительного хранения спермы трутней в
жидком азоте (серая горная кавказская и порода пчел карника, «Приокский»
породный тип).
Криоустойчивость спермы трутней в средах и пчелином меде. В
период активного сезона 2019 г. проводили испытание следующих сред для
криоконсервации спермы трутней: группа 1 (контроль) – среда С46 рН 7,2
(ФГБНУ «ФНЦ – ВНИИЭВ им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН);
группа 2 – Lonza Insect-XPRESSTM рН 6,1 (Sartorius Stedim, Belgium); группа 3
– Schneider’s Drosophila Medium c L-глутамином рН 4,6 (Thermo Fisher, USA);
группа 4 – Grace’s Insect Medium (2x) рН 6,3 (Thermo Fisher, USA); группа 5 –
JPL-41 Insect Medium c хлоридом кальция, бикарбонатом натрия и без L-
глутамина рН 5,9 – 6,5 (ФГБНУ «ФНЦ – ВНИИЭВ им. К.И. Скрябина и Я.Р.
Коваленко РАН»). В качестве криопротектора использовали 10% ДМСО. По
рекомендациям производителей сред, антибиотики для обработки против
бактериальной контаминации не применяли. Свежеотобранную сперму
смешивали со средой в соотношении 5 : 3 (25 мкл спермы : 15 мкл среды) по
методике Hopkins B.K. (2012). Было подготовлено 25 образцов по 40 мкл
разбавленной спермы в стерильных криопробирках Nunc (1,0 мл.).
Эквилибрацию подготовленных образцов проводили при температуре 3 °С в
бытовом холодильнике LG в течение 1 ч. После эквилибрации осуществляли
криоконсервацию образцов по методике Какпакова В.Т. (Г. Пинаев, М.
Богданова, 2008).
С целью изучения криоустойчивости спермы в натуральном пчелином
меде использовали мед с акации белой (г. Майкоп, Респ. Адыгея, урожай
2018 г.). В 100 г меда с белой акации содержится 78% углеводов (фруктоза,
глюкоза, сахароза). Мед имеет рН 6,0. Он долго не кристаллизуется, богат
флавоноидами, обладающими антиоксидантными свойствами. Этот мед
содержит соединения необходимые для производства и медленного
выделения небольшого количества перекиси водорода.
Мед испытывали в концентрированном виде (90% – 100%) и в
разбавленном (10%) по методике П.П. Печникова и П.Н. Скаткина (1949).
Для исследований криоустойчивости в конц. меде использовали
неразбавленную сперму после длительного охлаждения в течение 3 мес. при
температуре 3 °С в бытовом холодильнике LG. Было подготовлено 15
образцов по 90 мкл разбавленной спермы (10 мкл охлажденной спермы : 80
мкл разбавителя). В случае применения концентрированного меда
испытывали следующий вариант разбавителя – 100% мед 50 мл, лактоза 10
мг, сахароза 10 мг, яичный желток 2,5 мл (опытная группа М). Медовый
разбавитель испытывали в разных комбинациях: с метанолом 10% (6 мл 250
мкл) – группа ММ, этанолом 10% (6 мл 250 мкл) – группа МЭ, ДМСО 10%
(5,0 мл) – группа МД и глицерином 3% (6 мл 250 мкл) – группа МГ.
Концентрацию ионов водорода в готовом разбавителе доводили 6M NaOH до
значений рН 8 – 9. Подготовленные образцы разбавленной спермы
размещали в сосуде объемом 2 л, наполненным водой комнатной
температуры (24 – 25 °С). Затем сосуд помещали в холодильник на 2 ч для
эквилибрации при 3 °С. Криоконсервацию осуществляли по выше указанной
методике.
В период активного сезона 2020 г. испытывали модифицированный
медовый разбавитель по П.П. Печникову и П.Н. Скаткину (1949). Было
подготовлено 15 образцов по 90 мкл разбавленной спермы (10 мкл
свежеотобранной спермы : 80 мкл разбавителя). Состав: мед 10% – 50 мл,
лактоза – 10 мг, сахароза 10 мг, яичный желток – 2,5 мл. Разбавитель
испытывали в комбинациях с глицерином 3% (6 мл 250 мкл) – группа МГ и
ДМСО 10% (5 мл) – группа МД. Рабочий раствор 10% меда готовили на
деионизированной воде. Концентрацию ионов водорода в готовом
разбавителе доводили 6M NaOH до значений рН 8 – 9. Эквилибрацию и
криоконсервацию осуществляли по выше указанной методике.
Оттаивание образцов спермы, замороженных в средах проводили на
водяной бане при 34 ºС в течение 10 с; образцов, замороженных в пчелином
меде при 37 ºС в течение 20 – 30 с.
Консервация спермы трутней в охлажденном состоянии. Для
хранения спермы в разбавленном состоянии использовали следующие среды:
С46 – группа 2, Lonza Insect-XPRESSTM – группа 3, Grace’s Insect Medium (2x) –
группа 4 и Schneider’s Drosophila Medium c L-глутамином – группа 5. Было
заготовлено 12 образцов разбавленной спермы по 30 мкл (15 мкл
свежеотобранной спермы : 15 мкл среды) и 3 образца неразбавленной спермы
