Реорганизация гиппокампа белых крыс после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий

Работа выполнена на базе Омского государственного медицинского университета, одобрена этическим комитетом университета (протокол No112 от 26.09.2019). В качестве экспериментальных животных использовали белых крыс линии Wistar массой 180–210 гр. Исследования проводили в соответствии с рекомендациями Международного комитета по работе с лабораторными животными, принятыми ВОЗ, директивой Европейского Парламента No 2010/63/EU от 22.09.2010 «О защите животных, используемых для научных целей».
Экспериментальная модель. Острую 20 мин ООСА моделировали путем окклюзии общих сонных артерий (2-сосудистая модель неполной глобальной ишемии без гипотонии). Состояние животных в послеоперационном периоде оценивалось в баллах (Корпачев В. Г. и др., 1982). Выбор этой модели был обусловлен тем, что, в отличие от фокальной полной ишемии, данная модель не приводила к крупноочаговым некротическим изменениям нервной ткани (СтепановА.С. и др., 2017). Общая анестезия проводилась наркозом (Zoletil 100, 10 мг/кг). Пережимались артерии на 20 минут хирургическими зажимами. Эксперимент проведен на самцах белых крыс линии Wistar (n = 54). Забор материала проводили через 6 часов, через 1, 3, 7, 14, 21 и 30 суток (n = 6 в каждой группе). Контролем служили ложнооперированные крысы (n = 9). Летальность в эксперименте составила 4,86 %.
Гистологические методы. Животных выводили из эксперимента под наркозом путем обескровливания (рассечение левого желудочка сердца). Мозг фиксировали перфузией 4 % раствора параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2–7,4) через аорту под давлением 90–100ммрт.ст. в течение 15мин. Материал хранился в холодильнике при температуре +4 0С.
Полученный материал заключался в парафин, затем изготавливали серийные фронтальные срезы толщиной 2-4 мкм на уровнях 2,2 – (-)4,8 (от Брегмы) (Paxinos G., Watson C., 2005), окрашивали гематоксилин-эозином на автоматическом стейнере Sakura, тионином по Нисслю. С каждого среза фотографировали 10–15 полей зрения гиппокампа СА1, СА3, СА4 и зубчатой извилины головного мозга белых крыс. При морфометрическом анализе брали 200 (на срок) случайно выбранных полей зрения.
С помощью светового микроскопа Leica DM 1000 делались цифровые микрофотографии (tif, 2048 на 1536 пикселей) на увеличении ×4, ×10, ×40 и ×100. Оценивали общую численную плотность нейронов и глиоцитов гиппокампа, их площадь, ядерно-цитоплазматическое, нейроглиальное соотношение, содержание реактивно (гипохромных и гиперхромных несморщенных), дистрофически (отек- набухание, вакуолизация), некробиотически изменѐнных (клетки-тени, пикноморфные) и нормохромных нейронов (Weibel E. R., 1979; Mayhew T. M., 1991; Mandarim-de-lacerda C. A., 2003).
Иммуногистохимические методы. Используя ранее изготовленные парафиновые блоки, на микротоме с системой водного транспорта были сделаны серийные фронтальные срезы гиппокампа толщиной 4 мкм. Для иммуногистохимического исследования использовали к NSE – нейрон специфической енолазе (РАА537Ra01) – кроличьи поликлональные антитела, разведение 1 : 100; HSP-70 – белку теплового шока (РАВ062Ra01) – кроличьи поликлональные антитела к крысиному антигену; разведение 5–20 мкг/мл (Cloud-Clone Corp.); MAP-2 – белок, ассоциированный с микротрубочками 2(ab32454) – кроличьи поликлональные антитела, разведение 1 мкг/мл (Аbcam, США); GFAP – кислому фибриллярному белоку астроцитов (PA0026) – мышиные моноклональные антитела, клон GA5, готовые к применению (Bond Ready-to-Use Primary Antibody; Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания); p38 – синаптофизин (PA0299) – мышиные моноклональные антитела, клон 27G12, готовые к применению (Bond Ready-to-Use Primary Antibody; Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания); каспаза-3 – (Mob 309) – мышиные моноклональные антитела, клон 3CSP03, разведение 1 : 25 (Diagnostic BioSystems Inc., США); AIF-1 – аллотрансплантат воспалительного фактора (РАС288Ra01) – кроличьи поликлональные антитела, разведение 5–20 мкг/мл (Cloud-Clone Corp.); Bcl-2 – ингибитор каспаз (bcl-2/100/D5) – мышиные поликлональные антитела, готовые к применению (Bond Ready-to-Use Primary Antibody; Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания); Ki-67 – маркер пролиферативной активности (MM1) – мышиные поликлональные антитела, готовые к применению (Bond Ready-to-Use Primary Antibody; Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания); p53 – проапоптотический белок (DO-7) – мышиные поликлональные антитела, готовые к применению (Bond Ready-to-Use Primary Antibody; Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания). Иммуногистохимическую реакцию проводили на срезах, помещенных на полилизиновые предметные стекла. После реакции с первичными антителами срезы инкубировали с соответствующими вторичными антителами, хромогеном DAB (3,3′-диаминобензидин), докрашивали гематоксилином, заключали в полистирол. Для визуализации использовали
мультимерный набор реагентов на основе полимера NovolinkTM (DAB) Polymer Detection System (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Великобритания).
