«Синтез и химико-фармацевтическая характеристика новых биологически активных производных 3-метилксантина»

Методом ТСХ с использованием пластинок «Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ» (Imid ltd.) определяли чистоту синтезированных веществ. Обнаружение пятен проводили в УФ свете (при 254 нм) и с использованием влажной камеры с йодом.
Определение температуры плавления проводили на приборе «Stuart SMP30» (Великобритания). Элементный анализ синтезированных соединений соответствует вычисленным значениям с отклонением не более +0,4 %.
Спектры в ИК области сняты на приборе «Инфралюм-ФТ-02» (Россия) с использованием дисков калия бромида. На приборе «Bruker AМ-300» (Германия) записаны 1Н ЯМР-спектры с рабочей частотой 300 МГц, на приборе «Bruker AV-500» (Германия) записаны 1Н ЯМР-спектры рабочей частотой 500 МГц и 13C ЯМР-спектры с рабочей частотой 125 МГц. Растворителями служили дейтерированные хлороформ и ДМСО, в качестве внутреннего стандарта использованы сигналы растворителей или тетраметилсилана.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Синтез исходных соединений
В качестве исходных соединений использовали продажный 8-бром-3-метилксантин (1), а
также эпитиохлоргидрин (2) и 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантин (3), синтезированные по известным методикам.
Алкилированием исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантина 3 бромистым изобутилом в ДМФА в присутствии калия гидроксида при температуре 60 0С в течение 6 ч синтезировали 8-бром-1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантин (4) с выходом 62 % (схема 1).
Окислением соединения 4 пероксидом водорода в ледяной уксусной кислоте получен 8- бром-1-изобутил-3-метил-7-(1-оксотиетанил-3)ксантин 5 с выходом 83% (схема 1).
Окислением соединения 4 калия перманганатом в ледяной уксусной кислоте синтезирован 8-бром-1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантин 6 с выходом 79% (схема 1).
В ЯМР 1Н-спектре соединения 4 регистрируются сигналы протонов изобутильного заместителя в виде дуплета (СН3)2 группы при 0,91 м.д. с КССВ 6,7 Гц, мультиплета СН группы при 2,12-2,20 м.д. и дуплета 1-СН2 группы при 3,89 м.д. с КССВ 7,5 Гц; синглет протонов 3-СН3
группы при 3,51 м.д.; характерные сигналы протонов тиетанового цикла в виде мультиплетов двух S(CH)2 групп при 3,26-3,30 м.д. и 4,34-4,38 м.д., а также мультиплета 7-СН группы при 5,94- 6,01 м.д. В ЯМР 13C-спектре соединения 4 сигналы углеродов изобутильного заместителя регистрируются при 20,06 ((СН3)2), 27,12 (СН) и 48,56 м.д. (1-СН2), тиетанового цикла – при 34,92 (S(CH2)2) и 52,97 м.д. (7-CH), наблюдаются также сигналы углеродов 3-метилксантина.
Схема 1
В ЯМР 1Н-спектре соединения 5 смещение мультиплета 7-СН группы в сторону слабых полей на 0,52 м.д. по сравнению с исходным соединением 4 свидетельствует об образовании тиетаноксидного цикла, который существует в виде одного стерически наиболее устойчивого цис-изомера. В спектре ЯМР 13С соединения 5 наблюдается смещение сигнала углеродов S(CH2)2 группы в сторону слабых полей на 20,37 м.д. по сравнению с соединением 4.
В ЯМР 1Н-спектре соединения 6 наблюдается смещение мультиплета одной S(CH)2 группы на 1,09 м.д. в сторону слабых полей, 7-СН группы на 0,36 м.д. в сторону сильных полей по сравнению с исходным соединением 4. Смещение сигналов углеродов S(CH2)2 группы на 35,18 м.д. в сторону слабых полей и 7-СН группы на 12,62 м.д. в сторону сильных полей в спектре ЯМР 13С соединения 6 по сравнению с соединением 4 также подтверждает образование тиетандиоксидного цикла.
Строение соединений 4-6 подтверждается также ИК спектрами. В ИК спектре соединения 4 отсутствует поглощение N1-H связи. В ИК спектре соединения 5 присутствует полоса поглощения валентных колебаний S=O связи при 1049 см-1, в ИК спектре соединения 6 – полосы поглощения валентных колебаний связей SO2 группы при 1148 и 1323 см-1.
2. Синтез 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы.
Среди продуктов реакций тиетансодержащих 1-алкилзамещенных 8-бром-3- метилксантинов с аминами найдены вещества, проявляющие различную биологическую активность. Однако реакции 8-бром-1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы, с аминами до сих пор не изучены.
