Развитие физико-химических подходов для рационального дизайна новых производных нуклеиновых кислот

Во введении описана актуальность и разработанность темы,
сформулированы цели и задачи исследования, описаны научная но-
визна, практическая и теоретическая значимость работы, методы
исследования, формулируются положения, выносимые на защиту,
степень достоверности результатов исследования, личный вклад
автора и сведения об апробации результатов.
Первая глава посвящена обзору литературы. В разделе 1.1.1
описаны нуклеиновые кислоты (НК) как объект исследования, вве-
дены понятия структурных особенностей НК. В разделе 1.1.2 об-
суждаются производные и аналоги НК, их биологические и физико-
химические свойства, а также области применения. Кроме того, об-
суждаются объекты исследования – глицин-морфолиновые аналоги
(являющиеся морфолиновыми карбоксамидными миметиками) НК
и фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды, несущие N, N’-
замещенные остатки гуанидина. В разделе 1.1.3 кратко описаны
термодинамические свойства дуплексов НК и их производных и
более подробно модели расчета термодинамических параметров
комплексообразования, в частности – модель ближайших соседей.
Вторая часть обзора литературы посвящена моделированию био-
молекулярных систем методами молекулярной динамики. В разделе
1.2.1. описаны поля сил для моделирования биомолекул. В разделе
1.2.2 рассмотрены подходы для расчѐта гибридизационных свойств
биополимеров при помощи методов МД. Основной упор делается
на рассмотренных в данной работе методах MMPBSA и MMGBSA.
В разделе 1.3 описаны подходы к определению концентрации оли-
гонуклеотидов. Раздел 1.4 посвящен основному экспериментально-
му методу, используемому в данной работе – методу термической
денатурации с оптической регистрацией сигнала. Он позволяет
определять термодинамические параметры комплексообразования
путем подгонки теоретической кривой изменения оптической плот-
ности при изменении температуры к экспериментальной кривой.
Вторая глава посвящена описанию используемых материалов,
экспериментальных методов и методов компьютерного моделиро-
вания и анализа. В разделе 2.1 представлены использованные в ра-
боте олигонуклеотиды. В разделе 2.2 описаны методики измерения
концентрации олигомеров, определения термодинамических и ки-
нетических параметров комплексообразования при помощи мето-
дов термической денатурации и остановленной струи с оптической
регистрацией сигнала, изучения вторичной структуры НК методом
спектроскопии кругового дихроизма. В разделе 2.3 обсуждаются
методы компьютерного моделирования НК, их производных и их
комплексов. Подробно описана методика создание МД библиотек
мономеров глицин-морфолиновых пентааденилатов и ФГО, проце-
дуры МД моделирования и анализа полученных траекторий. Опи-
сана база данных термодинамических параметров (энтальпия и эн-
тропия комплексообразования) для ДНК/РНК и РНК/РНК дуплек-
сов, взятая из литературных источников.
Третья глава посвящена
описанию и обсуждению полу-
ченных результатов. В разделе
3.1 описан разработанный под-
ход для определения физико-
химических свойств коротких
производных НК. Он рассматри-
вает тандемные комплексы, об-
ладающие большей термической Рисунок 1. Схематичное изображение ис-
стабильностью по сравнению с следованной системы.
комплексами коротких олигонуклеотидов. В данной схеме для
определения величин термодинамических параметров одновремен-
но анализируют несколько кривых термической денатурации ком-
плексов различной длины (Рисунок 1). За счет различного вклада от
связывания цепей и вклада кооперативного контакта на стыке дуп-
лексных структур в константу равновесия формирования комплек-
сов разной молекулярности удается разделить и достоверно опреде-
лить два этих вклада. В предложенном нами подходе использована
упрощенная модель, предполагающая одновременное взаимодей-
ствие n коротких олигонуклеотидов А с протяженной матрицей В
без промежуточных и дополнительных состояний, то есть исполь-
зование приближения “все-или-ничего”:
(1).
