Роль витамина D в патогенезе наружного генитального эндометриоза

Материалы и методы исследования. Работа выполнена в период с 2018 по
2021 гг. в гинекологическом отделении II отдела гинекологии и эндокринологии
(рук. отдела – проф. РАН, д.м.н., проф. М.И. Ярмолинская) и в гинекологическом
отделении I (с операционным блоком) отдела гинекологии и эндокринологии
(зав. отдел. – к.м.н., доц. А.А. Цыпурдеева) ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта»
в рамках фундаментального научного исследования по теме «Разработка стратегий
диагностики,терапиигенитальногоэндометриозаиопухолейженского
репродуктивного тракта»: АААА-А19-119030490009-6.
При выполнении данной работы было обследовано 440 женщин с диагнозом
НГЭ I-IV степени распространенности. В контрольную группу вошли 30 женщин без
гинекологическойпатологиисовуляторнымменструальнымциклом,
подтвержденным уровнем прогестерона в сыворотке крови в секреторную фазу
менструального цикла и наличием желтого тела при проведении ультразвукового
исследования органов малого таза.
Генетическое исследование выполнено в отделе геномной медицины ФГБНУ
«НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (рук. отдела – д.б.н. А.С. Глотов) под руководством д.б.н.,
проф. Т.Э. Иващенко. Исследование полиморфных вариантов гена VDR было
выполнено у 129 больных НГЭ и у 82 пациенток контрольной группы, представленной
женщинами популяции. Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов ПК проводили
в соответствии с методикой, приведенной в руководстве Сэмбрук Д. и соавт.
с некоторыми модификациями. Определение полиморфных вариантов гена VDR
проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими
олигопраймерами с последующим рестрикционным анализом.
Морфологическоеисследованиевключалогистологическоеи
иммуногистохимическоеисследования,атакжецифровуюмикроскопиюи
морфометрию.Гистологическоеисследованиеэндометрия,эндометриоидных
гетеротопий, полученных во время операционной лапароскопии, проводили
в патологоанатомическомотделенииФГБНУ«НИИАГиРим. Д.О. Отта»
по стандартной методике (зав. патологоанатомическим отделением к.м.н. Т.Г. Траль).
Иммуногистохимическоеисследованиебыловыполненов лаборатории
иммуногистохимиии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (зав. лабораторией –
д.м.н. Г.Х. Толибова).Вкачествесистемывизуализациииспользовали
abcamRabbitSpecific HRP Plus (ABC) Detection IHC Kit (RTU) [ab93697], (Abcam,
Великобритания). Для проведения иммуногистохимической реакции использовали
стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной
обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 6,0. Иммуногистохимический
метод исследования включал: количественную и качественную оценку экспрессии
рецепторов AntiVitamin D Reсeptor (клон ab 3508) в стандартном разведении 1:200
производства Abcam (Великобритания). Морфометрия была выполнена в программе
«Морфология 5.2». Исследование экспрессии VDR в эутопическом и эктопическом
эндометрии было выполнено 32 пациенткам с НГЭ. Отдельную контрольную группу
для анализа экспрессии VDR составили 20 женщин, которым проводилось
обследование по поводу бесплодия и при проведении диагностической лапароскопии
не было выявлено гинекологической патологии.
Экспериментальная модель на крысах выполнена на базе вивария ФГБНУ «НИИ
АГиР им. Д.О. Отта» (зав. виварием А.А. Воронов). При осуществлении экспериментальной
работы соблюдены все общие требования «Правил лабораторной практики
в Российской Федерации», утвержденные приказом Министерства здравоохранения
РФ № 199н от 01.04.2016 г. и Европейской конвенции Directive 2010/63/EU of
22 September 2010. Эксперимент выполнен на 45 половозрелых самках крыс линии
Wistar в 3 этапа. Первый этап – моделирование экспериментального эндометриоза.
Второй этап – диагностическая лапароскопия, оценка результатов моделирования.
Третий этап – выведение животных из эксперимента, аутопсия.