Морфометрический анализ. Для морфометрического исследования применяли программу ImageJ 1.46 (Мыцик А. В. и др., 2012; Ferreira T. A., Rasband W., 2010). По литературным данным, в нейроморфологии для получения достоверных результатов достаточно 6-8 животных в группе, 5-6 серийных срезов и 5-10 случайных полей зрения объекта (отдела головного мозга) на каждом срезе (Bolon B. et al., 2005; OoigawaH. et al., 2006). В настоящем исследовании мы сравнивали по 25 рандомизированных полей зрения на срок.
Фрактальный анализ. Фрактальный анализ контуров астроцитов на полученных черно-белых изображениях осуществляли с помощью плагина FracLac 2.5 (Box Counting Sampling Methods) по разработанным ранее подходам (Karperien A. et al., 2013). Маски и контуры GFAP-позитивных тел и отростков на бинарных изображениях представлены как срезы единой объемной сети в плоскости фрактального пространства. Поэтому эти клетки с геометрически сложной и нерегулярной организацией количественным образом можно охарактеризовать только путем определения фрактальной размерности. В результате получена информация о заполнении нервной ткани фрактальной структурой (в частности, ветвящимися отростками астроцитов) и мерой сложности пространственной организации астроцитов. Подобный подход ранее применялся для характеристики глиальных клеток головного мозга млекопитающих (Pirici D. et al., 2009). Фрактальный анализ можно использовать не только для отдельных астроцитов, но и более сложных рельефов, например, всего поля зрения, включающего тела, крупные (1-2 порядка) и мелкие (3-4 порядка) отростки. В этом случае измерения закономерно показали более высокие значения фрактальной размерности и позволили оценить лакунарность астроцитарной сети разных отделов гиппокампа.