Взаимодействие n олигонуклеотидов А с цепью В можно описать
эффективной константой равновесия, которая характеризуется
энергией связывания n олигомеров и формирования n-1 коопера-
тивного контакта на стыке дуплексных структур (Рисунок 1):
(2)
(3)
(4),
где Ki – это константа равновесия: эффективная (i=”eff”), связыва-
ния (i=”b“) или кооперативного взаимодействия (i=”c”); ΔG°i(T) и
ΔH°i, ΔS°i – изменение свободной энергия Гиббса, энтальпии и эн-
тропии при формировании соответствующего структурного элемен-
та тандемного комплекса. Таким образом, эффективные термоди-
намические параметры есть комбинация вкладов от формирования
двойной спирали и взаимодействия на стыке дуплексных структур.
При соблюдении равенства концентраций олигонуклеотидов А и В,
приведенных на один нуклеотид ([A]0=n·[B]0), нахождение концен-
трации свободного олигомера А сводится к решению алгебраиче-
ского уравнения степени n+1 на концентрацию олигонуклеотида А
в свободном состоянии ([A]):
[ ][ ] [ ](5).
Используя одновременную подгонку нескольких кривых тер-
мической денатурации, полученных для комплексов с разным чис-
лом коротких олигонуклеотидов (n), можно определить отдельные
энергетические вклады (связывание и кооперативный контакт) в
эффективную константу равновесия.
Применимость разработанной схемы получения термодина-
мических параметров комплексообразования была проверена на
примере комплекса нативного короткого олигонуклеотида (dA5) с
различными протяженными ДНК и РНК-матрицами ((dT5)n и (U5)n
где n = 3, 4, 5).
Раздел 3.2 посвящен исследованию структуры и термодина-
мических свойств тандемных комплексов глицин-морфолиновых
(gM) пентааденилатов (gMA5) (Рисунок 2) с ДНК и РНК цепями
длинной 15, 20, 25 нт (n=3, 4, 5) и полимерными цепями. В качестве
референсных последовательностей к gM олигомерам были выбраны
пентааденилаты ДНК (dA5).
Первый подраздел содержит информацию о вторичной струк-
туре тандемных комплексов пентааде-
нилатов, охарактеризованной методом
спектроскопии кругового дихроизма в 1 M
NaCl в нейтральных значениях pH (10 мМ
какодилат натрия, pH 7.2). Изучен пре-
дельный случай – комплексы полимерных
цепей ДНК (poly(dT)) или РНК (poly(U)) с
короткими олигомерами. В этом случае
краевые эффекты в коротких олигомерах
не будут вносить определяющего вклада.
Было показано, что во всех случаях фор-
мируются комплексы с НК. Это видно по
совпадению спектров кругового дихроиз-
ма (КД) смеси и суммы спектров при вы- Рисунок 2. Структура пентааде-
сокой температуре и значимому различию нилата глицин-морфолинового
производного (gMA5)при
при низкой. При 20 °С форма КД- нейтральном значении pH.
Рисунок 3. Спектры кругового дихроизма для смеси (толстые линии) и суммы спектров
(тонкие линии) отдельных компонентов при высокой (красным) и низкой (синим) темпера-
туре для (gMA5)/poly(U) и dA5/poly(U), dA5/poly(dT) и (gMA5)/poly(dT).

спектров комплекса (dA5)/poly(dT) близка к спектру B-формы двой-
ной спирали; КД спектры (dA5)/poly(U) и (gMA5)/poly(U), типичные
для А-формы двойной спирали, а нетипичный вид спектра
(gMA5)/poly(dT) не позволяет сделать вывод о его вторичной струк-
туре (Рисунок 3). Для всех исследованных модельных систем
наблюдаются точки изоэллиптичности, что косвенно служит свиде-
тельством применимости модели двух состояний к описанию про-
цесса денатурации таких комплексов.
Во втором подразделе рассмотрено влияние буферных
условий на гибридизационные свойства тандемных комплексов
gMA5 с комплементарной ДНК. Для изучения влияния ионной силы
раствора и значения рН на эффективность комплексообразования
проведены эксперименты по исследованию термической денатура-
ции для нативных и модифицированных комплексов при различных
ионных силах раствора (10 мM, 100 мM, 1 M NaCl) и при различных
значениях pH (5.5, 7.2, 8.0) буфера.
Уменьшение ионной силы раствора при исследованных зна-
чениях pH приводит к существенному снижению термостабильно-
сти нативной системы. Совершенно другое поведение наблюдали
для модифицированного комплекса (gMA5)5/(dT25). При нейтраль-
ном значении рН (7.2) происходит незначительное увеличение тем-
пературы плавления комплекса (на ~3.5 градуса) при снижении
Рисунок 4. Экспериментальные (цветные толстые линии) и расчетные (тонкие черные ли-
нии, одновременная подгонка кривых при n = 3, 4 и 5) кривые термической денатурации для
разного количества (n =3, 4, 5 и (poly(U/dT))) тандемных олигонуклеотидов gMA5 (A) и dA5.