2.1. Синтез 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановый цикл.
Кипячением соединения 4 с различными циклическими (пиперидин, морфолин, гексаметиленимин) и ациклическими (бензиламин, моноэтаноламин) аминами в этаноле в течение 6-7 ч получены 8-аминозамещенные 1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантины (7-11) с выходом 64-83 % (схема 2).
Схема 2
Кипячением соединения 4 с трисамином в ДМФА в течение 1 ч получен 8-диметиламино- 1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантин 12 с выходом 46 % (схема 3), что объясняется реакцией ДМФА с трисамином с образованием диметиламина, который замещает атом брома.
Схема 3
В спектрах ЯМР 1Н и 13С соединений 7-12, кроме сигналов тиетанового цикла и 1,3- дизамещенного ксантина, регистрируются сигналы остатков аминов. Например, в ЯМР 1Н- спектре соединения 7 регистрируется мультиплет (СН2)3 группы при 1,63-1,74 м.д. и триплет N(CН2)2 группы при 3,12 м.д. с КССВ 5,05 Гц. Сигналы углеродов остатка пиперидина в спектре ЯМР 13С регистрируются при 23,95 (CH2(CH2)2), 25,42 (CH2(CH2)2) и 52,63 м.д (N(CH2)2).
Строение соединений 7-12 подтверждается также ИК спектрами. Например, в ИК спектре соединения 10 присутствует полоса поглощения валентных колебаний N-H связи в интервале 3230-3380 см-1, в ИК спектре соединения 11 – широкая полоса поглощения валентных колебаний N-H и О-Н связей в интервале 3250-3480 см-1.
2.2. Синтез 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих оксотиетановый цикл
Синтез 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метил-7-(1-оксотиетанил-3)ксантинов (13-19) проводили кипячением соединения 5 с пиперидином, морфолином, гексаметиленимином,
бензиламином, циклогексиламином, моноэтаноламином в этаноле в течение 5-8 ч (13-18) или с
трисамином в ДМФА в течение 1 ч (19), выход продуктов составил 10-70 % (схема 4).
Схема 4
В спектрах ЯМР 1Н и 13С соединений 13-19 содержатся сигналы 1,3-дизамещенного ксантина, оксотиетанового цикла и остатков соответствующих аминов. О сохранении оксотиетанового цикла свидетельствуют сигналы протонов двух S(CН)2 групп в виде мультиплетов в интервалах 3,16-3,43 м.д. и 4,02-4,44 м.д., 7-СН группы в интервале 5,97-6,38 м.д. в спектрах ЯМР 1Н, а также сигналы углеродов S(CН2)2 группы около 56 м.д. и 7-СН группы около 50 м.д. в спектрах ЯМР 13С. Оксотиетановый цикл существует в виде одного стерически наиболее устойчивого цис-изомера, конфигурация которого сохраняется в реакциях с аминами.
В ИК спектрах соединений 13-19 присутствует полоса поглощения валентных колебаний S=O связи около 1063 см-1, что также подтверждает сохранение оксотиетанового цикла.
2.3. Синтез 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих диоксотиетановый цикл
Синтез 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинов (20- 25) проводили кипячением соединения 6 с пиперидином, морфолином, гексаметиленимином, бензиламином, моноэтаноламином и трисамином в этаноле до 3,5 ч (20-24) или в ДМФА в течение 1 ч (25). Выход продуктов составил 39-83 % (схема 5).
Схема 5
В спектрах ЯМР 1Н и 13С соединенияй 20-25 регистрируются сигналы 1,3-дизамещенного ксантина, диоксотиетанового цикла и остатков соответствующих аминов. В спектрах ЯМР 1Н
наличие сигналов протонов двух S(CН)2 групп в виде мультиплетов в интервалах 4,19-4,59 м.д. и 4,86-5,21 м.д., а также мультиплета 7-СН группы в интервале 5,05-5,36 м.д. свидетельствует о сохранении диоксотиетанового цикла. В спектрах ЯМР 13С сигналы углеродов 7-СН группы и S(CН2)2 группы регистрируются около 38 м.д и 70 м.д., соответственно.
В ИК спектрах сохранение диоксотиетанового цикла в соединениях 20-25 подтверждается полосами поглощения валентных колебаний связей SO2 группы около 1140 и 1320 см-1.
3. Синтез 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановые циклы, и их солей
Среди 1-алкилзамещенных 2-(3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот и их солей, содержащих тиетановые циклы, известны вещества, влияющие на гемостаз. Поэтому синтез ранее не изученных тиетансодержащих 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот и их солей представляет интерес с целью поиска биологически активных веществ.