по 15 мкл (контроль охлажденная – группа 1). Подготовленные образцы
разбавленной спермы закладывали на хранение по методике B. Hopkins
(2010) в стерильные стеклянные капилляры L = 75 ± 1,0 мм, d = 1,8 ± 0,2 мм
(ООО «МиниМед», Россия). Исследования проводили в двух температурных
режимах: при 3 ºC в бытовом холодильнике LG и комнатной температуре 24 –
26 ºС.
Качественные показатели пчелиных маток, инструментально
осемененных спермой разных способов консервации. Применяли
однократное осеменение с объемом вводимой спермы: заморожено-
оттаянной – 10 мкл, охлажденной 4 – 8 мкл. Репродуктивные показатели
маток оценивали по срокам начала яйцекладки, количеству печатного
расплода. Маток, инструментально осемененных охлажденной спермой,
оценивали только по физиологическим показателям (М. Bieńkowska, et al.,
2008): наличие спермы в парных яйцеводах матки по истечении 48 ч после
осеменения и концентрации сперматозоидов в семяприемнике.
Оценка качества заморожено-оттаянной и охлажденной спермы. В
период исследований с 2017 по 2018 гг. дифференциацию живых и мертвых
сперматозоидов проводили методом флуоресцентной микроскопии по
методике S. Locke, Y. Peng, (1990) с использованием флюорохромов Hoechst
33258 (Н3258) и PI. В период исследований с 2019 по 2020 гг.
жизнеспособность сперматозоидов оценивали методом флуоресцентной
микроскопии по методике R. Johuson (2013) с использованием набора по
определению жизнеспособности LIVE/DEADTM Sperm Viability Kit L 7011
(флюорохромы SYBR-14 и PI). Подвижность заморожено-оттаянной и
охлажденной спермы оценивали по методике O. Kaftanoglu и Y. Peng (1984) в
пяти полях зрения при увеличении 400× на биологическом световом
микроскопе Leica и Альтами-ЛЮМ 1 LED. Бальная оценка от 0 – 5: 0 –
подвижность отсутствует, 1 – 20 % подвижных спермиев, 2 – 40 %, 3 – 60 %,
4 – 80 %, 5 – ≥ 95 %. Для изучения морфологических параметров
сперматозоидов использовали набор дифференциального окрашивания Diff
Quick (НПФ «АБРИС+», Россия).
Изучение качественных показателей половозрелости трутней. Для
получения трутней определенного происхождения и возраста в отцовские
пчелиные семьи ставили трутневый сот в рамочном изоляторе из
разделительной решетки. После выхода из ячеек их метили перманентным
маркером фирмы «POSСA». По достижении трутнями возраста 17, 22 и 30
сут. осуществляли отбор спермы в соответствии с технологией
инструментального осеменения пчелиных маток путем искусственной
стимуляции выворачивания эндофаллоса (А. Бородачев, В. Бородачева,
1989). Сперму трутней оценивали по показателям концентрации (J. Rhodes,
2008) в счетной камере Горяева, подвижности (S. Locke, Y. Peng, 1993) и
активности дегидрогеназ по Н. Шергину (B. Милованов, 1962).
Оценка способа воспроизводства трутней. Исследования по
одновременному выращиванию трутней и неплодных маток в пчелиных
семьях-воспитательницах проводили в соответствии с «Методическими
указаниями к постановке эксперимента в пчеловодстве» (РАСХН, 2000) и
«Методами проведения научно-исследовательских работ в пчеловодстве»
(НИИП, 2002). Метод оценивали по показателям массы суточных трутней и
массы суточных неплодных маток. Массу определяли на электронных
лабораторных весах GR-200 с пределом взвешивания от 0,01 – 210 г.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Влияние сред, яичного желтка и пчелиного меда на
криоустойчивостьспермытрутней.Дляувеличениясроков
переживаемости сперматозоидов и сохранения их оплодотворяющей
способности, требуется снижение метаболических процессов сперматозоидов
во время их хранения. С этой целью испытывали протективные среды с рН
4,6 – 7,2, предохраняющих сперматозоиды от преждевременного
повреждения внешними силами или разрушения их в ходе расточительного
обмена веществ. В ходе предварительной оценки испытываемых сред
выявилось их положительное действие, на физиологическое состояние
сперматозоидов. Электролитный состав, рН, осмотическое давление сред и
др. оказались удовлетворительными для сперматозоидов трутней на
начальном этапе исследований. Было отмечено, что в образцах с ДМСО,
сперматозоиды чаще совершали прямолинейное поступательное движение.
После эквилибрации разбавленной спермы произошло незначительное
снижение ее жизнеспособности, за исключением опытных образцов группы 4
(Таблица 1).