концентрации Na+ с 1М до 10mM. Несколько меньшая стабилизация
(на ~1.5 градуса) наблюдается при рН 8.0. Однако при понижении
pH до значения 5.5 наблюдается значимая термостабилизация ком-
плекса (на ~6.5 градусов) при низких концентрациях Na+. В сово-
купности, определенные термодинамические параметры комплек-
сообразования, величина гипохромного эффекта и литературные
данные о зарядовом состоянии вторичных и третичных аминов сви-
детельствуют о том, что при pH 7.2 и 8.0 в глицин-морфолиновом
олигомере положительно-заряжены только концевые аминогруппы
(Рисунок 2), а при pH 5.5 дополнительно протонируются амины
морфолиновых колец.
В третьем подразделе проведен анализ термодинамических
параметров комплексообразования и кооперативного контакта при
формировании тандемных комплексов. Использовано три подхода
для определения термодинамических параметров. Первый – это од-
новременная подгонка трех кривых термической денатурации
(n = 3, 4 и 5) для определения энтальпии и энтропии связывания
(ΔH°b, ΔS°b) и кооперативного контакта (ΔH°c, ΔS°c) на стыке дуп-
лексных структур (Рисунок 4). Второй – обработка одиночных кри-
вых и получение эффективных термодинамических параметров
(ΔH°eff, ΔS°eff и ΔG°eff). Третий – это использование концентрацион-
ной зависимости температуры плавления комплексов для определе-
ния эффективных термодинамических параметров.
Все три способа показали близкие значения эффективных
термодинамических параметров комплексообразования, а термоди-
намические параметры связывания и кооперативного контакта, по-
лученные подгонкой для комплексов с n=3, 4 и 5, позволили опи-
сать и кривые термической денатурации с полимерными матрицами
ДНК и РНК.
Было показано, что термическая стабильность тандемных
комплексов (dA5)n/(dT5*n) оказывается незначительно выше, чем для
(gMA5)n/(rU5*n), тогда как (dA5)n/(rU5*n) обладает наименьшей темпе-
ратурой плавления (где n = 3, 4, 5) при 1M NaCl при физиологиче-
ском значении pH (Таблица 1).
Четвертыйподразделпосвященмолекулярно-
динамическому моделирования тандемных комплексов нативных и
глицин-морфолиновых пентааденилатов с 20-звенными РНК и
ДНК. Был решен вопрос о конформации мономерных звеньев мо-
дифицированных олигомеров.
Таблица 1. Термодинамические параметры связывания и кооперативного взаимодействия,
полученных одновременной подгонкой кривых термической денатурации (n=3, 4, 5) при pH
равном 7.2, 1M NaCl, 10 мM какодилате Na. В таблице приведены значения, усредненные по
всем концентрациям ([d(gM)A5] = 4×10-6, 1×10-5, 2×10-5 и 4×10-5 M).
РНКДНК
dA5gMA5dA5gMA5
ΔH°b, ккал/моль-39.5-45.3−43.9−30.2
ΔS°b, кал/моль/К-134-168−156−104
ΔG°b, ккал/моль2.26.94.61.9
ΔH°c, ккал/моль-10.8-19.1−16.2−11.2
ΔS°c,кал/моль/К0.00.00.00.0
ΔH°eff, ккал/мольb-47.6-59.7-60.4-40.0
ΔS°eff, кал/моль/Кb-134.5-168.5-170-108
ΔG°eff, ккал/мольb
-5.9-7.4-7.6-6.5
Tпл, °Cb,c26.836.537.329.0
b
Эффективные термодинамические параметры рассчитаны для n = 4.
c
Tпл рассчитаны для концентрации пентануклеотида 10 мкM.
ДНКРНК

Рисунок 5. Наиболее представленные структуры в МД траекториях.