3.1. Синтез 2-[1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты и ее солей
Кипячением соединения 4 с тиогликолевой кислотой в присутствии калия гидроксида в смеси вода-этанол (объемное соотношение 1:1) в течение 1,5 ч получали 2-[1-изобутил-3-метил- 7-(тиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусную кислоту 26 с выходом 91 % (схема 6).
В спектре ЯМР 1Н кислоты 26, кроме сигналов протонов тиетанового цикла и алкильных заместителей, регистрируется синглет 8-SCH2 группы остатка тиогликолевой кислоты при 4,05 м.д. Наличие остатка тиогликолевой кислоты подтверждается также сигналами углеродов 8- SCH2 группы при 34,86 м.д. и С=О группы при 171,15 м.д. в спектре ЯМР 13C.
В ИК спектре соединения 26 наличие остатка тиогликолевой кислоты подтверждается широкой полосой поглощения валентных колебаний О-Н связи в интервале 3000-3320 см-1.
Схема 6
Соли 2-[1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты (27-35) получены реакцией соединения 26 с соответствующими основаниями в ацетоне или в диэтиловом эфире (32). Взаимодействие кислоты 26 с пиперазина гексагидратом в метаноле
приводит к пиперазина ди-(2-[1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантинил-8-тио]ацетату) (36) (схема 6). Выход солей составил 56-84 %.
В спектрах ЯМР 1Н солей 27-36 и в спектрах ЯМР 13C солей 27, 29-32, 34-36, кроме сигналов протонов остатка кислоты 26, регистрируются сигналы протонированных аминов. Например, в спектре ЯМР 1Н соли 29 наблюдаются триплеты NCH2 группы при 2,81 м.д. и ОCH2 группы при 3,55 м.д. с КССВ 4,9 Гц. В спектре ЯМР 13C соли 35 наблюдаются сигналы при 43,11 м.д. и 63,86 м.д., соответствующие углеродам N(CH2)2 и O(CH2)2 групп.
В спектре ЯМР 1Н строение соединения 36, содержащего два остатка кислоты 26, подтверждается отношением интенсивностей синглета N(CH2)2 групп при 2,88 м.д. и синглета 8- SCH2 групп при 3,95 м.д., равным 8:4.
Протонирование NH2 группы N,N-диметилэтилендиамина подтверждается отсутствием поглощения валентных колебаний непротонированных N-H связей в ИК-спектре, в котором наблюдается поглощение колебаний N+-H связей в интервале 2300-3100 см-1, а также наличием синглета непротонированной N(CH3)2 группы при 2,13 м.д. в ЯМР 1Н-спектре соли 32.
Строение солей 25-36 подтверждается также ИК спектрами. Например, в ИК-спектрах калиевой 27 и натриевой 28 солей отсутствует поглощение валентных колебаний О-Н связи в интервале 3000-3320 см-1, характерное для кислоты 26.
3.2. Синтез 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1-оксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты и ее солей
Кипячением соединения 5 с тиогликолевой кислотой в присутствии калия гидроксида в этаноле в течение 1,5 ч с выходом 85% синтезирована 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1-оксотиетанил- 3)ксантинил-8-тио]уксусная кислота (37) (схема 7).
Схема 7
В спектре ЯМР 1Н кислоты 37 наблюдаются синглет 8-SCH2 группы при 4,14 м.д., сигналы тиетаноксидного цикла и алкильных заместителей. Оксотиетановый цикл существует в виде одного стерически наиболее устойчивого цис-изомера, конфигурация которого сохраняется в реакции с тиогликолевой кислотой. В ЯМР 13C-спектре с кислоты 37 сигналы углеродов остатка тиогликолевой кислоты регистрируются при 36,40 м.д. (8-SCH2) и 170,25 м.д (С=О).
В ИК спектре соединения 37 широкая полоса поглощения валентных колебаний О-Н связи в интервале 2260-2800 см-1 подтверждает наличие остатка тиогликолевой кислоты, присутствует также полоса поглощения валентных колебаний S=O связи при 1050 см-1.
Реакцией соединения 37 с соответствующими основаниями в диоксане с выходом 53-96 % получены соли 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1-оксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты (38-47). Соединение 47 выделено в виде пиперазина ди-(2-[1-изобутил-3-метил-7-(1- оксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]ацетата) (схема 7).