Таблица 1 – Показатели качества разбавленной спермы после эквилибрации
РазбавительПоказатели качества
Жизнеспособность, %Подвижность, баллСперматозоиды с
аномальной морфологией
(дефекты головок), %
с ДМСОс ДМСОс ДМСО
М±mМ±m
группа 167,4 ± 5,1b4,520,1 ± 4,2b
(контроль)
группа 264,6 ± 7,34,025,8 ± 5,4a
группа 373,2 ± 0,34,040,1 ± 7,3cad
группа 489,8 ± 0,6eb4,036,7 ± 2,1
группа 581,7 ± 0,64,028,4 ± 6,3d
аdcad
– достоверные различия при р < 0,01, - р < 0,001, eb – р ≤ 0,05 Возможно, для образцов группы 4 требовалось дополнительное время дляуравновешиванияконцентрационныхградиентов. После непродолжительного хранения разбавленной спермы в жидком азоте, физиологические показатели сперматозоидов кардинально изменились (Таблица 2). Таблица 2 - Показатели качества заморожено-оттаянной спермы после 7 сут. криохранения РазбавительПоказатели качества Жизнеспособность,Подвижность,Сперматозоиды с %балланомальной морфологией (дефекты головок), % с ДМСОс ДМСОс ДМСО М±mМ±m группа 155,1 ± 2,5b4,023,8 ± 1,5b (контроль) группа 239,9 ± 0,3ab2,036,0 ± 1,7 группа 336,5 ± 1,8db2,044,3 ± 2,4db группа 438,2 ± 0,7cb3,538,4 ± 2,7 группа 538,4 ± 0,8eb4,036,2 ± 3,1 acde - достоверные различия при р < 0,01 Плазматическая мембрана сперматозоидов, разбавленных в средах с рН 4,6 – 6,5 подверглась наибольшему воздействию условий криохранения. Контрольные образцы, разбавленные в среде с рН 7,2 (С46) достоверно надежно были защищены от агрессивных условий хранения в жидком азоте. Добавление пчелиного меда в состав разбавителей для криоконсервации значительно улучшает подвижность сперматозоидов после оттаивания, целостность их мембран и акросом, а также снижает количество аномалий в морфологии сперматозоидов у лошадей, быков, буйволов, коз, баранов, крыс и мышей, рыб и человека. В диапазоне температур - 42 до - 51 °С мед превращается в твердое аморфное вещество без кристаллов льда (Kantor Z., et al., 1999). Мед способствует связыванию свободных вод в сперматозоидах во время замораживания. Использование в собственных исследованиях метанола, этанола и глицерина в составе разбавителя для замораживания спермы трутней связано с экспериментальным поиском альтернативы ДМСО. Криоконсервация на основе метанола способствует значительному улучшению подвижности сперматозоидов рыб после замораживания-оттаивания (J. Herranz-Jusdado et al., 2019). Использование этилового спирта в составе среды для замораживания спермы хряка увеличивает абсолютный показатель живучести сперматозоидов на 34 - 41% (T. Епишина, 2011). Результаты исследований криоустойчивости спермы трутней в натуральном пчелином меде выявили его криопротективные свойства (Таблица 3). Таблица 3 - Показатели качества спермы до и после криоконсервации в течение 7 сут. в конц. пчелином меде РазбавительПоказатели качества Жизнеспособность, %Подвижность, балл до криоПосле оттаиваниядо криоПосле оттаивания соломинапробиркасоломина пробирка М±mМ±mМ±m группа М45,3 ± 1,6 25,5 ± 3,4 37,2 ± 0,5cab0,51,03,0 b группа МГ51,5 ± 2,1 41,2 ± 2,378,0 ± 1,40,52,04,0 a группа МД40,5 ± 4,5 26,5 ± 1,879,6 ± 1,20,51,04,0 dab группа МЭ42,5 ± 3,8 26,9 ± 2,0 28,5 ± 0,90,51,01,0 eab группа ММ45,0 ± 2,5-*27,7 ± 0,60,5-*2,0 сdeab * - потеря образца;- достоверность различий при р < 0,01 Мед в сочетании с глицерином 3% или ДМСО 10% обеспечил самую высокую защиту жизненного ресурса спермы трутней медоносной пчелы в сравнении с синтетическими средами. Слабая подвижность сперматозоидов до замораживания связана, по всей видимости, с общим состоянием спермы, находившейся до момента исследований в мезабиозе, то есть состоянии глубокого охлаждения в течение 3 мес. Инструментальное осеменение маток не привело к ожидаемому результату. Из 10 осемененных пчелиных маток выжила только одна, которая дала потомство рабочих пчел менее 50%. Причиной могло послужить наличиебольшогоколичествапримесей,содержащихсяв концентрированном меде. Возможно, эти примеси оказали негативное влияние на физиологическое состояние пчелиных маток после осеменения. Применение же 10% медового разбавителя, напротив, привело исследованиякположительномурезультату.Жизнеспособность сперматозоидов в ходе испытаний оставалась на достаточно высоком уровне, особенно в образцах с глицерином. Однако подвижность спермиев заметно снижалась во время криоконсервации (Таблица 4). Испытания глицерина, в качестве криопротектора для спермы трутней медоносных пчел, проводились ранее отечественными и зарубежными исследователями. Таблица 4 - Основные показатели качества спермы трутней до и после криохранения в 10% медовом разбавителе ИсследуемыНаименование разбавителя егруппа МДгруппа МГ показателидопосле 15 после 20черездопосле 15 после 20через эквилмин. при мин. присут.эквилмин. при мин. присут. .-40-50-196 °Спосле-40-50 °С -196 °Спосле °Скриокрио М±mМ±mМ±mМ±mМ±mМ±mМ±mМ±m Общая> 9046,5 ±0,7 28,4 ±6,720,4> 9051,3 ±7,75отсутствотсутс
подвижност±1,9уеттвует
ь, %
Активная> 5022,7 ±1,346,218,7> 5058,5 ±0,9отсутствотсутс
подвижност±1,4уеттвует
ь, %
Жизнеспосо94,097,6572,7 ±1,370,697,2 ±95,1583,9 ±86,8 ±
бность, %±0,3±0,55±6,20,2±1,950,89,3