Статистическаяобработкаполученныхрезультатовпроводиласьс
использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Для
составления базы данных и статистического анализа использовали программы Excel,
Statistica 10, Jamovi. Описание количественных переменных с нормальным
распределением произведено через среднее значение и стандартное отклонение М
(SD), а в случае распределения, отличного от нормального – при помощи медианы,
25-го и 75-го квартилей Ме (Q1;Q3). Для проверки гипотез использованы
непараметрические критерии – критерий Вилкоксона для зависимых выборок, для
анализа ненормально распределённых данных в независимых выборках были
использованы: критерий Манна-Уитни, ранговый анализ вариаций по Краскелу-
Уоллису с последующим проведением множественных попарных сравнений
методом Двасса-Стила-Кричлоу-Флигнера (DSCF). Определение достоверности
различий частот производили с помощью точного двустороннего критерия Фишера по
стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений с контрольной
группой и с помощью критерия хи-квардрат (c2) по стандартной формуле с учетом
поправки Йетса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных
сравнений с контрольной группой. В случае наличия достоверных отличий между
контролем и исследуемой группой, также использовался коэффициент соотношения
шансов (oddsratio – OR). Статистически значимыми считались различия с уровнем
р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика больных генитальным эндометриозом. В основную группу были включены 440 пациенток репродуктивного возраста с эндометриоз-ассоциированным болевым синдромом. Средний возраст больных НГЭ составил 33,7±5,8 года. Средний возраст наступления менархе составил 12,9±1,1 лет. Большинство пациенток (85%, n=374) имели регулярный менструальный цикл, средняя продолжительность составила – 28,3±3,6 дней. Из нарушений менструального цикла наиболее часто встречались аномальные маточные кровотечения по типу межменструальных кровянистых выделений: у 42,5% (n=187) больных – после менструации, у 21,1% (n=93) – до, у 20,5% (n=90) – и до и после, а также АМК по типу ОМК – в 21,4% (n=94) и олигоменореи – в 15% (n=66) случаев. Установлено, что 94,1% (n=414) больных НГЭ предъявляли жалобы на хронические тазовые боли, диспареуния беспокоила 31,4% (n=138) пациенток, альгодисменорея отмечена у 91,6% (n=403) женщин. Было обнаружено, что у 8,4% (n=37) женщин в анамнезе были самопроизвольные выкидыши, у 15% (n=66) пациенток – неразвивающиеся беременности. Бесплодие было выявлено у 44,7% (n=197) женщин, из них у 61,9% (n=122) – первичное, у 38,1% (n=75) – вторичное. Всем пациенткам выполнялось оперативное вмешательство с применением лапароскопического доступа. НГЭ I степени был обнаружен у 10,2% (n=45) женщин, II степени – у 25,5% (n=112) больных, III степени – у 17,7% (n=78) и у 46,6% пациенток – IV степени (n=205). Клиническая характеристика женщин контрольной группы. Контрольную группу составили 30 женщин репродуктивного возраста без гинекологической патологии с овуляторным менструальным циклом. Средний возраст женщин контрольной группы составил – 26,3±3,1 лет. Возраст наступления менархе был равен 12,7±1,6 лет. Все пациентки имели регулярный менструальный цикл со средней продолжительностью 29,0±1,8 дней. Результаты определения уровня 25(ОН)D в периферической крови и в перитонеальной жидкости больных генитальным эндометриозом. Медианное значение уровня 25(ОН)D в ПК у больных НГЭ составило 22,1 (17,1; 28,0) нг/мл и было достоверно ниже (Манна-Уитни, p<0,001), чем в группе контроля – 36,0 (19,6; 52,8) нг/мл. У больных c распространенным эндометриозом уровень 