Сравнительная фармакогностическая характеристика представителей подсемейства рясковые (Lemnoideae)

Объект и методы исследования

Объектами исследования служила трава трех видов растений семейства
Lemnaceae, собранных в естественных местах обитания на территории Томской,
Кемеровской и Новосибирской областей в 2011-2019 годах: ряска малая (Lemna
minor L.), ряска тройчатая (Lemna trisulca L.), многокоренник обыкновенный
(Spirodella polyrrhiza Schleid, син. ряска многокорневая – Lemna polyrrhiza L.) – далее
по тексту: LM, LT, SP.
Определение показателей качества растительного сырья проводили в
соответствии с Государственной фармакопеей XIV издания.
Внешние признаки листецов (травы) трех видов рясок изучали невооруженным
глазом, с помощью ручной лупы и под стереоскопическим микроскопом МБС-10
(увеличения от 8х1 до 32х4) по методикам ОФС «Травы» ГФ XIV издания.
Приготовление и анализ микропрепаратов травы рясок проводили в
соответствии с рекомендациями ОФС «Травы» и ОФС «Техника микроскопического
и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и
лекарственных препаратов» ГФ XIV издания.
Микропрепараты изучали под световым микроскопом «Axio Lab A1» (Carl
Zeiss, Германия), фотографии получали с помощью цифрового фотоаппарата
«Сanon» 500 D и обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop CS».
Для изучения химического состава и биологической активности использовали
сухие экстракты, полученные методом дробной мацерации при нагревании на воде
очищенной и 70% этаноле и фракции, полученные из них, с использованием в
качестве экстрагентов хлороформа, этилацетата и н-бутанола.
Для анализа химического состава БАВ в исследуемых объектах использовали
различные качественные реакции, спектральные, хроматографические и другие
общепринятые методы анализа. ВЭЖХ выполняли на хроматографе (Shimadzu LC-
20AD, Япония) с колонкой PerfectSil Target ODS-3 (MZ-Analysentechnik GMBH,
Германия), а также на приборе Hewlett Packard Agilent 1100 Series с аналитической
колонкой Zorbax SB-C18 (Agilent Technologies, США). Обсчет данных ВЭЖХ
производили с помощью программного обеспечения ChemStation. Качественный и
количественный анализ аминокислот проводили при помощи аминокислотного
анализатора Hitachi835 (Япония). Анализ свободных моносахаридов проводили
методом прямофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке
Luna NH24,6Х (Phenomenex, США) с рефрактометрическим детектированием. Сбор
и обработку данных осуществляли при помощи программы Экохром (ЗАО “Техлаб-
М”, Россия), отнесение пиков и расчет концентраций углеводов проводили по
внешнему стандарту. Содержание связанных сахаров определяли методом
капиллярного электрофореза, используя прибор Applied Biosystem 273T
(ThermoFisher, LTD, США). Анализ полисахаридов проводили после их экстракции
подкисленной водой и диализа в полупроницаемой мембране с диаметром пор 15
кДа (Cellu-Sep, США). Содержание углеводов определяли по методу Смита (Dubois,
M. et al., 1956), уроновых кислот по реакции с карбазолом после полного гидролиза
(Корж, А. П. и др., 2011), содержание белка – методом Лоури (Lowry, O.H.et al., 1951)
и нуклеиновых кислот по методу Спирина (Спирин, А.С. и др., 1958). Мономерный
состав полисахаридов устанавливали методом ГХ на приборе Agilent 7890A (США)
с колонкой НР-1MS с использованием триметилсилилированных стандартных
образцов моносахаридов – Carbohydrates Kit (Sigma, США). Детектирование вели с
помощью масс-спектрометра Agilent 5975S (США), метод ионизации – электронный
удар (70 эВ). Анализ молекулярно-массового распределения проводили на
жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Dionex, Германия), колонка TSK
GMPWXL (Tosoh Bioscience, Япония).
Острую токсичность сухого экстракта определяли в соответствии с
руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств
(Миронов А.Н., 2012).
В фармакологических экспериментах использовали 70 мышей линии С57ВL/6,
в возрасте 8-10 недель (1 категории согласно сертификату), полученных из отдела
экспериментальных биологических моделей структурного подразделения Томский
НИЦ НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга.
Перитонеальные макрофаги получали прилипанием к пластику клеток
перитонеального экссудата. Спленоциты получали гомогенезируя селезенки мышей
в ледяном изотоническом растворе хлорида натрия (ФР), фильтруя через 4-слойный
капрон, промывая холодным ФР. Полученные клетки ресуспендировали в
культуральной среде и оценивали их жизнеспособность. В экспериментах
использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток.
Клетки культивировали при температуре 37°С в атмосфере с 5% СО2 и
абсолютной влажности в среде следующего состава: RPMI 1640 (Sigma, США) с
добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, Великобритания),
20 мМ буферного раствора HEPES (Sigma, США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола
(Sigma, США), 50 мкг/мл гентамицина (Sigma, США) и 2 мМL-глютамина (Sigma,
США).
Влияние исследуемых веществ на функциональную активность клеток изучали
следующим образом: полученные макрофаги (Мф) мышей культивировали в 96-
луночных планшетах в присутствии полисахаридов и полифенолов растений в
различных концентрациях; липополисахарида (ЛПС) E.coli (серотип О111:В4,
Sigma, США) 1 мкг/мл; Кон А (Sigma, США) 4 мкг/мл; полимиксина В (InvivoGen,
США) 10 мкг/мл.
Продукцию оксида азота (NO) макрофагами оценивали по содержанию
нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса через 48 ч. Реактив
смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с
использованием многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC
(Labsystems, Финляндия) при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов
определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных
растворов нитрита натрия.
Для оценки пролиферации колориметрическим методом (Mosmann, T.R., 1983)
за 4 ч до окончания культивирования спленоцитов в лунки с клетками вносили
раствор MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид), (Sigma,
США), в конечной концентрации 200 мкг/мл. Осадок растворяли
диметилсульфоксидом (Sigma, США). Абсорбцию полученных растворов замеряли
при помощи многоканального спектрофотометра при длине волны 540 нм.
Исследование полисахаридов на наличие примесей эндотоксина проводили при
инкубации исследуемых образцов полисахаридов или ЛПС и полимиксина В
(InvivoGen, США), с последующим определением концентрации нитритов в
надосадке.
Активность аргиназы определяли с помощью тест-системы «Мочевина-450»
(Био-ЛА-Тест, Чехия).
При выполнении экспериментов использовали реактивы производства Sigma
Aldrich (США), Merck (Германия), Supelco (США), Essentica (Болгария), Hyclone
(США), ЛенРеактив (Россия).
Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ОФС
1.1.0013.15 (Государственная фармакопея 14 издания). Для расчета использовали
программы Statistica 6.0, Microsoft Office Excel, критерий Стьюдента. При
проявлении эффекта с уровнем значимости p≤0,05 результаты эксперимента считали
достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование химического состава
L. minor L., L. trisulca L. и Spirodella polyrrhiza Schleid (L. polyrrhiza L.)