Статистический анализ. Оценку характера распределения указанных величин проводили с помощью критерия Shapiro-Wilk (Statistica 8.0), проверку статистических гипотез – с помощью непараметрических методов. Первоначально использовали критерий для множественного сравнения (ANOVA Kraskel-Wallis). При получении статистически значимого результата проводили парное сравнение с помощью Mann – Whitney U-test для независимых выборок. Использовались также критерий 2 и Фишера. Материал представлен в процентах (95 % доверительный интервал – 95 % ДИ), как медиана (Q2) нижний (Q1) и верхний (Q3) квартили (StatSoft Statistica 8.0; MedCalc 11.6.1.0) (Боровиков В., 2003). В ходе проведения статистического анализа нулевая гипотеза отвергалась при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Через 1 и 3 сут после 20 мин ООСА в гиппокампе выявлялись пирамидные нейроны с признаками тинкториальных (усиление и уменьшение интенсивности окраски цитоплазмы и ядра – гиперхромные и гипохромные), гидропических (вакуолизация, отек-набухание), дегидратационных (темные клетки с обратимым сморщиванием) и некробиотических (клетки-тени, пикноморфные, гомогенизированные клетки) изменений, фагоцитоза и мелкие поля «выпадения» нейронов. При этом среди необратимо поврежденных преобладали нейроны с признаками коагуляционно-ишемического некроза – пикноморфные темные (красные) нейроны. Нейроглиальные взаимоотношения характеризовались увеличением количества единичных групп астроцитов и микроглиоцитов около патологически измененных нейронов. Выявленные изменения гиппокампа имели мелкоочаговый характер. Дегенеративно измененные нейроны перемежались с типичными нормохромными нейронами. Встречались участки гиппокампа с преобладанием нормохромных нейронов и участки, заполненные преимущественно темными нейронами. Степень сморщивания также варьировалась. Через 7, 14 и 30 сут после 20 мин ООСА в гиппокампе выявляли единичные нейроны с проявлениями кариоцитолизиса, отека-набухания и вакуолизации перикарионов, но сохранялось большое количество пикноморфных нейронов. Максимальное содержание пикноморфных нейронов отмечалось в поле СА4. Выявлялись очаги выпадения нейронов, а около ишемически измененных нейронов либо отдельно, либо в составе группы с астроцитами располагались микроглиоциты. Отмечалось увеличение количества сателлитарных олигодендроцитов. Очаговое появление после 20 мин ООСА большого количества темных нейронов сопровождалось увеличением в ядрах неповрежденных нормохромных нейронов количества ядрышек. Вполне вероятно, что в течение 7 суток после острой ишемии в нейронах гиппокампа происходил сдвиг в хромосомном балансе ядер и повышалась активность имеющихся ядрышковых организаторов. В течение данного времени это обеспечивало повышение уровня адаптации нейронов после 20 мин ООСА. Через 14 суток после 20 мин ООСА, вероятно, за счет слияния ядрышек, происходило восстановление их количества до уровня контроля. Максимальная активация ядрышкового аппарата отмечалась в поле СА3 гиппокампа. Через 7 и 14 суток после 20 мин ООСА, в сравнении с острым периодом (1 и 3 сут), содержание нормохромных нейронов частично восстанавливалось. При этом общая численная плотность нейронов в течение 14 суток наблюдения (начиная с 3 суток) статистически значимо уменьшалась: после 20 мин ООСА на 16,3 %. То есть, часть пирамидных нейронов СА3 после 20 мин ООСА подвергалась необратимым изменениям или полностью разрушалась и элиминировалась путем фагоцитоза. Необходимо отметить, что значительно увеличивался разброс значений общей численной плотности нейронов в разных полях зрения. Это свидетельствовало о явных очаговых проявлениях полиморфизма изначально однотипных по структуре пирамидных нейронов поля СА3; 20 мин ООСА вызывала дегенеративные патоморфологические изменения пирамидных нейронов, что приводило к статистически значимому уменьшению их общей численной плотности. Максимально страдала популяция нейронов поля СА1. В ходе иммуногистохимического изучения постишемической компенсаторно- восстановительной реорганизации нервной ткани гиппокампа нами выявлены два основных структурных компартмента, для которых характерны максимальные изменения. Это тонкие периферические отростки астроцитов (GFAP) и зоны, обеспечивающие межнейронную коммуникацию – терминали (p38), дендриты (MAP-2). Эти компартменты локализуются в нейропиле, поэтому именно в нем происходят основные структурные