25(ОН)D был ниже по сравнению с легкими формами заболевания, однако различия не были статистически значимы (Краскела-Уоллиса, p=0,267). У больных НГЭ I-II степени медианное значение уровня 25(ОН)D в ПК было равным 23,6 (20,4; 28,4) нг/мл, III- IV степени – 20,6 (16,2; 27,6) нг/мл. В обеих группах больных генитальным эндометриозом уровень 25(ОН)D в ПК был значимо ниже по сравнению с группой контроля (Краскела-Уоллиса, p=0,267; p<0,001). В группе пациенток, у которых определялся уровень 25(ОН)D в ПЖ, медианное значение 25(ОН)D в ПК составило 27,5 (20,4; 34,9) нг/мл, при этом у пациенток с I-II степенью распространенности заболевания – 27,9 (22,3; 34,9) нг/мл, а у больных с III-IV степенью НГЭ – 23,1 (13,4; 35,2) нг/мл. Медианное значение 25(ОН)D в ПЖ составило 5,2 (3,6; 9,1) нг/мл, у пациенток с I-II степенью НГЭ – 8,9 (4,9; 11,7) нг/мл, III-IV степенью – 3,6 (0; 5,2) нг/мл. У 24% пациенток с НГЭ уровень 25(ОН)D в ПЖ был ниже порога аналитической чувствительности метода, мы оценивали его как равным 0 нг/мл. Была выявлена зависимость между уровнем 25(ОН)D в ПК и ПЖ (критерий Вилкоксона, p=0,000003). В случае разделения на I-II и III-IV степени НГЭ зависимость сохранялась (критерий Вилкоксона, p=0,0007; p=0,001) (рисунки 1, 2). Рисунок 1 – Уровень 25(ОН)D в ПК и ПЖРисунок 2 – Уровень 25(ОН)D в ПК и ПЖ у пациенток с НГЭ I-II степени, нг/млу пациенток с НГЭ III-IV степени, нг/мл Зависимости уровня 25(ОН)D в ПК от распространенности заболевания среди пациенток выявлено не было (критерий Манна-Уитни, p=0,19) (рисунок 3). Однако, уровень 25(ОН)D в ПЖ, напротив, значимо зависел от степени распространенности заболевания (критерий Манна-Уитни, p=0,004) (рисунок 4). Рисунок 3 – Зависимость между уровнемРисунок 4 – Зависимость между уровнем 25(ОН)D в ПК и степенью25(ОН)D в ПЖ и распространенностью распространенности заболевания, призаболевания, при разделении разделении на I-II и III-IV степень НГЭ, нг/млна I-II и III-IV степень НГЭ, нг/мл Результаты генетического исследования. В настоящем исследовании определены частоты аллелей и генотипов по полиморфизмам локусов rs1544410 (BsmI), rs2228570 (FokI), rs731236 (TaqI) гена VDR у женщин с НГЭ и в популяции. В ходе статистической обработки данных выявлено, что частота аллеля G полиморфного варианта rs1544410 (BsmI) гена VDR достоверно выше в группе пациенток с НГЭ по сравнению с популяционной выборкой. Установлено наличие достоверных различий для генотипа G/G у больных НГЭ относительно группы контроля. Согласно коэффициенту соотношения шансов риск развития НГЭ в 1,9 раза выше при данном генотипе (OR=1,93; CI=1,082-3,450). В случае анализа rs2228570 (FokI) и rs731236 (TaqI) полиморфных вариантов гена VDR достоверных различий выявлено не было. Результаты иммуногистохимического исследования. Экспрессия VDR верифицироваласьв эпителиижелезэутопическогоэндометрияи в эндометриоидных гетеротопиях (рисунки 5, 6, 7), а также в эндометрии пациенток группы контроля. Рисунок 5 – Экспрессия VDR в железахРисунок 6 – Экспрессия VDR в железах и строме эутопического эндометрия фазыи строме эутопического эндометрия фазы пролиферации. ИГХ´400секреции. ИГХ´400 Рисунок 7 – Экспрессия VDR в эндометриоидной гетеротопии. ИГХ´200 Экспрессия VDR в эндометриоидных гетеротопиях была статистически значимо ниже по сравнению с экспрессией VDR в эутопическом эндометрии больных НГЭ: в 1,6 раза в пролиферативную фазу и в 2,1 раза в секреторную фазу менструального цикла (критерий DSCF р=0,01 и р<0,0001, соответственно). При сравнении экспрессии VDR в эндометриоидных гетеротопиях и в эндометрии пациенток группы контроля в секреторную фазу менструального