ЯМР 1Н-спектры солей 38-47 содержат сигналы протонов тиетаноксидного цикла, алкильных заместителей, остатка тиогликолевой кислоты, а также сигналы протонированных аминов. Например, в спектре соли 40 регистрируются триплеты NCH2 группы при 2,82 м.д. и ОCH2 группы при 3,56 м.д. с КССВ 5,15 Гц.
Наличие двух остатков кислоты 37 в структуре соли 47 подтверждается отношением интенсивностей синглета N(CH2)2 групп при 2,89 м.д. и синглета 8-SCH2 групп при 3,93 м.д., равным 8:4.
Строение солей 38-47 подтверждается также ИК спектрами. Например, в ИК спектрах калиевой 38 и натриевой 39 солей отсутствует полоса поглощения валентных колебаний О-Н связи в интервале 2260-2800 см-1, характерная для кислоты 37.
3.3. Синтез 2-[1-изобутил -3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты и ее солей
Кипячением соединения 6 с тиогликолевой кислотой в присутствии калия гидроксида в смеси вода-этанол (объемное соотношение 1:1) около 1 ч с выходом 91 % получали 2-[1- изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусную кислоту (48) (схема 8).
Схема 8
В ЯМР 1Н-спектре кислоты 48, кроме сигналов протонов тиетандиоксидного цикла и алкильных заместителей, регистрируется синглет протонов 8-SCH2 группы при 4,09 м.д. В спектре ЯМР 13C кислоты 48 наличие остатка тиогликолевой кислоты подтверждается сигналами углеродов 8-SCH2 группы при 36,32 м.д. и С=О группы при 169,82 м.д.
В ИК спектре соединения 48 остаток тиогликолевой кислоты подтверждается широкой полосой поглощения валентных колебаний О-Н связи в интервале 3100-3400 см-1.
Соли 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты (49-58) выделены в ацетоне (49-51, 53) или диоксане (52, 54) взаимодействием соединения 48 с соответствующими основаниями. Соединение 58 выделено как пиперазина ди-(2-[1-изобутил-3- метил-7-(1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]ацетат) (схема 8). Выход солей составил 69-89 %.
В ЯМР 1Н-спектрах солей 49-58 регистрируются сигналы протонов диоксотиетанового цикла, метильного и изобутильного заместителей, остатка тиогликолевой кислоты, а также сигналы протонированных аминов. Например, протоны остатка N,N-диметилэтилендиамина в ЯМР 1Н-спектре соединения 54 регистрируются в виде синглета N(CH3)2 группы при 2,13 м.д., триплетов NCH2 группы при 2,39 м.д. и N+CH2 группы при 2,81 м.д. с КССВ 6,2 Гц.
В ЯМР 1Н-спектре соединения 58, наличие двух остатков кислоты 48, подтверждается отношением интенсивностей синглета N(CH2)2 групп при 2,90 м.д. и синглета 8-SCH2 групп при 3,94 м.д., равным 8:4.
Строение солей 49-58 подтверждается также ИК спектрами. Например, в ИК спектрах калиевой 49 и натриевой солей 50 отсутствует поглощение валентных колебаний О-Н связи в интервале 3100-3400 см-1, характерное для кислоты 48.
4. Анализ результатов биологических исследований и химико-фармацевтическая характеристика 8-замещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы
В соответствии с поставленными задачами синтезированные 8-замещенные 1-изобутил-3- метилксантины, содержащие тиетановые циклы, были изучены на антиагрегационную и антиоксидантную активность. При определении антиагрегационной активности с целью более полного исследования влияния синтезированных соединений на гемостаз была изучена также их антикоагуляционная активность.
4.1. Антиагрегационная и антикоагуляционная активность
Исследования 52 новых производных ксантина на антиагрегационную и антикоагуляционную активность выполнены на базе ЦНИЛ ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России и ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова под руководством д.м.н. Самородова А.В. Исследования проведены в соответствии с рекомендациями “Руководства по доклиническому изучению новых фармакологических веществ”.
Влияние синтезированных соединений и препаратов сравнения на агрегацию тромбоцитов изучали по методу Born на агрегометре “АТ-02” (НПФ “Медтех”, Россия) in vitro в концентрации 2 ммоль/л. Индукторами агрегации тромбоцитов служили аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл (Технология-Стандарт, г. Барнаул, Россия). В качестве препаратов сравнения использовали пентоксифиллин (ОАО «Дальхимфарм», Россия) и ацетилсалициловую кислоту (Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай).