Так было установлено, что положение гетероциклического
основания относительно плоскости кольца остова сохраняется в мо-
дифицированном мономере таким же, как и для нативного аденози-
на в -положении [1], энергетически более выгодной конформацией
морфолинового кольца является конформация “кресло”, а относи-
тельно положения С-N связи для азота морфолинового кольца су-
ществует два конформера: gMA1 – экваториальное, gMA2 – акси-
альное расположение связи.
МД моделирование показало, что форма ДНК/РНК тандемно-
го комплекса близка к А-форме двойной спирали. В случае тандем-
ного ДНК/ДНК комплекса наблюдается структура, являющейся
промежуточной между B-формой и oligo(А) трактом ДНК. В сред-
нем, тандемные комплексы gM олигомеров являются более по-
движными, чем нативные аналоги.
Структура модифицированных комплексов отличаются не-
значительно от нативных для внутренних пар оснований, а в случае
концевых и расположенных на стыке дуплексных структур откло-
нения более значимы (Рисунок 5). Геометрия нативных ДНК или
РНК цепей практически идентична у разных типов комплексов. В
то же самое время наличие дополнительной связи в остове gM от-
носительно нативных НК приводит к возникновению напряжений
остова и нарушениям регулярной структуры. Это сильнее проявля-
ется в комплексах с ДНК, чем с РНК, что связано с большей кон-
турной длиной остова последних. Таким образом, можно ожидать,
что химическое строение остова не позволит полностью модифици-
рованным gM олигомерам формировать дуплексы с протяженными
комплементарными цепями НК.
Пятый подраздел посвящен изучению физико-химических
свойств комплексов гетеронуклеотидных последовательностей гли-
цин-морфолиновых олигомеров с ДНК и РНК. На первом этапе
изучена термостабильность тандемного комплекса олигомера
gM(AAACA) с 20-звенной ДНК. Температура плавления такого
тандемного комплекса при нейтральном значении pH 7.2 в 1М NaCl
была на 13 °С ниже температуры плавления комплекса
(gMA5)4/(dT20). Семизвенный олигомер в дуплексе с ДНК
gM(ССAAACA)/d(GCGTTTGG), РНК gM(CСААAСА)/r(UGUUUGG)
итандемныйкомплекссолигонуклеотидом
gM(CСААAСА)2/r(UGUUUGGUGUUUGG) обладают термостабиль-
ностью значительно более низкой, чем нативные аналоги.
При помощи методов термической денатурации и спектро-
скопии кругового дихроизма было показано, что десятизвенный
глицин-морфолиновый олигомер gM(CAGCGGCGTG) не образует
ни параллельных, ни антипараллельных комплексов с комплемен-
тарными ДНК и РНК.
Было установлено, что замена какодилатного буфера на фос-
фатный приводит к выпадению в осадок глицин-морфолинового
олигомера, как и высокая концентрация их комплексов с НК (~10-3
М). Таким образом, дальнейшее исследование данных глицин-
морфолиновых олигомеров представляется затруднительным в при-
ложениях, предполагающих комплементарные взаимодействия мо-
дифицированных олигомеров с НК.
В разделе 3.3 диссертации представлены результаты исследо-
вания физико-химических свойств дуплексов фосфорилгуанидино-
вых олигонуклеотидов (ФГО) с ДНК. ФГО – незаряженные произ-
водные нуклеиновых кислот, где один из немостиковых атомов
кислорода в остатке фосфорной кислоты нуклеотида замещен на
гуанидиновоепроизводное,вданнойработе-1,3-
диметилимидазолидин-2-имин. В подразделе 3.3.1. ставится задача,
описан набор выбранных для исследования модельных олигомеров
размером 8, 10 и 12 нт. Нативные олигомеры способны сформиро-
вать 21 полностью комплементарных ДНК/ДНК дуплекса. Полно-
стью ФГ-модифицированные ДНК цепи образуют 21 ФГО/ДНК и
21 ДНК/ФГО частично модифицированных дуплекса, либо полно-
стью модифицированные ФГО/ФГО комплексы.
Во втором подразделе исследовано влияние ФГ групп (обо-
значено символами PG в кодировке) на спектры поглощения в уль-
Рисунок 6. (A)Спектры КД додекамерных комплексов различных типов (ДНК/ДНК,
ФГО/ДНК, ДНК/ФГО и ФГО/ФГО) при низкой (5 °C) и высокой (90 °C) температурах. Кон-
центрация олигонуклеотидов 10 мкМ, буфер – 1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия pH 7.2.