В результате общего фитохимического исследования доказано присутствие во
всех объектах следующих групп БАВ: дубильных веществ, антраценпроизводных,
флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых кислот, аминокислот и полисахаридов.
В траве L. minor L. (LM) обнаружены сапонины, которые отсутствуют в двух других
видах.
Для дальнейшего исследования были получены экстракты растений на 70%
этаноле, которые подвергли фракционированию с использованием растворителей
возрастающей полярности (рисунок 1). Выходы экстрактов и фракций представлены
в таблице 1.

Таблица 1 – Технологические выходы экстрактов на 70%-м этаноле и его фракций.
Выход, % в пересчете на
воздушно-сухое сырьё
Обьект
LMLTSP
70% экстракт4,7±0,43,3±0,36,4±0,3
ХФ0,25±0,021,02±0,030,85±0,02
ЭАФ0,11±0,010,18±0,010,19±0,01
БФ0,27±0,020,39±0,020,38±0,02
ВО4,02±0,021,71±0,024,96±0,02
Примечание: ХФ – хлороформная фракция; ЭАФ – этилацетатная фракция; БФ
– бутанольная фракция; ВО – водный остаток.
Рисунок 1 – Схема получения и фракционирования водно-спиртовых экстрактов.

Далее полученные экстракты и фракции подвергали ВЭЖХ-анализу.
Установлено, что все исследуемые виды ряски в большей степени накапливают
кумарины: мажорными компонентами LM являются хаплоперозид А и эскулин, L.
trisulca L. (LT) – эскулин и эскулетин, SP – эскулин и фраксетин. Все виды
характеризуются накоплением флавоноида мирицетина и изофлавоноида ононина.
Во всех трёх видах ряски в основном накапливаются гидроксибензойные
кислоты. Основным компонентом фенолкарбоновой природы является 2,5-
дигидрокси-1,4-бензолдиуксусная кислота с наибольшим содержанием в LM. SP
отличается от двух других видов ряски содержанием ряда гидроксибензойных
кислот: 2,5-дигидроксибензойная (отсутствует в LM и LT); 2,6-дигидроксибензойная
(LM – 0,17%; LT – 0,05%; Spirodella polyrrhiza Schleid (SP) – 2,02%); 3,5-
дигидроксикарбоновая кислота (в 9,5 раз больше, чем других видах ряски). Для всех
исследуемых видов рясок характерно накопление значительного количества таких
гидроксикоричных кислот, как хлорогеновая (0,15-0,61%) и кофейная (0,03-0,26%).
SP отличается от LM и LT накоплением м-кумаровой кислоты (LM, LT – следовые
количества) и отсутствием коричной, о-кумаровой и ванильной кислот.
При изучении аминокислотного состава в исследуемых видах ряски было
установлено наличие 19 аминокислот, в том числе 8 незаменимых. Среди заменимых
аминокислот преобладают аспарагиновая и глютаминовая кислоты, аргинин, аланин
и глицин. Мажорными компонентами незаменимых аминокислот для всех видов
являются лейцин, валин, лизин, фенилаланин, треонин и изолейцин. В траве LT
содержится меньшее количество как заменимых, так и незаменимых аминокислот
(59,7 мг на 1 г сырья) по сравнению с LM и SP (127,90 и 131,55 мг на 1 г сырья,
соответственно).
Установлено, что исследуемые виды ряски содержат преимущественно
связанные сахара: содержание связанных сахаров LM в 2 раза превышает количество
свободных, LT и SP – в 14 и 7,5 раза соответственно (таблица 2).

Таблица 2 – Содержание связанных углеводов в рясках.
Содержание, %
Вид ряскиПентозыГексозы
АрабинозаКсилозаГалактозаГлюкоза
0,38±0,021,24±0,061,05±0,064,20±0,21
LMСумма
1,625,25
0,73±0,046,1±0,31,17±0,066,3±0,3
LTСумма
6,837,47
0,90±0,041,82±0,091,42±0,0710,7±0,5
SPСумма
2,7212,12

Полученные данные и данные литературы о содержании в рясках отдельных
групп БАВ и их биологической активности, послужили основанием для более
детального исследования полисахаридного комплекса изучаемых видов.
Выделенные полисахариды охарактеризовали по химическому составу. Данные по
содержанию общих углеводов, белка, уроновых и нуклеиновых кислот в
исследуемых ВРПС представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Характеристика образцов ВРПС LM, LT и SP (n=3).
Содержание в образце, %
ПСнуклеиновыеуроновые
углеводыбелок
кислотыкислоты
LM96,9±1,80,14±0,030,0010±0,000141,77±0,03

LT97,9±0.90,38±0,070,0043±0,000218,45±0,03

30,28±0,03
SP98,4±2,00,27±0,060,0055±0,0004

Из данных ГХ-МС анализа следует, что полученные полисахариды отличаются
по моносахаридному составу (таблица 4).
Таблица 4 – Моносахаридный состав полисахаридов LM, LT и SP.
Содержание, %
Вид ряски
GluGalXilAraManFru
LM35,0710,5612,60—
LT15,5140,37–18,577,10
SP41,3310,43-12,88-5,08

ВЭЖХ фракций ВРПС показала присутствие трех пиков соединений с
различными молекулярными массами, что свидетельствует о высокой степени
полидисперсности (рисунок 2).

Рисунок 2 – Хроматограмма полисахаридных комплексов.