цикла также отмечалось значимое снижение уровня экспрессии VDR в 2,2 раза при эндометриозе (критерий DSCF р=0,007). Однако, в пролиферативную фазу менструального цикла значимых различий между показателями экспрессии VDR в эндометриоидных гетеротопиях основной группы и в эндометрии пациенток группы контроля обнаружено не было (критерий DSCF p=0,413). Статистически значимые отличия экспрессииVDRв эндометриоидныхгетеротопияхв пролиферативнойи секреторной фазах менструального цикла не выявлены (критерий Манна-Уитни, p=0,808). Экспрессия VDR в эндометрии больных НГЭ статистически не отличалась в разные фазы менструального цикла (критерий Манна-Уитни, р=0,314), при этом в контрольной группе в секреторную фазу менструального цикла наблюдалось повышение экспрессии VDR в 1,5 раза по сравнению с данными показателями в пролиферативную фазу (критерий Манна-Уитни, р=0,043). Оценка влияния колекальциферола на очаги эндометриоза на модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс. Формирование модели экспериментальногоэндометриозабылоуспешнымв 97%случаев.После диагностической лапароскопии крысы случайным образом были разделены на 4 группы: группа А (n=8) в течение 3-х недель ежедневно перорально получала колекальциферол в дозе 2500 МЕ/кг (62,5 мкг/кг), группа В (n=6) – в дозе 5000 МЕ/кг (125 мкг/кг), группа С (n=13) – контрольная, лечение не получала, группа D (n=12) – группа сравнения, получала диеногест в дозе 1 мг/кг. На этапе аутопсии в группе А полная резорбция эндометриоидных гетеротопий отмечена в 12,5%, в 81,25% наблюдался регресс и лишь в 6,25% – незначительный рост. В группе В в 54,55% зафиксирована полная резорбция имплантатов (рисунки 8, 9), в 45,45% – регресс. Рисунок 8 – Диагностическая лапароскопия.Рисунок 9 – Аутопсия. Резорбция Эндометриоидная гетеротопия,эндометриоидной гетеротопии на фоне сформировавшаяся спустя 2 неделиперорального применения 5000 МЕ/кг с момента моделированияколекальциферола у той же крысы В группе С был отмечен прогрессивный рост очагов. В группе D в 50% случаев на фоне применения диеногеста отмечена полная резорбция, в 37,5% – регресс, в 8,3%. – размеры гетеротопий не изменились, в 4,2% был зафиксирован рост. Результатыоценкиэффективностивлиянияколекальциферола на выраженность болевого синдрома, изменение психоэмоционального фона у больных НГЭ. В зависимости от состава проводимой медикаментозной терапии 440 больных НГЭ с эндометриоз-ассоциированным болевым синдром были разделены на две подгруппы. Первую подгруппу составили 240 больных, 217 из них принимали колекальцферол в дополнение к стандартным схемам гормономодулирующей терапии: 104 пациентки в комбинации с аГнРГ 3,75 мг 1 раз в 28 дней внутримышечно в течение 6 месяцев, 113 женщин в комбинации с диеногестом 2 мг в течение 6 месяцев.Отдельнуюгруппусоставили23 пациентки,которыеполучали колекальциферолв качествемонотерапии.Даннаягруппапациентокимела противопоказания к стандартной гормономодулирующей терапии, либо отказалась от ее применения. На основании оценки динамики болевого синдрома по ВАШ более выраженное его уменьшение было отмечено в группе пациенток, получающих комбинированную терапию с колекальциферолом. При терапии только аГнРГ 3,75 мг болевой синдром отсутствовал у 77,7% (n=80) пациенток, в случае комбинированного применения аГнРГ 3,75 мг с колекальциферолом – у 92,3% (n=96) больных. При монотерапии диеногестом 2 мг болевой синдром отсутствовал в 74,2% (n=72) случаев по сравнению с группой, получавшей сочетанную терапию диеногестом 2 мг с колекальциферолом – 90,3% (n=102). В группе пациенток, которым после оперативного лечения была назначена