изменения, связанные с приспособлением гиппокампа к новым условиям функционирования при перманентном уменьшении количества нейронов (Рисунок 1). По данным иммуногистохимического исследования, после 20 мин ООСА в поле СА3 уменьшалась плотность распределения р38-позитивных (синаптофизин) гигантских терминалей и появлялось большое количество пирамидных нейронов с признаками конденсации и фрагментации цитоскелета в перикарионе и дендритах при реакции на МАР-2. Деструкция цитоскелета в основном была характерна для нейронов с дегидратацией и сморщиванием, что, вероятно, свидетельствовало о сопровождающих эти изменения конформационных перестройках белков цитоскелета. В остром периоде после 20 мин ООСА появлялись очаги с низкой и высокой плотностью частиц р38-позитивного материала. Низкая плотность соответствовала зонам СА3 с высоким содержанием гиперхромных нейронов и выраженным проявлениям отека-набухания нервной ткани, а высокая плотность – зонам с преобладанием нормохромных нейронов. Через 1 сут после 20 мин ООСА происходило смещение в сторону увеличения доли полей зрения с низкой площадью меток р38. Это свидетельствовало о разрушении части синаптических терминалей и содержащегося в них р38. Однако уже через 3 суток после 20 мин ООСА было отмечено компенсаторное увеличение общей численной плотности и площади меченых (р38) терминалей. Далее показатели численной плотности терминалей были стабильными. Относительная площадь р38-позитивных частиц уменьшалась только в зоне апикальных дендритов (аксодендритические синапсы stratum lucidum) поля СА3, а в зоне скопления тел пирамидных нейронов СА3 (аксосоматические синапсы) этот показатель не менялся. Рисунок 1 – Основные участники процесса реорганизации межклеточных взаимоотношений в гиппокампе после 20 мин ООСА: а – нейроны слоя СА1 (MAP-2), б – нейроны слоя СА3 (MAP-2), в – синаптические терминали (p38), г – астроциты (GFAP). Иммуногистохимическое исследование. Объектив ×100, шкала – 20 мкм. В остром периоде (1 и 3 сут) после 20 мин ООСА в гиппокампе увеличивалась степень гидратации нервной ткани, изменялись тинкториальные свойства нейронов, разрушались дендриты (их цитоскелет) и синаптические терминали. Изменения были мелкоочаговыми (мозаичными), имели гетерохронный и гетероморфный характер, преобладали через 1 и 3 сутки. Несомненно, что при наличии подобных реактивных и патологических изменений после 20 мин ООСА неизбежно блокировалась передача импульсов и нарушалась межнейронная коммуникация энторинальной коры, гиппокампа и зубчатой извилины. После частичного разрушения терминалей активировались компенсаторно-восстановительные процессы за счет синаптической пластичности и постоянной реорганизации сохранившихся нейронных сетей. Одновременно реализовалась пластичность Геббеса и гомеостатическая пластичность – образование и гибель синапсов. Вероятно, что функциональное восстановление гиппокампа после 20 мин ООСА происходило быстро за счет реорганизации связей устойчивых к ишемии нейронов и сопровождалось образованием новых терминалей. При этом восстановление межнейронных отношений сохранившихся нейронов и их компенсаторная реорганизация происходили путем гипертрофии и образования избыточного количества синаптических терминалей с последующей их частичной элиминацией. Причинно-следственные временные сопоставления позволили считать, что в процессе восстановления межнейронных коммуникаций уменьшались проявления отека-набухания, восстанавливался цитоскелет нейронов, усиливались проявления реактивного астроглиоза, увеличивалась доля нейронов с двумя и более ядрышками. Все это рассматривается как условия, обеспечивающие реализацию механизмов защиты, адаптации, возможности активации нервных клеток и перестройки нейронных сетей под конкретное функционирование нейронных сетей. Усиливалась дренажно-детоксикационная функция астроцитов, активизировалась синаптическая пластичность, обеспечивающая постоянную реорганизацию сохранившихся нейронных сетей. Нами установлено, что при типировании р38 локализация его меток соответствовала таковой для каспазы-3. При этом в телах неповрежденных пирамидных нейронов каспаза-3 не выявлялась, она локализовалась только в терминалях аксодендритических, аксошипиковых и аксосоматических синапсов. По своей локализации каспаза-3 в поле СА3 соответствовала стратегическим зонам реализации механизмов синаптической пластичности. При этом большее ее количество