Таким образом, полисахариды, выделенные из растений рода Lemna,
характеризуются низким содержанием примесей (белок и нуклеиновые кислоты) и
высокой степенью полидисперсности. Изучаемые полисахариды значительно
различаются по составу: так, в LM и SP преобладающими моносахаридами являются
глюкоза и уроновые кислоты, при этом в LM обнаружена ксилоза, а в SP – арабиноза.
В ПС, полученных из LT мажорным мономером является галактоза, а содержание
глюкозы и уроновых кислот значительно ниже.
Имеющиеся в литературе сведения свидетельствуют о том, что фенольные
соединения и полисахариды растений способны изменять основные функции
макрофагов: усиливать фагоцитарную активность, продукцию активных форм
кислорода и оксида азота (NO), который, в свою очередь, играет важную роль в
регуляции функций различных систем организма, участвует в развитии адаптивных
иммунных реакций, ингибирует репликацию патогенов, регламентирует апоптоз и
пролиферацию клеток, включая макрофаги, Т-лимфоциты, тучные клетки,
нейтрофилы и лимфоциты (Kraus, J.et al., 1992, Sun, H. et al., 2015, Yahfoufi, N., et al.,
2018).
Эти сведения и данные о химическом составе рясок послужили основанием для
дальнейшего этапа нашей работы – исследования иммунотропной активности
полифенолов (ПФ) и полисахаридов (ПС) изучаемых видов.

2. Исследование биологической активности БАС L. minor L.,
L. trisulca L. и Spirodella polyrrhiza Schleid (L. polyrrhiza L.)

Исследуемые экстракты в дозах 2000, 5000 и 10000 мг/кг, не вызывали гибели
экспериментальных животных на протяжении двух недель наблюдения после
внутрижелудочного введения. Не наблюдали существенных изменений в поведении
животных или появления патологических форм поведения. Это позволяет отнести
исследуемые экстракты к малотоксичным веществам по классификации Ходжа и
Стернера. Согласно существующей классификации (ГОСТ 12.1.007 – 76),
исследуемые экстракты соответствуют IV классу «Вещества малоопасные».
Для определения оптимальных рабочих концентраций и оценки возможного
токсического действия изучаемых веществ на клетки системы иммунитета было
изучено влияние полифенолов (ПФ) и полисахаридов (ПС) из LM, LT и SP на
пролиферацию спленоцитов интактных мышей линии C57/BL6 invitro. В качестве
контроля использовали спленоциты, инкубированные со средой (контроль 1) и
спленоциты, культивированные с конканавалином А (Кон А) (контроль 2).
В результате проведённых исследований было обнаружено, что ПС,
выделенные из вышеперечисленных растений, не оказывали токсического действия
на спленоциты и не снижали уровень пролиферации по сравнению с интактным
контролем 1 (таблица 5).