(B) Сравнение зависимостей температуры плавления от буферных условий для додекамер-
ных комплексов различных типов (ДНК/ДНК: зеленый, ФГО/ДНК: темно-синий,
ДНК/ФГО: голубой и ФГО/ФГО: красный).
трафиолетовой области спектра. Показано, что спектры нативных и
полностью модифицированных олигонуклеотидов практически
совпадают в области от 250 до 330 нм при высоких температурах, а
в более коротковолновой области наблюдаются отличия из-за по-
глощения ФГ групп. Установлено, что для наиболее достоверного
определения концентрации ФГО необходимо использовать оптиче-
ское поглощение олигомеров при 90 °С на длине волны 260 нм и
коэффициенты экстинкции, рассчитанные в приближении суммы
независимых вкладов мономерных звеньев для ДНК при высокой
температуре.
Подраздел 3.3.3 посвящен исследованию структуры и гибри-
дизационных свойств модельных комплексов окта- (M8/N8), дека-
(M10/N10) и додекануклеотидов (M12/N12) с одной или обеими
полностью модифицированными ФГ-цепями. Исследование мето-
дом спектроскопии кругового дихроизма при низких температурах
показало большую разупорядоченность ФГО цепей по сравнению с
ДНК. Сопоставление спектров смеси олигонуклеотидов (Рисунок 6)
показывает, что вторичные структуры всех типов комплексов
(ДНК/ДНК, ФГО/ДНК, ДНК/ФГО и ФГО/ФГО) близки между со-
бой для каждого из дуплексов окта-, дека- и додекамеров. Они ти-
пичны для В-формы двойной спирали ДНК [2]. Кроме того, было
показано наличие точек изоэллиптичности для всех комплексов, что
свидетельствует о формировании комплексов в приближении моде-
ли двух состояний («все-или-ничего»), предполагающей наличие
только дуплекса и одноцепочечного состояния олигонуклеотидов.
Изучены гибридизационные свойства ФГО в модельных ок-
та- , дека- и додекамерных дуплексах методом термической денату-
рации в различных буферных условиях (деионизованная вода, 10,
100 и 1000 мМ NaCl, а так же 100 мМ NaCl с 5 мМ MgCl2) (Рису-
нок 6). По совокупности набора критериев показано, что процесс
образования ДНК/ДНК и ФГО/ДНК дуплексов может быть описан в
приближении модели двух состояний. Термостабильность ФГО
дуплексов с ДНК слабо зависит от ионной силы раствора, незначи-
тельно увеличиваясь при уменьшении ионной силы раствора и со-
поставима с термической стабильностью немодифицированных
ДНК/ДНК дуплексов при 100 мМ NaCl. Термическая стабильность
ФГО/ФГО комплексов существенно снижена относительно частич-
но модифицированных ФГО/ДНК дуплексов. Наблюдаемое сниже-
ние термической стабильности модифицированных комплексов при
высокой ионной силе раствора может быть связано с изменением
активности воды (см. ниже).
В подразделе 3.3.4 методом остановленной струи исследовано
влияние полной модификации одной из цепей на кинетику форми-
рования дека- и додекамерных дуплексов. Константы скорости ас-
социации нативных и модифицированных олигомеров находятся в
диапазоне от 105 до 107 М-1 c-1 во всех исследованных случаях, уве-
личиваясь с ростом температуры. Температурные зависимости кон-
стант скоростей диссоциации ФГО и ДНК дуплексов в Аррениусов-
ских координатах линейны и параллельны друг другу. Установлено,
что дестабилизация ФГ-содержащих дуплексов происходит в ре-
зультате значимого увеличения константы скорости диссоциации
дуплекса, в то время, как константы скорости ассоциации отлича-
ются не более чем на порядок.
Пятый подраздел посвящен поиску причин наблюдаемых
структурных и термодинамических эффектов от введения ФГ мо-
дификаций при помощи методов молекулярного моделирования и
анализа. Проведено моделирование методом МД в явной водной
оболочке в течении 100 нс как для дуплексов, так и для одноцепо-
чечных олигомеров. Исследованы модельные окта, дека- и додека-
меры, изученные экспериментально. Структурные характеристики
двойной спирали для нативных и модифицированных комплексов
были типичны для В-формы ДНК и практически не различались
между собой, что совпадает с данными, полученными методом КД-
спектроскопии.