было в терминалях аксошипиковых и аксодендритических синапсов. Это позволило предположить, что данный плейотропный фермент апоптоза может принимать участие в механизмах защиты, компенсации и восстановления межнейронных связей гиппокампа как в норме, так и после ишемического воздействия. При этом острая ишемия головного мозга, вероятно, стимулировала свойства каспазы-3, связанные не с конечной фазой апоптоза, а с механизмами нейропластичности. Вероятно, каспаза-3, как специфический протеолитический фермент, участвовала в ремоделировании межнейронных синапсов, обеспечивая более высокую подвижность синаптических терминалей в пространстве нейропиля. Для проверки этой гипотезы мы сравнивали площадь меток при иммуногистохимическом выявлении р38 и каспазы-3 в терминалях. Изучение апоптоза сводилось к определению активности про- (р53), антиапоптозных (bcl-2) белков и каспазы-3 в перикарионе нейронов. Существенно то, что через 1 сутки после 20 мин ООСА белки регуляции апоптоза (р53, bcl-2) выявлялись в единичных нейронах. Каспаза-3 имела высокую активность только в синаптических терминалях, а в перикарионах данный белок, как и в контроле, не отмечен. Мы полагаем, что при 20 мин ООСА не происходило выраженной гибели нейронов, поэтому элиминация нейронов путем апоптоза, как механизм удаления необратимо измененных нейронов, не был задействован. Единичные нейроны с признаками активации белков регуляции апоптоза без наличия активной каспазы-3 в цитоплазме сомы нейронов свидетельствовали только о принципиальной возможности реализации данного процесса. Активировались преимущественно защитные и компенсаторные механизмы, обеспечивающие не разрушение, а сохранение поврежденных нейронов. В результате большая часть дистрофически и дегенеративно измененных нейронов СА3 восстанавливалась до полнофункциональных нормохромных нейронов. Полученные данные свидетельствовали о существовании какой-то связи каспазы-3 и р38 в процессе изменения межнейронных взаимоотношений на уровне поля СА1 и, в меньшей степени, – СА3 гиппокампа. После 20 мин ООСА в гиппокампа были отмечены не только очаговые изменения плотности р38-, но и МАР-2-позитивного материала, свидетельствующие о выраженной конденсации цитоскелета, разрушении и дегидратации его белков. Подобные структурные изменения неизбежно приводили к нарушению функций цитоскелета части нейронов и, наряду с деструкцией р38, блокировали передачу импульсов по их отросткам. Найденные изменения цитоскелета в той или иной степени сохранялись на протяжении всего изученного временного периода, но в большей степени проявлялись через 1 и 3 сутки. Именно в это время после 20 мин ООСА отмечены максимальные проявления отека-набухания и наибольшее содержание дистрофически измененных темных нейронов. Далее (7 и 14 сут) происходило восстановление цитоскелета основной массы темных нейронов, а цитоскелет необратимо измененных сморщенных нейронов, вероятно, разрушался в течение длительного времени посредством фагоцитоза астроцитами и микроглиоцитами. В совокупности найденные изменения необходимо рассматривать как основу для длительной перманентной компенсаторно-восстановительной реорганизации нейронных сетей гиппокампа после острой транзиторной ишемии головного мозга. Полученные данные можно использовать при изучении феномена полиморфизма, селективного повреждения и восстановления нейронов гиппокампа после незначительного/умеренного диффузно-очагового повреждения нервной ткани. Любые, даже незначительные необратимые повреждения нейронов, неизбежно приводят к существенной реорганизации нейронных сетей гиппокампа. Функция погибших нейронов замещается перестройкой сохранившихся нейронов. Для восстановления функций гиппокампа после 20 мин ООСА было необходимо: уменьшение проявлений отека-набухания, восстановление цитоскелета нейронов, активация астроцитов, микроглиоцитов и олигодендроцитов, увеличение доли нейронов с двумя и более ядрышками, а также, как следствие, гипертрофия и образование избыточного количества синаптических терминалей с последующей их частичной элиминацией. Все это целесообразно рассматривать как условия, обеспечивающие реализацию механизмов естественной защиты, адаптации, возможности активации нервных клеток и перестройки нейронных сетей под конкретное функционирование нейронных сетей. Поэтому любая дисфункция вышеназванных структур закономерно приведет к дисфункции гиппокампальной формации в