Таблица 5 – Влияние различных концентраций полифенолов и водорастворимых
полисахаридов рясок на пролиферацию спленоцитов интактных мышей линии
C57/BL6 (X±m).
Пролиферация, у.е.
Исследуемое веществоКонцентрация, мкг/мл
оптической плотности
Среда (контроль 1)-155±14
Кон А (контроль 2)4266±15*
5147±7▲
ПС LM20185±15▲
80199±19▲
5214±8*▲
ПС LT20233±16*
80289±15*
5186±5*▲
ПС SP20193±3*▲
80228±9*
0,5166±9▲
ПФ LM5159±5▲
10188±34▲
20167±9▲
80143±7▲
160171±43▲
0,5141±5▲
5137±7▲
10161±2▲
ПФ LT
20185±12▲
80174±7▲
160152±4▲
0,5179±18▲
5169±11▲
10157±12▲
ПФ SP
20133±4▲
80122±4▲
160132±6▲
Примечание: *– различия показателя с контролем 1 достоверны, р<0,05; ▲ – различия показателя с контролем 2 достоверны, р<0,05. Уровень пролиферации при инкубации с ПС LM не отличался от интактного контроля, но был достоверно в 1,2 и 1,4 раза ниже митогенстимулированного уровня при применении концентраций 20 и 80 мкг/мл, соответственно. Добавление ПС LT и SP приводило к дозозависимому увеличению показателя относительно контроля 1. Более того культивирование с ПС LT в концентрациях 20 и 80 мкг/мл приводило к усилению пролиферации на уровне митогена, а при использовании ПС SP только в максимальной концентрации. При инкубации спленоцитов с ПФ LM, ПФ LT и ПФ SP значения показателя были соизмеримы с интактным контролем, но достоверно ниже относительно стимуляции спленоцитов специфическим Т-клеточным митогеном Кон А (контроль 2): в 1,4-1,9 раза (ПФ LM), в 1,4-1,9 раз (ПФ LT), в 1,5-2,2 раза (ПФ SP) в зависимости от исследуемых концентраций. Таким образом, ПС и ПФ не оказывают токсического действия на лимфоцитарное звено иммунной системы. ПС LT и ПС SP большой концентрации активируют пролиферацию спленоцитов. В литературе имеются сведения о том, что полисахариды микроорганизмов, грибов и высших растений благодаря способности изменять функциональное состояние антиген-презентирующих клеток (макрофаги и дендритные клетки) обладают иммуномодулирующими свойствами (Vecchiarelli, A. et al., 2000, Chiapello, L.S. et al., 2003, Monari, C. et al., 2003, Stingele, F., et al., 2004) . Известно, что различные полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами АПК (Schepetkin I. A. et al., 2006), поэтому дальнейшие исследования проводились на модели перитонеальных макрофагов. В ходе проведённых экспериментов было выявлено (таблица 6), что все изученные ПС вызывали усиление продукции оксида азота. Так, ПС LM вызывали увеличение концентрацию нитритов в 2,2 раза в концентрации 5 мкг/мл, в 1,9 раза – 20 мкг/мл и в 1,7 раза – 80 мкг/мл с 2,7±0,40 мкМ в контроле до 6,1±0,33, 5,0±0,18 и 4,7±0,47 мкМ соответственно. При инкубации с ПС LT концентрация NO увеличивалась в 5,8 раза (5 мкг/мл), в 6,5 раза (20 мкг/мл) и в 5,1 раза (80 мкг/мл). ПС SP усиливали продукцию оксида азота в 4,9 раза (5 мкг/мл), в 4,6 раза (20 мкг/мл) и в 3,5 раза (80 мкг/мл). Концентрация нитритов при культивировании с ЛПС увеличивалась в 8,7 раза с 2,7±0,40 мкМ до 23,5±0,87 мкМ, что значительно превышало значения показателя при активации ПС. ПФ LM в концентрациях 5 и 20 мкг/мл не оказывали значительного влияния на продукцию оксида азота, а в концентрации 80 мкг/мл выявлено снижение продукции нитритов в 3,4 раза по сравнению с контролем 1 (0,8±0,03 мкМ от 2,7±0,40 мкМ) и в 29,3 раз по сравнению с митогенстимулированным контролем 2 (от 23,5±0,87 мкМ). При инкубации Мф с ПФ LT в концентрации 5 мкг/мл продукция нитритов увеличивалась в 3,4 раза с 2,7±0,40 мкМ до 9,2±0,24 мкМ, но не изменялась в концентрациях 20 и 80 мкг/мл. Таблица 6 – Влияние различных концентраций полифенолов и водорастворимых полисахаридов на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных мышей линии C57/BL6 (X±m). КонцентрацияКонцентрация Исследуемое вещество (мкг/мл)нитритов (мкМ) Среда (контроль 1)-2,74±0,40 ЛПС (контроль 2)423,49±0,87* 56,10±0,33*• ПС LM205,00±0,18*• 804,69±0,47*• 515,81±1,07*• ПС LT2017,49±1,07*• 8013,93±0,52*• 513,13±1,02*• ПС SP2012,38±0,62*• 809,39±0,8*• 53,16±0,13• ПФ LM203,62±0,22• 800,81±0,03*• 59,17±0,24*• ПФ LT203,62±0,13• 802,08±0,03• 53,32±0,10• ПФ SP203,23±0,16• 801,26±0,23*• Примечание: *– различия показателя с контролем 1 достоверны, р<0,05; • – различия показателя с контролем 2 достоверны, р<0,05. Культивирование Мф с ПФ SP в концентрации 5 и 20 мкг/мл не изменяли активность NO-синтазы, а