Какпаков В.Т. с соавт. (1993) в среде С46 с 10% глицерина в сходных
условиях замораживания обнаружили очень низкую подвижность
сперматозоидов. Hopkins B.K. et al. (2010), испытывая глицерин в
концентрации от 8 – 11,8%, также установили низкую жизнеспособность
(35%) сперматозоидов еще до замораживания. По этой причине нами
исходно была определена концентрация глицерина 3% для собственных
исследований. ДМСО в концентрации менее 10% не проявляет
криофилактических свойств, а в концентрации 15% уже значительно снижает
жизнеспособность сперматозоидов (B. Hopkins, C. Herr, 2010).
По результатам проведенного анализа, было принято решение об
инструментальном осеменении пчелиных маток заморожено-оттаянной
спермой из образцов с ДМСО.

3.1.1 Качественные показатели пчелиных маток, инструментально
осемененных заморожено-оттаянной спермой на основе 10% медового
разбавителя. Осеменили маток в количестве 6 шт. Применяли однократное
осеменение с объемом вводимой спермы 10 мкл. Прием маток пчелиными
семьями составил 100%. В ходе эксперимента одна матка погибла, а две из
пяти оставшихся, дали потомство рабочих пчел более 50% (Таблица 5).
В пчелиной семье с маткой №4 выявлен каннибализм. Причиной
послужило недостаточное количество рабочих пчел в семье, способных
своевременно пополнить кормовые запасы гнезда свежим углеводным и
белковым кормом.