При сравнении молекулярных моделей с небольшим числом
ионов в моделируемой ячейке (нейтрализованы заряды остатков
фосфорной кислоты ионами натрия) и случаем с высокой ионной
силой раствора (~1 M NaCl) анализ взаимодействия комплексов с
ионами и водным окружением не выявил значимых различий как
для нативных, так и для модифицированных дуплексов. Установле-
но, что введение ФГ модификаций приводит к снижению структу-
рированности водного окружения и к уменьшению числа водород-
ных связей между модифицированными олигомерами и их дуплек-
сами с водой. В то же время, изменение числа водородных связей
при образовании дуплексов близко как для нативных, так и для мо-
дифицированных олигонуклеотидов. Это свидетельствует о том,
что влияние активности воды на гибридизационные свойства как
нативных, так и модифицированных дуплексов должно быть очень
похоже.
В подразделе 3.3.6 исследовано влияние сорастворителей на
термостабильности ФГО/ДНК дуплексов (Рисунок 7). В качестве
агентов, снижающих активность воды, выбраны этанол, этиленгли-
коль (EG) и два полиэтиленгликоля со средним молекулярным ве-
сом 200 и 1000 (PEG200 и PEG1000). Для исследований выбраны
модельные двенадцатизвенные дуплексы, так как они обладают до-
статочновысокойтермостабильностью.МетодомКД-
спектроскопии показано, что нали-
чие сорастворителей не приводит к
изменениям формы двойной спира-
ли при добавлении сорастворителей
до 20 %. Увеличение доли этанола
до 50 % приводит к линейному
снижению температуры плавления
всех исследованных комплексов.
Кроме того, уменьшение активно-
сти воды (увеличение массовой до-
ли сорастворителя) приводило к
Рисунок 7. Количество молекул воды,
линейному увеличению обратной присоединившихся в процессе образова-
температуры плавления. Это позво- ния нативного и модифицированных дуп-
лило определить количество моле- лексов,в присутствии различных сорас-
творителей (этанол, EG, PEG200 и
кул воды, дополнительно связав- PEG1000).
шихся с НК в процессе образования дуплекса (Рисунок 7), в соот-
ветствии с моделью Спинка и Чайреса [3]. Таким образом, было по-
казано, что термодинамические эффекты при образовании ФГО-
дуплексов в присутствии сорастворителей оказываются близки
между собой. Это коррелирует с данными, полученными при МД
анализе.
Подраздел 3.3.7 посвящен разработке подходов прогностиче-
ского расчета гибридизационных параметров для ФГО/ДНК дуп-
лексов на основании экспериментальных данных. В пункте 3.3.7.1.
обсуждаются закономерности термодинамических параметров ком-
плексообразования исследованного методом термической денату-
рации набора дуплексов при концентрации ионов Na+ в растворе 10,
110 и 1010 мМ. В случае ДНК/ДНК дуплексов снижение концен-
трации ионов Na+ приводит к значительному снижению их термо-
стабильности, для ФГО/ДНК дуплексов наблюдается незначитель-
ное повышение термической стабильности с уменьшение ионной
силы раствора (увеличением концентрации ионов Na+). Усреднен-
ные значения термодинамических параметров для всей выборки
ФГО/ДНК (84 комплекса) и ДНК/ДНК (42 комплекса) дуплексов
близки в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ какодилат
натрия, pH 7.2.
В пункте 3.3.7.2. обсуждены модели прогностического расче-
та для ФГО/ДНК дуплексов. Полученные данные указывают на
возможность применение модели ближайших соседей (БС) для ФГ-
содержащих олигомеров. Предложено два подхода для построения
предсказательной модели термодинамических параметров форми-
рования дуплексов. Первый подход основан на определении инкре-
ментов модели БС для всех 16 ФГ-модифицированных динуклео-
тидных ФГО/ДНК пар. Второй рассматривает введение ФГ-
модификации в динуклеотидный шаг как дополнительной поправки
к параметрам модели БС для ДНК. Было показано, что наибольшим
дестабилизирующим эффектом обладает введение ФГ группы в шаг
5′-С*C-3’/5′-GG-3′ (ФГ-группа обозначена символом “*”), а
наименьшим – в 5′-G*C-3’/5′-GC-3′. Точность предложенных моде-
лей при различных ионных силах раствора сопоставима с точно-
стью модели БС для ДНК/ДНК дуплексов.