монотерапия колекальциферолом, болевой синдром отсутствовал у 69,6% (n=16) женщин (рисунок 10). На основании оценки психоэмоционального фона, симптомы тревоги и депрессии были зарегистрированы у 262 (59,5%) женщин, из них 52 (11,8%) пациентки получали в качестве терапии НГЭ комбинацию аГнРГ с колекальциферолом,77 (17,5%)женщин–сочетаниедиеногеста2 мгс колекальциферолом, 6 (1,3%) больных – монотерапию колекальциферолом. Подгруппу сравнения составили 61 (13,9%) и 66 (15%) женщин, получавшие аГнРГ 3,75 мг 1 раз в 28 дней и диеногест 2 мг соответственно. Отсутствие симптомов тревоги и депрессии отмечалось у большинства пациенток, принимавших витамин D3: при сочетании применения колекальциферола c аГнРГ 3,75 мг – у 67,3% (n=35) больных, при совместном применении колекальциферола с диеногестом 2 мг – у 80,5% (n=62) пациенток; по сравнению с группой, получавшей только аГнРГ 3,75 мг – у 42,7% (n=26), и группой, получавшей монотерапию диеногестом 2 мг – у 72,2% (n=48). В группе больных, которые после оперативного лечения применяли монотерапию колекальциферолом, отсутствие симптомов тревоги и депрессии наблюдалось у 66,7% (n=4) (рисунок 11). Рисунок 10 – Динамика болевого синдромаРисунок 11 – Стабилизация на основании ВАШ при использованиипсихоэмоционального состояния на основании различных схем гормональной терапиишкалы тревоги и депрессии при применении различных схем гормональной терапии ВЫВОДЫ 1.Наиболее частыми клиническими проявлениями, характерными для больных НГЭ, являются болевой синдром, тревога и депрессия, а также бесплодие (44,7%, n=197), преимущественно первичное. Болевой синдром характеризуется у большинствапациентокхроническойтазовойболью(94,1%,n=414), альгодисменореей (91,6%, n=403), диспареуния встречается у 31,4% (n=138) пациенток. Симптомы тревоги и депрессии выявлены у 59,6% (n=262) больных НГЭ: при этом у 18,9% (n=83) пациенток установлена клинически выраженная тревога и депрессия (11 баллов и выше), у 40,7% (n=179) – субклинически выраженная тревога и депрессия (8-10 баллов). 2.У пациенток с НГЭ отмечено достоверное снижение уровня 25(ОН)D в ПК вне зависимости от степени распространенности заболевания. Установлена прямая корреляция между уровнем 25(ОН)D в ПК и ПЖ (критерий Вилкоксона, p=0,000003). Выявлена обратная зависимость между уровнем 25(ОН)D в ПЖ и степенью распространенностизаболевания(критерийМанна-Уитни,p=0,004). Распространенные формы НГЭ характеризуются более низким уровнем 25(ОН)D в ПЖ (при НГЭ III-IV степени медианное значение уровня 25(ОН)D в ПЖ составило 3,64 (0; 5,17) нг/мл; при НГЭ I-II степени – 8,9 (4,92; 11,69) нг/мл). 3.Частота встречаемости аллеля G полиморфного варианта rs1544410 (BsmI) гена VDR достоверно выше в группе пациенток с НГЭ по сравнению с популяционной выборкой. Установлено наличие достоверных различий для генотипа G/G у больных НГЭ относительно группы контроля. Согласно коэффициенту соотношения шансов, риск развития НГЭ в 1,9 раза выше при данном генотипе (OR=1,93; CI=1,082-3,450). 4.В эндометриоидныхгетеротопияхвыявленодостоверноеснижение экспрессии VDR по сравнению с эндометрием женщин контрольной группы в секреторную фазу менструального цикла в 2,2 раза (критерий DSCF, р=0,007), по сравнению с эутопическим эндометрием больных НГЭ в пролиферативную фазу в 1,6 раза, в секреторную фазу – в 2,1 раза (критерий DSCF, р=0,01; р<0,0001). Обнаружено отсутствие циклических изменений экспрессии VDR в эндометрии пациенток с НГЭ по сравнению с контрольной группой: экспрессия VDR в эндометрии больных НГЭ статистически не отличалась в различные фазы менструального цикла (критерий Манна-Уитни, р=0,314), а в контрольной группе в секреторную фазу менструального цикла экспрессия VDR была в 1,5 раза выше по сравнению с данными показателями в пролиферативную фазу (критерий Манна- Уитни, р=0,043). 