в концентрации 80 мкг/мл снижали продукцию оксида азота в 2,1 раза по сравнению с контролем 1 (с 2,7±0,40 до 1,3±0,23 мкМ). Таким образом, ПС LM, LT, SP в разной степени стимулируют продукцию оксида азота, а ПФ изучаемых растений в высоких концентрациях снижают концентрацию нитритов в культуре клеток. Известно, что экстракты, выделенные из растений, могут содержать примесь эндотоксина (липополисахарида), который проявляет NO-стимулирующую активность (Schepetkin I.A. et al., 2006). Для того чтобы убедиться, что повышение продукции оксида азота перитонеальными макрофагами мышей в присутствии ПС и ПФ, выделенных из LM, LT, SP не связано с эндотоксином, были проведены эксперименты с использованием полимиксина В, связывающего ЛПС. Результаты представлены в таблице 7. Таблица 7 – Влияние полимиксина В на стимулированную полисахаридами и полифенолами продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных мышей линии C57/BL6 (X±m) Концентрация нитритов (мкМ) Конц-я, Исследуемое веществобез полимиксина Вс полимиксином мкг/мл (контроль 2)В Среда (контроль 1)-2,08±0,101,53±0,11 ЛПС171,12±1,72*2,93±0,20• ПС LM2026,65±0,31*43,97±0,23*• ПС LT2052,76±0,17*57,73±0,71*• ПС SP2041,74±1,38*51,38±0,36*• ПФ LM52,0±0,032,01±0,07 ПФ LT59,79±0,38*2,81±0,12*• ПФ SP51,68±0,121,98±0,11 Примечание: *– различия показателя с контролем 1 достоверны, р<0,05; • – различия показателя с контролем 2 достоверны, р<0,05. Полученные результаты доказывают отсутствие примесей эндотоксина в образцах всех ПС, выделенных из изучаемых растений. Усиление продукции оксида азотаперитонеальнымимакрофагами,обусловленонепосредственно полисахаридными комплексами, выделенными из растений. Снижение концентрации нитритов в культуре клеток с ПФ LT и полимиксином В свидетельствует о наличии примеси эндотоксина в составе изучаемого образца и выявленная активация является следствием этой примеси. Заготовка сырья растений рода рясок осложнена трудоёмкой сортировкой его по видовому составу. Ботанический анализ показал, что в природе чаще всего встречается межвидовая смесь разных видов растений рода рясок Lemna – LM, LT и SP в соотношениях 80:10:10 или 80:0:20, соответственно. В связи с этим, нами была изучена способность ПС выделенных из межвидовых смесей стимулировать продукцию оксида азота (таблица 8). Таблица 8 – Влияние ПС, выделенных из межвидовых смесей растений рода рясок, на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей, на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей линии C57/BL6 (X±m) Концентрация,Концентрация нитритов, Исследуемое вещество мкг/млмкМ Среда (контроль 1)–2,16±0,09 ЛПС134,53±0,32* ПС LM2033,59±0,38*▲♦ ПС LT2039,06±0,79*■ ПС SP2042,70±0,57*●■ ПС LM:LT:SP (80:10:10)2033,20±0,37*▲♦ ПСLM:LT:SP (80:0:20)2033,23±0,23*▲♦ ПСLM:LT:SP (50:25:25)2036,97±0,85* Примечание: *– различия показателя со средой достоверны, ● – различия показателя со средой с ЛПС достоверны, ■ – различия показателя по сравнению с ПС LM достоверны, ▲ – различия показателя с ПС LT достоверны, ♦ – различия показателя с ПС SP достоверны; р<0,05. Как видно из представленных данных, полисахариды, выделенные из межвидовых смесей растений рода рясок, не теряют своих NO-стимулирующих свойств. 3. Разработка критериев качества для стандартизации сырья. 3.1. Морфолого-анатомическое исследование. Учитывая, что все три систематически близких вида часто образуют совместные заросли, а также вклад полисахаридного комплекса всех видов в иммунотропную активность, к заготовке и применению в медицинской практике предлагается растительное сырье с наименованием «Ряски трава», представляющее собой смесь LM, LT и SP. К внешним признакам позволяющим идентифицировать и различить LM, LT и SP относятся: прозрачность, форма и край листецов; длина, количество и расположение карманов из которых развиваются дочерние растения; форма количество и цвет корней. К дифференцирующим микроскопическим признакам относятся: извилистость клеточных стенок нижнего эпидермиса, размер клеток, наличие жилок, присутствие устьичного аппарата аномоцитного типа (LM и SP), отсутствие устьиц у LT. Также объем аэренхимы по отношению к площади листецов, наличие и диаметр межклетников, включения в виде друз и рафид. Клетки-идиобласты с пигментированным содержимым у SP. Прямостенные клетки эпидермиса корней (рисунки 