В разделе 3.4 изучена возможность расчета термодинамиче-
ских параметров комплексообразования с использованием МД мо-
делирования. В подразделе 3.4.1. показана принципиальная возмож-
ность расчета энтальпии и энтропии комплексообразования при по-
мощи методов обработки МД траекторий. Проведено МД модели-
рование (100 нс) для каждого дуплекса и отдельных олигомеров из
набора 65 ДНК/РНК [4] и 75 РНК/РНК [5] дуплексов, для которых
опубликованы экспериментально полученные величины термоди-
намических параметров комплексообразования. Полученные траек-
тории проанализированы методами MMPB(GB)SA и Q-harm/N-
mode для расчета энтальпии и энтропии связывания, соответствен-
но.
Использование метода ММGBSA дает наилучшую корреля-
цию экспериментальных и расчетных величин как для РНК/РНК,
так и для ДНК/РНК комплексов, причем использование однотра-
екторного подхода позволяет добиться величины ошибки ~10%, что
сопоставимо с точностью модели БС для таких видов дуплексов.
В подразделах 3.4.2. и 3.4.3. проведен анализ применимости
МД-подходов для расчета гибридизационных свойств глицин-
морфолиновых и фосфорилгуанидиновых олигомеров. Наблюдается
качественное согласие рассчитанных величин термодинамических
параметров с экспериментальными данными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Детальноизученыфизико-химическиесвойстваглицин-
морфолиновых и фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО)
и их комплексов, на основании чего созданы подходы для изучения
и прогностического расчета их свойств.
1. Разработан метод экспериментального определения достоверных
величин термодинамических параметров комплексообразования, а
также формирования отдельных структурных элементов тандемных
комплексов коротких низкостабильных комплексов НК и их произ-
водных.
2. Показано, что по данным КД-спектроскопии РНК в тандемных
комплексах с глицин-морфолиновыми пентааденилатами находится
в А-форме. Структуру с ДНК в аналогичных комплексах установить
не удалось. Определены гибридизационные свойства пентааденила-
тов глицин-морфолинов с ДНК и РНК. Комплексы глицин-
морфолиновых олигомеров с ДНК обладают сниженной, а с РНК –
повышенной термической стабильностью относительно аналогич-
ных немодифицированных тандемных ДНК/ДНК комплексов.
3. Изучены физико-химические свойства ФГО. Формирование ком-
плексов ФГО/ДНК и ФГО/ФГО может быть описано в рамках при-
ближения модели двух состояний. Термостабильность ФГО ком-
плексов незначительно увеличивается при уменьшении ионной си-
лы раствора и сопоставима с термической стабильностью немоди-
фицированных ДНК/ДНК дуплексов при 100 мМ NaCl. Термиче-
ская стабильность ФГО/ФГО комплексов существенно снижена от-
носительно ФГО/ДНК дуплексов. Изменение активности воды при-
водит к близким изменениям термостабильности ДНК/ФГО и ана-
логичным им ДНК/ДНК дуплексам. Установлено, что введение ФГ-
модификаций не изменяет форму двойной спирали, повышает по-
движность цепи, а изменение сольватации является наиболее веро-
ятной причиной изменения термостабильности комплексов.
4. На основании приближения ближайших соседей разработана мо-
дель прогностического расчета величин термодинамических пара-
метров формирования ФГО/ДНК дуплексов (ΔG°37, ΔH°, ΔS° и Тпл),
как для полностью, так и частично-модифицированных олигомеров
в различных солевых условиях (10 – 1010 мМ Na+). Прогностиче-
ская точность разработанного подхода при расчете свободной энер-
гии Гиббса составляет 0.3 ккал/моль, а температуры плавления –
1.4 °С.
5. Показана возможность достоверного расчета энтальпии комплек-
сообразования (ΔH°) для наборов РНК/ДНК (75 шт.) и РНК/РНК (65
шт.) дуплексов при анализе МД траекторий дуплексов методом
MMGBSA. Ошибка расчета сопоставима с величиной эксперимен-
тальной ошибки и составляет 8%. Оценку гибридизационных
свойств дуплексов ФГО с комплементарными ДНК и глицин-
морфолиновых пентааденилатов с ДНК и РНК можно проводить на
качественном уровне.