Изучение антикоагуляционной активности проводили клоттинговыми тестами на турбидиметрическом гемокоагулометре Solar GGL 2110 (ЗАО “СОЛАР”, Беларусь). Определены показатели: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПВ) и концентрация фибриногена по A.Clauss. Исследуемые соединения и препараты сравнения использовали в концентрации 5×10-4 г/мл. При определении антикоагуляционной активности препаратом сравнения служил «Гепарин натрия» (ОАО «Синтез», Россия). В работе использовались реактивы производства “Технология-Стандарт” (г. Барнаул, Россия).
Исследования выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте от 18 до 24 лет.
Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России (протокол No2 от 17.10.2012). Информированное согласие получено у всех участников исследования.
По результатам биологических исследований на антиагрегационную активность в АДФ- индуцированной агрегации тромбоцитов (максимальная амплитуда и скорость агрегации) соединения 8 и 9 в 1,5 раза активнее препарата сравнения – ацетилсалициловой кислоты. При этом соединения 8 и 9 в 10 раз эффективнее ацетилсалициловой кислоты удлиняют латентный период агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном. Однако в данных моделях активность соединений 8 и 9 уступает препарату сравнения пентоксифиллину. Активность на уровне ацетилсалициловой кислоты в АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов проявляют соединения 10, 13, 15, 22, 26, 34, 43, 48, которые эффективнее ацетилсалициловой кислоты удлиняют латентный период агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном. Соединения 17, 19, 28, 35, 41, 44, 47, 56 в обеих модельных системах агрегации тромбоцитов значительно уступают ацетилсалициловой кислоте. В АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов соединения 11, 38, 40, 58, 59 проявляют проагрегантную активность.
Наибольшую антикоагуляционную активность проявляют соединения 7, 16, 26, 34, 49, 51, увеличивая АПТВ на 10,3-13,1 % по сравнению с контролем. Однако показатели изученных соединений не превышают значение АПТВ гепарина натрия, которое составляет 20,3 %. Синтезированные соединения не влияли на ПВ и концентрацию фибриногена.
Таким образом, по результатам исследования антиагрегационной активности обнаружены вещества (8, 9), проявляющие антиагрегационную активность, превышающую показатели ацетилсалициловой кислоты, при этом уступающую значениям пентоксифиллина. Наибольшую антикоагуляционную активность проявило соединение 7, удлиняя АПТВ на 13,1 %, уступая показателю гепарина натрия.
4.2. Антиоксидантная активность
Исследование антиоксидантной активности 48 новых производных ксантина проводили на базе ЦНИЛ ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России и ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова под руководством д.м.н. Самородова А.В. Антиоксидантную активность синтезированных соединений изучали in vitro с использованием экспресс-метода, основанного на регистрации хемилюминесценции, возникающей при взаимодействии свободных радикалов с люминолом.
Исследования были проведены на двух модельных системах: на модельной системе, в которой протекают реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) (модель I) и на модельной системе, генерирующей активные формы кислорода в фагоцитах крови (модель II). Хемилюминесценцию регистрировали в течение 5 минут на приборе «ХЛМ-003» (Россия). Оценивали светосумму свечения (S, у.е.) и максимальную интенсивность свечения (Imax, у.е.). Исследуемые соединения и препарат сравнения – аскорбиновую кислоту (субстанция, Хэбэй Вэлком Фармасьютикал Ко. Лтд, Китай) добавляли в конечной концентрации 1×10-3 моль/л.
По результатам проведенных исследований большинство соединений, за исключением 27, 29, 43, 52, 54, уменьшают светосумму свечения и максимальную интенсивность свечения на модели I. Данные показатели свидетельствует о том, что исследуемые соединения обладают способностью нейтрализовать перекисные липидные радикалы, однако они уступают препарату сравнения – аскорбиновой кислоте. Соединения 27, 29, 52, 54 на модели I проявляют прооксидантную активность, а соединение 43 увеличивает светосумму свечения, но уменьшает максимальную интенсивность свечения.
На модели II аскорбиновая кислота проявляет прооксидантную активность и активирует фагоцитоз. Аналогичный эффект оказывают соединения 52, 53, 54, 56. Соединение 52 по медиане
светосуммы свечения превосходит препарат сравнения – аскорбиновую кислоту на 14 %, уступая по максимальной интенсивности свечения на 34 %. Остальные соединения оказывают антиоксидантную активность. Соединения 20, 47, 48, 59 на данной модели проявляют наиболее высокую антиоксидантную активность и ингибируют активность фагоцитов на 84,7-91,7 % по светосумме свечения и на 84,5-93,4 % по максимальной интенсивности свечения.