целом. Выявлено статистически значимое увеличение нейро-глиального индекса (НГИ). По данным иммуногистохимического изучения распределения GFAP, в остром периоде (1–3 сут) после 20 мин ООСА были выявлены структурные признаки отека-набухания и очаговой деструкции части отростков, преимущественно протоплазматических, астроцитов, что сопровождалось, вероятно, разрушением GFAP их глиофибрилл. Мощные стволы большей части волокнистых астроцитов не имели каких-либо признаков разрушения (фрагментация, истончение). После 20 мин ООСА в составе нейро-глио-микрососудистых комплексов гиппокампа одни астроциты атрофировались, а другие подвергались делению и гипертрофировались, глиальные сети гиппокампа подвергались пространственной реорганизации, которая, вероятно, была обусловлена, содной стороны, отеком-набуханием и деструкцией части отросткой астроцитов, с другой стороны, пролиферацией и гипертрофией астроцитов в ответ на ишемию. В остром периоде (1 и 3 сут) деструкции и фрагментации подвергались в основном тонкие отростки протоплазматических астроцитов. Затем (7 сут) плотность астроцитарной сети восстанавливалась и даже увеличивалась в молекулярном, полиморфном слоях и внутри слоя пирамидных нейронов. Далее признаки реактивного астроцитоза проявлялись через 7, 14 и через 30 суток во всех слоях гиппокампа, но превалировали в stratum radiatum, stratum lacunorum молекулярного слоя и полиморфном слое. По данным фрактального анализа в остром периоде после 20 мин ООСА происходила диффузно-очаговая деструкции и фрагментации части тонких отростков астроцитов. Фрактальная размерность увеличивалась, а лакунарность уменьшалась. Это было характерно для всех слоев гиппокампа (Рисунок 2, на примере поля СА3). Рисунок 2 – Фрактальная размерность и лакунарность глиальной сети поля СА3 гиппокампа белых крыс после ООСА. Q2 (Q1-Q2). МС − различия статистически значимы в сравнении с молекулярным слоем (Stratum radiatum), СН − слоем пирамидных нейронов (критерий Вилкоксона для зависимых выборок), К − контролем, П − предыдущим сроком (критерий Манна – Уитни). Нулевая гипотеза отвергалась при p < 0,05. Восстановление глиальной сети сопровождалось постепенным заполнением изученного фрактального пространства отростками астроцитов. С помощью фрактального анализа показано, что после 20 мин ООСА во всех слоях гиппокампа сначала происходила очаговая деструкция, а затем адаптивная пространственная 17 реорганизация астроцитарной сети (астроглиоз), которая, в конечном итоге, вероятно, обеспечивала высокую сохранность нейронной сети. Это происходило на фоне незначительного уменьшения общей численной плотности нейронов. Как и в полях СА1 и СА3 выявлена количественная гетерогенность и гетерохронность изменений пространственной организации астроцитарных отростков в молекулярном и полиморфном слоях зубчатой извилины. Более лабильными и реактивными были мелкие отростки астроцитов. Максимальные значения характеристик были выявлены в полимофном слое. В этот период мера структурной сложности глиальных сетей была существенно выше, а лакунарность ниже, чем в контроле и через 3 и 7 суток постишемического периода. При отсутствии выраженных очагов некроза и небольшом дефиците нейронов, увеличение площади реактивных волокнистых астроцитов следует рассматривать как свидетельство активации естественных защитных функций астроглии, направленное на сохранение и восстановление поврежденных нейронов. Реакция астроцитов разных отделов гиппокампальной формации на 20 мин ООСА отличалась. Имелись различия по степени изменений и времени их появления. ЗАКЛЮЧЕНИЕ После 20 мин ООСА дистрофические и нейродегенеративные изменения нейронов (темные нейроны, уменьшение общей численной плотности нейронов) приводили к активации дренажно-детоксикационной системы (проявления отека-набухания нейропиля, астроцитарных отростков), гиперплазии и гипертрофии астроцитов (изменения показателей фрактального распределения и лакунарности астроцитарной сети, слабые и умеренные проявления астроглиоза), а также активации микроглиоцитов и олигодендроцитов. В нашей работе было показано, что после 20 мин ООСА количество нейронов уменьшалось, а содержание глиальных клеток возрастало в 2-3 раза. Увеличение нейроглиального индекса сопровождалось: 1) появлением микрососудов с многочисленными разветвленными отростками перицитов, 2) усложнением пространственной организации базальных мембран, 3)структурными признаками