Таблица 5 – Репродуктивные показатели маток, инструментально
осемененных заморожено-оттаянной спермой в составе 10% медового
разбавителя
№Количество ячеек Количество ячеек %,печатного Примечание
маткипечатногопечатногорасплода
расплода рабочих расплода трутней, рабочих пчел
пчел, шт.шт.
1429031,8-
218471699,14-
34761796,55-
4отдельные яйца и открытый расплоднаблюдался
каннибализм
пчел
521016,6небольшая масса
пчел в
микронуклеусе
6нет данныхнет данных-погибла через 48
ч после
осеменения

3.2 Жизнеспособность сперматозоидов, замороженных в среде С46
после длительного хранения в жидком азоте. С целью выполнения
поставленной задачи в период активного сезона 2013 г. нами было
заготовлено пять образцов криоконсервированной спермы в криосоломинах с
объемом разбавленной спермы по 30 мкл каждая. Для оценки качества
спермы после 7 и 25 лет криохранения использовали два образца 2011 г. и
два образца 1993 г. закладки на хранение из криобанка НИИ пчеловодства.
Сперма хранилась в криопробирках Nunc (1,8 мл) с объемом разбавленной
спермы 750 мкл каждый образец.
Оттаивание образцов проводили в водяной бане при температуре 34 ºС
в течение 10 с. По истечении 10 с пребывания в водяной бане, полное
оттаивание спермы произошло только в образце 2013 г. В остальных пробах
лед полностью растаял не через 5 мин., как было установлено ранее (А.
Бородачев, О. Кабашова, 2007), а лишь спустя 10 мин. с момента оттаивания.
При этом все исследуемые образцы, обладали достаточно высокой
жизнеспособностью сперматозоидов (Рисунок 2).
Более высокие показатели жизнеспособности 93% были в пробе
спермы, наиболее длительно хранившейся в жидком азоте (25 лет), это
свидетельствует о том, что длительность криохранения не влияет на этот
показатель.
Жизнеспособность, %70
30
5 лет (n = 5)7 лет (n = 2)25 лет (n = 2)
Срок криохраннения спермы

Рисунок 2 – Зависимость жизнеспособности сперматозоидов от сроков
хранения в жидком азоте (р ˂ 0,05)

3.2.1 Качественные показатели пчелиных маток, инструментально
осемененных заморожено-оттаянной спермой на основе среды С46.
Применяли однократное осеменение с объемом вводимой спермы 8 мкл.
Результаты инструментального осеменения маток представлены в таблице 6.

Таблица 6 – Результаты инструментального осеменения пчелиных маток
заморожено-оттаянной спермой разных сроков криохранения
ГодДата осемененияВыживаемостьПрием матокНачало
криоконсервацииматок послепослеяйцекладки
пробы спермыосеменения, %осеменения,после
%осеменения,
сут.
2011 г.7.06100898 – 10
(n = 9)
1993 г.15.061009014 – 17
(n = 10)
Свежеотобранная22.06 – 13.07100835 – 14
сперма (контроль)(n = 22)

По результатам оценки репродуктивных показателей осемененных
маток, количество печатного расплода рабочих пчел составило менее 50%,
что говорит о низкой оплодотворяющей способности спермы. Более
продолжительный временной интервал от осеменения до начала яйцекладки
имели пчелиные матки, осемененные спермой образца 1993 г. Данное
обстоятельство свидетельствует о массовых морфофункциональных
изменениях в структуре сперматозоидов, вследствие длительного хранения в
жидком азоте, а также об индивидуальных физиологических особенностях
инструментально осемененных пчелиных маток.
В целом, результаты исследований продемонстрировали саму
возможность сохранения спермы трутней в жидком азоте в течение 25 лет.
Дальнейшие разработки по совершенствованию среды С46, режима
замораживания и оттаивания позволят усовершенствовать данную методику.