Таким образом, большинство синтезированных соединений на модельной системе ПОЛ (модель I) оказывают антиоксидантную активность, уступая аскорбиновой кислоте. Однако соединения 20, 47, 48, 59 на модельной системе, генерирующей активные формы кислорода в фагоцитах крови (модель II), в отличие от аскорбиновой кислоты оказывают ингибирующий эффект на генерацию активных форм кислорода фагоцитами, что стимулирует их дальнейшее биологическое исследование как антиоксидантных веществ.
Особый интерес представляет 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил- 3)ксантинил-8-тио]уксусная кислота 48, проявляющая высокую антиоксидантную активность, производное которой – соединение 52 проявляет высокую прооксидантную активность. Соединение 48 было выбрано для изучения его химико-фармацевтических характеристик.
4.3. Прогноз потенциальной биологической активности
и токсических рисков
Проведенный с помошью программы PASS-online прогноз фармакологических эффектов
исходных 8-бром-1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы (4-6), 8- аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы (7-25), и 2-(3- метилксантин-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановые циклы (26, 37, 48), показывает высокую вероятность проявления иммуномодулирующей активности и стимуляции функции почек, а также способности ингибировать АТФазы протеосом и фосфодиэстеразы.
Прогноз токсических рисков и физико-химических параметров синтезированных соединений проводили при помощи программы «Data warrior». Для всех синтезированных соединений не прогнозируются такие токсические риски, как мутагенность, онкогенность, влияние на репродуктивность и раздражающий эффект. Все синтезированные соединения имеют отрицательное значение показателя drug-likeness, что свидетельствует о том, что их молекулы содержат последовательность атомов, не встречающуюся в структуре известных лекарственных средств. Наибольшой новизной структуры обладают соединения 5, 6, 9, 15, 17, 20, у которых drug-likeness составляет от -5,18 до -7,93.
Все синтезированные соединения обладают коэффициентом распределения (logP) не более 5, числом акцепторов водородной связи не более 10 и числом доноров водородной связи не более 5, что отвечает «правилу пяти Липинского». Молекулярная масса соединений 31, 41, 42, 52-58 незначительно превышает 500. Значение TPSA (показатель биодоступности молекулы) не должен превышать 140. Значения TPSA соединений 4-25, 59, 60 составляют от 69 до 133, данные соединения должны обладать хорошей биодоступностью. Значения TPSA соединений 26-58 составляют 146-166, что говорит об их возможной удовлетворительной биодоступности. Наилучшая биодоступность прогнозируется для соединений 4, 5, 7-10, 12, 13, 15, 19, 59, у которых TPSA не превышает 100.
4.4. Химико-фармацевтическая характеристика 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1- диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты
Для дальнейших фармакологических исследований 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1- диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты 48 требуется контроль качества синтезированных партий.
Химико-фармацевтическую характеристику соединения 48 проводили с использованием ОФС «Фармацевтические субстанции», «Растворимость», «Спектрометрия в инфракрасной области», «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой области», «Температура плавления», «Потеря в массе при высушивании», «Родственные примеси в фармацевтических субстанциях и лекарственных препаратах», «Высокоэффективная жидкостная хроматография» и других, приведенных в ГФ XIV издания; реактивы готовили по ОФС «Реактивы» ГФ XIV издания.
Все синтезированные партии 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил- 8-тио]уксусной кислоты 48 представляют собой белые кристаллические порошки без запаха.
Таблица 1
Растворитель
Диметилформамид Ацетон
Ацетонитрил Этанол
Хлороформ Вода
Растворимость соединения 48
Растворимость
Легко растворимо
Мало растворимо
Мало растворимо
Очень мало растворимо (медленно)
Очень мало растворимо или практически нерастворимо
Практически нерастворимо
Растворимость соединения 48 определяли в разных растворителях с различной полярностью с целью охвата широкого интервала растворимости (таблица 1).
Рисунок 1 – ИК спектр соединения 48.

В ИК спектрах соединения 48, снятых в дисках с калия бромидом, регистрируются полосы поглощения валентных колебаний связей SO2 группы при 1127 см-1 и 1312 см-1, C=O и C=N связей при 1642, 1701 и 1744 см-1, а также широкая полоса поглощения валентных колебаний О-Н связи в интервале 3100-3400 см-1 (рисунок 1). В ИК спектрах всех образцов положения и интенсивности полос поглощения идентичны.
Рисунок 2 – УФ спектр 0,002 % раствора соединения 48 в 95 % этаноле.