активации процессов трансцитоза (большое количество кавеол, гладких и клатриновых везикул, крупных везикул) в перицитах и эндотелиальных клетках. Полученные данные свидетельствовали преимущественно о компенсаторно-восстановительных изменениях компонентов нейро-глио-сосудистых комплексов гиппокампа головного мозга белых крыс после 20 мин ООСА. С помощью методов фрактального анализа выявлена послойная гетерогенность постишемических изменений пространственной организации астроглиальной сети СА1, СА3 и зубчатой извилины. То есть, во всех этих отделах астроглиоз проявлялся по-разному. Наиболее выраженные изменения фрактальной размерности и лакунарности отмечены в молекулярном слое гиппокампа – месте сосредоточения основной части межнейронных синапсов и отростков протоплазматических астроцитов в нейропиле. Реактивные изменения астроцитов сводились к усложнению их доменов и повышению плотности GFAP-позитивных структур. Установлено, что гетерогенность и гетерохронность структурных изменений астроглиальной сети имели место и внутри отделов мозга, например, СА1, СА3 и зубчатая извилина по-разному приспосабливались к потере нейронов. По нашим данным, в гиппокампе после 20 мин ООСА больше страдали нейроны СА1. В этом поле вероятность необратимой дегенерации для темных нейронов была выше, чем в СА3, СА4 и зубчатой извилине. Таким образом, перспективным направлением при изучении механизмов естественной защиты нейронов после острой ишемии является изучение нейроглии. Именно целенаправленная регуляция активности ее клеток позволит максимально полно сохранить поврежденные нейроны и перепрограммировать их на процесс восстановления. В этой связи проведенное нами исследование может послужить для понимания морфологических изменений в гиппокампе при острой ишемии легкой и средней степени тяжести. ВЫВОДЫ 1. Нейроцито-, глиоцито-, синаптоархитектоника, ядерно-цитоплазматические и нейроглиальные отношения СА1, СА3, СА4 и зубчатой извилины головного мозга белых крыс в норме статистически значимо отличались. 2. Через 1–3 сут после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий в гиппокампе отмечены проявления отека-набухания нервной ткани до 15 %, в контроле – 6 % поля зрения, доля нормохромных нейронов уменьшалась до 23–27 %, вакуолизировались, разрушались дендриты и синаптические терминали (площадь меток р38 уменьшалась до 10–15 %, контроль 20–25 %). Изменения имели диффузно-мелкоочаговые гетерохронный и гетероморфный характер, отличались между полями гиппокампа. 3. Максимальная элиминация дегенеративно измененных темных нейронов происходила в поле СА1, общая численная плотность нейронов этого поля уменьшилась на 31 %, а в СА3 – на 20 %. Преобладала деструкция за счет механизмов коагуляционного некроза и фагоцитоза, а иммуногистохимические проявления апоптоза выявлялись в единичных нейронах. 4. Разрушение и элиминация нейронов после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий сопровождались компенсаторно-восстановительной реорганизацией нейроглиальных комплексов и межнейронных взаимоотношений. 5. Через 3 и 7 сут после окклюзии во всех отделах активировалась пролиферация нейроглии и клеток микрососудов (Ki-67), усиливалась экспрессия GFAP, увеличивался нейроглиальный индекс (до 1,5, контроль – 0,7), появлялось большое количество клеток-сателлитов и реактивных микроглиоцитов. 6. Астроглиоз проявлялся усложнением реорганизации астроглиоархитектоники за счет разветвления мелких отростков астроцитов. В разных отделах гиппокампа эти изменения различались по степени и времени их проявления. Максимальный перепад переменных «фрактальная размерность» и «лакунарность», характеризующих долю и форму отростков в пространстве, отмечен в молекулярном слое гиппокампа. 7. В процессе восстановления межнейронных коммуникаций в постишемическом периоде уменьшались проявления отека-набухания, снижалось содержание темных нейронов, восстанавливался цитоскелет нейронов, усиливались проявления реактивного астроглиоза, увеличивалась доля нейронов с двумя и более ядрышками (до 32–44%, контроль 15%), образовывалось избыточное количество синаптических терминалей. Одновременно реализовывались пластичность Геббеса и гомеостатическая пластичность. 8. Острая ишемия головного мозга стимулировала свойства плейотропного фермента каспазы-3, связанного с механизмами нейропластичности. Содержание каспазы-3 коррелировало с р38 синаптических терминалей.