3.3 Сохранение спермы трутней в охлажденном состоянии.
Анализ состояния работ отечественных и зарубежных исследователей
указывает на возможности сохранения спермы трутней при положительных
температурах. Одно из перспективных направлений – это поиск разбавителя
для сперматозоидов и оптимального температурного режима хранения. На
сегодняшний день, известны результаты хранения спермы при 4 °С (Л.
Лазарева, 2014), 10 – 15 °С (А. Бородачев, В. Бородачева, 1977), 14 °С (В.
Hopkins, et al., 2017), 16 °С и 22 °С (W. Skowronek, J. Szymula, 1998), 12 °С и
25 °С (A. Collins, 2000). Сохранение спермы в охлажденном состоянии
позволяет значительно снизить финансовые затраты во время селекционной
работы, вызванные использованием дорогостоящего оборудования для
криоконсервации и одновременно с этим получать более качественный
племенной материал.
В ходе собственных исследований нами установлен оптимальный
режим хранения неразбавленной спермы в охлажденном состоянии при 3 °С.
Результаты исследований представлены в таблице 7.
Между концентрацией сперматозоидов в семяприемнике маток и
количеством оплодотворенных яиц, откладываемых ею, существует
положительная связь (J. Wegener, et al., 2012; A. Gul, et al., 2017).
Концентрация сперматозоидов в семяприемнике инструментально
осемененных маток варьируется от 1,8 млн/мкл (J. Woyke, Z. Jasinski, 1980,
1982) до 6 млн/мкл (А. Маннапов с соавт., 2013), а у маток естественного
спаривания от 4 до 7 млн/мкл (S. Cobey, 2007). В то же время, эффективность
миграции сперматозоидов из яйцеводов в семяприемник матки, объем
которого составляет 1 мкл (Ф. Руттнер, 1976), зависит от объема вводимой
спермы и условий приема маток после инструментального осеменения. В
парных яйцеводах матки может вместиться до 20 мкл спермы (Ф. Руттнер,
1976). Ранее была установлена тесная связь между количеством рабочих пчел
в свите осемененной матки и концентрацией сперматозоидов в ее
семяприемнике (J. Woyke, Z. Jasinski, 1980). Вероятно, данные факторы
нашли отражение на результатах контрольной группы в собственных
исследованиях, так как матки после осеменения помещались в пчелиную
семью-воспитательницу в изолированном виде (в клеточке Титова).

Таблица 7 – Концентрация сперматозоидов в семяприемнике маток,
искусственно осемененных охлажденной (3 °С) разбавленной спермой,
после 30 сут. хранения (р ˂ 0,05)
ПоказателиГруппа 1Разбавитель
(контроль)Группа 2Группа 3Группа 4Группа 5
Жизнеспособность91,0 ± 2,679,0 ± 0,098,2 ± 5,367,8 ± 6,370,1 ± 2,7
сперматозоидов,
%, М ± m
Количество581199
осемененных
маток, шт.
Выживаемость8010054,577,866,7
маток, %
Количество маток5 (100)5 (62,5%)11 (100)9 (100)6 (66,7)
с
семяприемником,
содержащим
сперму, шт. (%)
Количество маток0 (0)3 (37,5%)0 (0)0 (0)3 (33,3)
спустым
семяприемником,
шт. (%)
Концентрация1,2 ± 0,55a0,54 ± 0,15 ba0,32 ± 0,07 ca0,35 ± 0,03 da0,04 ±
сперматозоидов в (0,04 – 2,78)(0,12 – 0,88)(0,07 – 0,73)(0,17 – 0,45)0,01еa
семяприемнике(0 – 0,11)
маток, млн/мкл
М ± m (Lim)

После инструментального осеменения и естественного спаривания у
маток наблюдается снижение жизнеспособности сперматозоидов в их
половых путях (H. Gencer, еt al., 2014). Следовательно, в семяприемник
матки мигрируют только фертильные сперматозоиды.
Полученные результаты собственных исследований свидетельствуют о
негативном влиянии некоторых сред, из числа испытываемых, на жизненный
ресурс спермы трутней во время хранения в охлажденном состоянии.
Таким образом, для сохранения спермы трутней медоносной пчелы без
криоконсервации в течение 30 сут. ее необходимо хранить в неразбавленном
виде при 3 °С, как показано на рисунке 3.
Концы капилляров закрыты с обеих сторон стерильной медицинской
ватой и заварены пчелиным воском. Во избежание пересыхания спермы, в
капилляре также должен содержаться физиологический раствор 0,9% по обе
стороны от спермы, отделенный от нее воздушными пробками с обеих
сторон.

аб

Рисунок 3 – Образцы спермы для хранения в охлажденном состоянии:
а – в стеклянном капилляре, б – в криосоломине