Спектры поглощения в УФ области 0,002 % растворов соединения 48 в 95 % этаноле и 0,1 М растворе натрия гидроксида в интервале от 210 нм до 350 нм характеризуются наличием двух максимумов поглощения и одного минимума поглощения. Спектры поглощения в 95 % этаноле более стабильны (рисунок 2). Расхождения в максимумах и минимумах поглощения не превышают +0,6 нм (таблица 2).
Данные УФ спектрофотометрии соединения 48 в 95 % этаноле
Таблица 2
Партия
λ max1, нм
λ max2, нм
295,3 295,9 294,7 294,9 295,1
λ min, нм
260,1 260,7 259,4 259,7 259,9
Интервал значений λ max1, нм
219,6+0,6
Интервал
значений λ max2, нм
295,2+0,6
Интервал значений λ min, нм
260,0+0,5
1 220,2
2 219,3
3 219,8
4 219,5
5 219,1

При проведении мурексидной пробы (общей реакции подлинности производных ксантина) образуется красно-фиолетовое окрашивание.
Наиболее характерной для определения подлинности соединения 48 является реакция с раствором железа (III) хлорида 3 % с предварительной нейтрализацией 0,1 М раствором натрия гидроксида. В результате реакции выпадает светло-коричневый осадок, который растворяется в хлороформном слое.
Таблица 3 Температуры плавления и потеря в массе при высушивании соединения 48
Партия
1 2 3 4 5
Средние значения Т.пл. по результатам трех измерений каждой партии, 0С
234,7 235,3 235,5 234,9 234,6
Интервал значений Т.пл. по результатам измерений всех партий, 0С
234,6-235,5
Потеря в массе при высушивании, %
0,12 0,13 0,11 0,10 0,13
По результатам средних значений температуры плавления соединения 48, вычисленным из трех измерений каждой партии, интервал температуры плавления (капиллярный метод) составляет 234,6-235,5 0С (таблица 3).
По результатам испытаний каждой партии соединения 48 потеря в массе при высушивании (способ 1) составила не более 0,2 % (таблица 3).
С целью обнаружения примесей соединения 48 хроматографирование проводили в разных элюентах. По результатам хроматографирования неочищенного образца оптимальным составом подвижной фазы является смесь ацетонитрила и 0,125 % водного раствора фосфорной кислоты в объемном соотношении 1:3, где кроме пика соединения 48 содержатся пики посторонних примесей около 7 мин (рисунок 3).
Основными потенциальными примесями соединения 48 могут быть исходный 8-бром-1- изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантин 6 и 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8- тио)уксусная кислота (60), которая может образоваться в результате элиминирования диоксотиетанового цикла.
Синтез кислоты 60 осуществляли в два этапа (схема 9). На первом этапе кипячением соединения 6 в течение 0,5 ч в изопропаноле в присутствии алкоголята натрия в результате элиминирования диоксотиетанового цикла с выходом 86 % синтезировали промежуточный 8- бром-1-изобутил-3-метилксантин (59). На втором этапе реакцией соединения 59 с тиогликолевой кислотой в смеси вода-этанол (объемное соотношение 1:1) в присутствии калия гидроксида при кипячении в течение 1,5 ч с выходом 79 % синтезировали кислоту 60. Строение соединений 59, 60 подтверждали ИК, ЯМР 1Н 13С-спектрами.

Рисунок 3 – Хроматограмма соединения 48.
Схема 9
21
По результатам ВЭЖХ соединений 6 и 60 установлено: 1) примесь исходного соединения 6 отсутствует; 2) время удерживания одного из посторонних пиков, обнаруженных в хроматограмме соединения 48, совпадает со временем удерживания пика в хроматограмме кислоты 60. Примесь кислоты 60 контролировали по пределу содержания, предварительно определяли специфичность методики и предел обнаружения примеси. Предел содержания родственной примеси 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусной кислоты 60 предлагается не более 0,1 %.
Предварительные исследования показывают, что хроматографические условия, используемые для определения примеси кислоты 60, могут быть применены для количественного определения соединения 48. Рабочий стандартный образец 2-[1-изобутил-3- метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты 48 получали 3-кратной перекристаллизацией из этанола.