5.На основании хирургически индуцированной модели эндометриоза установленположительныйдозозависимыйэффектколекальциферола,что обуславливает назначение больным генитальным эндометриозом максимальных допустимыхтерапевтическихдозпрепарата.Врезультатеприменения колекальциферола в дозе 2500 МЕ/кг/сут. в 12,5% наблюдалась полная резорбция эндометриоидныхочагов,в 81,3%отмечалсярегресс,приэтомв 6,3% регистрировался незначительный рост. Наибольшая эффективность отмечена при примененииколекальциферолав дозе5000 МЕ/кг/сут.:полнаярезорбция имплантатов – в 54,6%, в остальных случаях – регресс. В контрольной группе наблюдался прогрессивный рост очагов. 6.Включениеколекальциферолавсхемукомбинированнойтерапии генитального эндометриоза сопровождалось более выраженным уменьшением болевого синдрома по сравнению со стандартной гормональной терапией. При сочетанном назначении колекальциферола с аГнРГ болевой синдром отсутствовал у 92,3% (n=96) пациенток, при совместном применении колекальциферола с диеногестом – у 90,3% (n=102); в то время как в группах, получавших монотерапию аГнРГ или диеногестом, данный эффект был достигнут у 77,7% (n=80) и 74,2% (n=72) больных соответственно. Стабилизация и улучшение психоэмоционального фона также были более выражены при применении комбинированных схем терапии: при сочетании колекальциферола c аГнРГ симптомы тревоги и депрессии отсутствовали у 67,3% (n=35) больных, при совместном назначении колекальциферола с диеногестом 2 мг – у 80,5% (n=62) пациенток; при этом назначение только аГнРГ было эффективно в 42,7% (n=26), а монотерапия диеногестом 2 мг – в 72,2% (n=48) случаев. 7.Для лечения генитального эндометриоза целесообразно использовать колекальциферол в индивидульной дозе, определенной на основании исходного уровня 25(ОН)D и таблицы изменения его концентрации на фоне ежедневного потребления как в сочетании со стандартными схемами гормономодулирующей терапии (аГнРГ или диеногест 2 мг), так и в качестве монотерапии в течение не менее 6 месяцев. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для повышения эффективности лечения эндометриоза целесообразно достижение целевого уровня 25(ОН)D в ПК, равного 40-60 нг/мл. Подбор дозы колекальциферола следует проводить индивидуально, учитывая исходный уровень 25(ОН)D и изменения его концентрации на фоне ежедневного потребления. Как для комбинированной, так и для монотерапии, больным НГЭ рекомендованы наиболее высокие допустимые терапевтические дозы. 2. На фоне применения колекальциферола каждые 3 месяца рекомендовано проводить в динамике определение уровня 25(ОН)D и биохимических показателей: общий билирубин, АЛТ, АСТ, с целью возможной коррекции назначаемой дозы препарата. 3. Для повышения эффективности терапии (уменьшения выраженности болевого синдрома и стабилизации психоэмоционального фона) у больных НГЭ следует рекомендовать колекальциферол в индивидуальной дозе 4000-10000 МЕ ежедневно, принимаемой однократно либо дробно, на период от 6 месяцев в сочетании с диеногестом 2 мг ежедневно или аГнРГ 3,75 мг внутримышечно 1 раз в 28 дней. 4. При наличии противопоказаний, плохой переносимости или отказе от применениягормономодулирующейтерапииколекальциферолв качестве монотерапии следует назначать в дозе 4000-10000 МЕ ежедневно не менее чем на 6 месяцев. 5. Для определения группы риска развития наружного генитального эндометриоза рекомендовано исследование полиморфного варианта rs1544410 (BsmI) гена VDR.