3.4 Качественные показатели половозрелости трутней. В мировой
практике инструментального осеменения существует два способа отбора
спермы у трутней: из семенных пузырьков и методом искусственной
стимуляции выворачивания эндофаллоса. Общепризнанным является второй
способ. Методом искусственной стимуляции удается отобрать у трутня от 1 –
1,5 мкл спермы из общего объема 1,7 мкл (А. Бородачев, В. Бородачева,
1989). Наличие спермы на конце эндофаллоса, ее объем, цвет и
характеристики неразрывно связаны с возрастом половозрелых трутней (S.
Cobey, 2007). В отечественной и зарубежной литературе существуют
противоречивые данные относительно возраста полового созревания
трутней, который варьируется от 14 до 30 сут. В ходе собственных
исследований выявленное относительное количество трутней, имевших на
конце эндофаллоса сперму, в возрасте 17 сут. оказалось на 6% меньше
аналогичных трутней в возрасте 30 сут. Дальнейшие исследования
подтвердили наличие лучшей половой потенции у трутней старшего возраста
(Таблица 8).
Анализ данных, представленных в таблице, позволяет отметить, что
наилучшими показателями качества отличалась сперма у трутней в возрасте
30 сут., как по концентрации сперматозоидов, так и по активности ферментов
спермы дегидрогеназ. Между концентрацией сперматозоидов и активностью
дегидрогеназ («дыханием» спермы) была установлена обратная тесная связь
rxy = -0,75.
Таблица 8 – Качество спермы разновозрастных половозрелых трутней
Концентрация сперматозоидов, млн/мклАктивность дегидрогеназ, с
Возраст(n = 10)(n = 10)
трутней,М±mLimМ±mLim
сут.
173,06 ± 0,3abc2,6 – 3,680,3 ± 26abc52 – 132
(контроль)

224,9 ± 0,7b1,9 – 7,224,0 ± 0,6b23 – 25

305,9 ± 0,4c5,1 – 6,628,0 ± 1,2c25 – 30
abc
– достоверные различия при р ˂ 0,05

3.5 Влияние одновременного выращивания трутней и неплодных
пчелиных маток на их массу в пчелиных семьях-воспитательницах.
Полноценное питание трутней в личиночной стадии является залогом
высоких репродуктивных качеств имаго (M. Sturup, et al., 2013). Дефицит
питания трутней в личиночной стадии отражается на снижении массы тела и
основныхморфометрическихпараметрахимаго.Исследованиями
отечественных и зарубежных авторов подтверждена положительная
корреляция между размерами тела трутней и их концентрацией
сперматозоидов (H. Schlüns, et al., 2003; S. Shoukry Rasha, A. Khattaby, 2013).
Испытанием способа одновременного выращивания трутней и
неплодных пчелиных маток предполагалось решить задачу получения
полноценных трутней для отбора спермы с целью ее дальнейшей
консервации. Достоверные результаты по испытанию этого способа удалось
получить только в активном сезоне 2014 г. (Таблица 9).

Таблица 9 – Масса трутней и неплодных маток в зависимости от способа
выращивания, мг
Масса
ГодСуточные трутни (n = 30)Суточные неплодные матки (n = 30)
опытконтрольОпытКонтроль
М±mМ±mМ±mМ±m
2014258,3 ± 6,1a244,5 ± 1,5ba189,7 ± 5,9194,0 ± 2,0
2015268,5 ± 8,5266,0 ± 11,0188,5 ± 8,5195,2 ± 7,8
2016268,4 ± 2,0269,0 ± 6,6181,0 ± 6,4188,4 ± 2,8
ab
– достоверные различия при р ˂ 0,05
Дальнейшие исследования подтвердили эту тенденцию в отношении
массы неплодных маток, в то время как трутни практически не отличались по
этому признаку независимо от способа выращивания. Таким образом, можно
констатировать, что одновременное выращивание трутней и неплодных
маток не оказывает существенного влияния на их массу, по сравнению с
раздельным выращиванием.