Таким образом, по результатам химико-фармацевтической характеристики для определения подлинности 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8- тио]уксусной кислоты 48 предлагаем методы: ИК спектроскопии в диске калия бромида, УФ спектроскопии 0,002 % раствора в 95 % этаноле, мурексидную пробу, характерную реакцию с раствором железа (III) хлорида 3% и измерение температуры плавления, а для определения примеси и количественного содержания – метод ВЭЖХ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Алкилированием 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантина бромистым изобутилом впервые синтезирован 1-изобутилзамещенный 8-бром-3-метилксантин, содержащий тиетановый цикл. Далее окислением тиетанового цикла получены 8-бром-1-изобутил-3-метилксантины, замещенные в N7 положении оксотиетановым и диоксотиетановым циклом. На основе полученных соединений реакциями нуклеофильного замещения атома брома действием различных аминов синтезированы ряды 8-аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы. Реакцией тиетансодержащих 8-бром-1-изобутил-3- метилксантинов с тиогликолевой кислотой получены 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8- тио)уксусные кислоты, содержащие тиетановые циклы. Взаимодействием синтезированных 2-(1- изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановый, оксотиетановый или диоксотиетановый циклы, с различными основаниями в среде органических растворителей получены соответствующие водорастворимые соли. Строение синтезированных соединений подтверждено ИК, ЯМР 1Н- и 13С-спектрами. По результатам биологических исследований синтезированных соединений выявлены вещества, проявляющие антиагрегационную активность. Высокую антиоксидантную активность в модельной системе генерации активных форм кислорода фагоцитами крови проявила 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил- 3)ксантинил-8-тио]уксусная кислота, для дальнейших фармакологических исследований которой проведена ее химико-фармацевтическая характеристика.
Выводы
1. Реакцией алкилирования 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантина бромистым изобутилом разработан метод синтеза 8-бром-1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантина. Окислением 8-бром-1-изобутил-3-метил-7-(тиетанил-3)ксантина пероксидом водорода и калия перманганатом разработаны методы синтеза 8-бром-1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих оксотиетановый и диоксотиетановый циклы, соответственно.
2. Установлено, что реакции 8-бром-1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы, с аминами протекают по С8 положению. Разработаны методы синтеза 8- аминозамещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановый, оксотиетановый и диоксотиетановый циклы. В реакциях 8-бром-1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы, с трисамином вместо ожидаемых 8-трис(гидроксиметил)- метиламинозамещенных получены 8-диметиламинозамещенные 1-изобутил-3-метилксантины, содержащие тиетановые циклы.
3. Установлено, что реакции 8-бром-1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы, с тиогликолевой кислотой протекают с замещением атома брома на остаток тиогликолевой кислоты, при этом тиетановые циклы сохраняются. Разработаны методы синтеза 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановый, оксотиетановый, диоксотиетановый циклы, и их солей. Установлено, что пиперазиниевые соли 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановые циклы, имеют два остатка кислоты.
4. Строение 8-замещенных 1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы, подтверждено методами ИК, ЯМР 1Н- и 13С-спектроскопии. Установлено, что оксотиетановый цикл существует в виде одного стерически наиболее устойчивого цис-изомера, конфигурация которого сохраняется при реакциях с аминами и тиогликолевой кислотой.
5. Синтезированные 8-замещенные 1-изобутил-3-метилксантины, содержащие тиетановые циклы, обладают антикоагуляционной, антиагрегационной и антиоксидантной активностью. Для всех синтезированных соединений не прогнозируются такие токсические риски, как мутагенность, онкогенность, влияние на репродуктивность и раздражающий эффект, с большой вероятностью для них прогнозируются иммуномодулирующая активность и стимуляция функции почек, а также способность ингибировать АТФазы протеосом и фосфодиэстеразы.
6. Для 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты, проявляющей высокую антиоксидантную активность, проведена химико- фармацевтическая характеристика: предложены показатели и методы определения подлинности, родственных примесей и количественного содержания. Разработан метод синтеза родственной примеси: 2-(1-изобутил-3-метилксантинил-8-тио)уксусной кислоты.
Рекомендации
Соединения, синтезированные в рамках данной диссертационной работы, а также проведенные биологические исследования имеют практическую значимость при поиске новых биологически активных производных ксантина.
Рекомендуется:
– использовать разработанные методики синтеза 8-замещенных 1-изобутил-3-метил- ксантинов, содержащих тиетановые циклы;
– проводить дальнейшие фармакологические исследования 2-[1-изобутил-3-метил-7-(1,1- диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты, проявляющей высокую антиоксидантную активность;
– использовать результаты химико-фармацевтической характеристики 2-[1-изобутил-3- метил-7-(1,1диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты для стандартизации ее субстанции.
Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в дальнейших фармакологических исследованиях in vivo на антиоксидантную активность среди 8-замещенных
1-изобутил-3-метилксантинов, содержащих тиетановые циклы, и в продолжении синтеза новых соединений в данном ряду с целью разработки новых лекарственных средств.