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Разработан способ криоконсервации спермы трутней медоносной
пчелы в медовом разбавителе с акации белой. Предложенный метод
криоконсервации позволил сохранить жизнеспособность спермы на высоком
уровне. В оттаянных образцах, замороженных в концентрированном (90%)
меде в сочетании с 10% ДМСО, жизнеспособность составила 79,6 ± 1,2%, с
3% глицерином 78,0 ± 1,4%. Количество сперматозоидов с аномальной
морфологией головки составило в образцах с ДМСО 6,9 ± 1,8%, с
глицерином 6,3 ± 1,4%. Сперматозоидов с аномальной морфологией жгутика
в образцах с глицерином не установлено, а с ДМСО составило 2,9 ± 1,2%.
В образцах на основе 10% медового разбавителя с акации белой
жизнеспособность спермы в сочетании с 10% ДМСО составила 70,6 ± 6,2%, а
с 3% глицерином 86,8 ± 9,3%. Две пчелиные матки из шести осемененных
заморожено-оттаянной спермой на основе 10% медового разбавителя в
сочетании с 10% ДМСО дали потомство рабочих пчел 96,5 – 99,1%.
2. Разработан способ хранения неразбавленной спермы в охлажденном
состоянии без обработки от бактериальной контаминации в течение 30 сут.
при 3 ºС. Предложенный метод консервации спермы позволил сохранить
жизнесопсобность сперматозоидов на уровне 91,0 ± 2,6%. Показатель
концентрации сперматозоидов в семяприемнике маток, инструментально
осемененных неразбавленной охлажденной спермой, достоверно (р ˂ 0,05)
превысил данные показатели опытных образцов, разбавленных в средах и
составил 1,2 ± 0,5 млн/мкл (0,04 – 2,78). Указанного количества
сперматозоидов достаточно для полноценного воспроизводства пчелиной
семьи.
3. Во время длительного хранения в жидком азоте (25 лет), сперма
трутней медоносной пчелы, замороженная в среде С46, сохраняет свою
жизнеспособность на достаточно высоком уровне 71 – 93%. При этом
наблюдается снижение оплодотворяющей способности.
4. Функциональные показатели половозрелых трутней – концентрация
сперматозоидов их подвижность и активность дегидрогеназ имеют
тенденцию к увеличению с возрастом трутней. Наиболее высокие
функциональные показатели половозрелости выявлены у трутней в возрасте
22 – 30 сут. (р ˂ 0,05). Концентрация сперматозоидов у 22 сут. трутней
составила 4,9 ± 0,7 млн/мкл (1,9 – 7,2), 30 сут. – 5,9 ± 0,4 млн/мкл (5,1 – 6,6).
Активность ферментов спермы дегидрогеназ у 22 сут. составила 24,0 ± 0,6 с
(23 – 25), 30 сут. – 28,0 ± 1,2 с (25 – 30). Дегидрогеназы спермы тем активнее,
чем выше концентрация сперматозоидов. Была установлена обратная тесная
связь r = -0,75 между концентрацией сперматозоидов и активностью
ферментов спермы.
5. Способ одновременного выращивания трутней и неплодных маток в
пчелиных семьях-воспитательницах не оказывает существенного влияния на
их качество. Достоверные различия показателей массы суточных трутней и
неплодных маток, установленные в активный сезон 2014 г., при проведении
повторных исследований не подтвердились.

4.1 Практические рекомендации. Протокол криоконсервации спермы
трутней медоносной пчелы в составе 10% медового разбавителя:
1. Сбор спермы с помощью оборудования для инструментального
осеменения пчелиных маток.
2. Оценка спермы по основным параметрам качества: концентрация,
подвижность,жизнеспособность,морфологическиеи
морфометрические параметры головки сперматозоидов.
3. Разбавление спермы экспериментальным разбавителем: мед 10%
(акация белая) – 50 мл, лактоза – 10 мг, яичный желток – 2,5 мл, ДМСО
10% – 5 мл.
4. Титрование готового разбавителя 6M NaOH до pH 8 – 9.
5. Расфасовка в криопробирки Nunc 1,8 мл.
6. Эквилибрация криопробирок при 3 ºС в течение 120 мин.
7. Замораживание криопробирок со спермой, размещенных на
криотростине в течение 50 мин. со скоростью 1 ºС/мин.
8. Помещение криотростин в жидкий азот для хранения.

Протокол консервации спермы трутней в охлажденном состоянии при 3 ºС:
1. Сбор спермы объемом 50 – 100 мкл в стерильные стеклянные
капилляры L = 75 ± 1,0 мм, d = 1,8 ± 0,2 мм с помощью оборудования
для инструментального осеменения пчелиных маток. Во избежание
пересыхания спермы, в капилляре с обеих сторон от нее также должен
содержаться физиологический раствор 0,9%, отделенный с обеих
сторон от спермы воздушными пробками.
2. Оценка спермы по основным параметрам качества: концентрация,
подвижность,жизнеспособность,морфологическиеи
морфометрические параметры головки сперматозоидов.
3. Консервация спермы. Концы стеклянного капилляра закрываются с
обеих сторон стерильной медицинской ватой и завариваются
пчелиным воском.
4. Помещение стеклянных капилляров в холодильное устройство в
условия полной темноты при 3 ºС.

4.2 Перспективы дальнейшей разработки темы. Перспективным является
дальнейшееразвитиеисовершенствованиепротоколаметода
криоконсервации спермы трутней на основе натурального пчелиного меда в
сочетании с ДМСО и глицерином. Дальнейшая апробация пчелиного меда в
качестве разбавителя позволит значительно упростить и удешевить
процедуру замораживания спермы трутней, сделать ее доступной для
племенных пчелоразведенческих хозяйств России.