3-6). Рисунок 3 – Плоскостной препарат листеца LM: Устьица аномоцитного типа на нижнем эпидермисе. Рисунок 4 – Плоскостной препарат листеца LM: А - аэренхима, Б – рафиды. Рисунок 5 – Плоскостной препарат листеца SP: А - рафиды, Б- клетки-идиобласты с пигментированным содержимым, В – друзы. Рисунок 6– Плоскостной препарат листеца LT: А – основание листеца и корень, Б - прямостенные клетки эпидермиса корня, В – рафиды Таким образом, на основании изучения внешних (макроскопических) и микроскопических (анатомических) особенностей были определены общие и отличительныедиагностическиепризнаки,позволяющиедостоверно идентифицировать исследуемые виды. 3.2. Стандартизация сырья по показателю «Количественное определение» Для определения содержания полисахаридов в сырье ряски была использована стандартная фармакопейная методика. Точную навеску сырья ряски помещали в колбу, заливали водой очищенной 1:20 и экстрагировали полисахариды на кипящей водяной бане течение 1 часа, затем извлечение фильтровали через тканевой фильтр и повторяли экстракцию ещё раз. Извлечения объединяли и фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Фильтрат упаривали на роторном испарителе до 1/5 исходного объема, после чего прибавляли 96 % этанол (1:3) и оставляли на 12 часов при температуре 8-10 ⁰С для полного осаждения полисахаридного комплекса. Далее осадок отфильтровывали через бумажный фильтр (постоянная масса), промывали горячим 96 % этанолом, и ацетоном, затем высушивали до постоянной массы и взвешивали. Посколькугравиметрическийметодколичественногоопределения полисахаридов в растительном сырье является прямым методом измерения количества вещества, и ГФ РФ не требует подтверждения соответствия получаемых результатов с помощью подобных методик, поэтому валидацию не проводили. Установлено, что преобладающей группой фенольных соединений в сырье ряски являются фенолкарбоновые кислоты, для количественного определения которых была выбрана распространенная методика прямой спектрофотометрии (Томашевская, О. Ю. и др., 2009), которую мы модифицировали в части пробоподготовки. Экспериментальным путем нами установлено, что при 30 и более минутах экстракции не наблюдается достоверного увеличения оптической плотности извлечения. Поэтому в методике количественного определения фенолкарбоновых кислот время экстракции – 30 минут. Ввиду наличия липофильных веществ в аналите, в методику подготовки проб внесена стадия жидкость-жидкостной экстракции гексаном в соотношении 1:5. С учетом полученного УФ-спектра извлечения из сырья ряски, в качестве стандарта предложено использовать хлорогеновую кислоту (λMAX = 327 нм). Методику осуществляли следующим образом: точную навеску сырья (10,0) помещали в колбу, заливали 70 % этанолом (1:20) и экстрагировали на водяной бане в течение 30 минут с обратным холодильником при температуре 80 ⁰С. Далее фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 250 мл, промывая трижды шрот на фильтре 70 % этанолом порциями по 5 мл. После чего доводили объем раствора в колбе до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили объем раствора до метки 70 % этанолом. 4 мл полученного раствора помещали в делительную воронку, добавляли 20 мл гексана, и интенсивно взбалтывали несколько раз. После расслоения отбирали 2 мл нижнего слоя в пробирку и удаляли растворитель в токе азота. Сухой остаток растворяли в 2 мл 70 % этилового спирта и снимали УФ-спектр, параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца хлорогеновой кислоты. Таким образом, разработали рабочие условия методики количественного определения фенолкарбоновых кислот в сырье ряски. Таблица9–Валидационныехарактеристикиметодики спектрофотометрического определения фенолкарбоновых кислот Уровень RSD (%)RSD (%) МетодикасодержанияПравильность повторяемостивоспроизводимости (%) Определение802,702,2699,83 фенолкарбоновых1001,401,76100,91 кислот1201,101,0398,47 Методика спектрофотометрического определения фенолкарбоновых кислот былавалидированапопоказателям:линейность,повторяемость, внутрилабораторная прецизионность, правильность и является валидной (таблица 9). Для обоснования значения показателей предельного содержания действующего вещества в сырье, с помощью предложенных методик проанализированы образцы ряски, заготовленные в различных областях произрастания. Так, в 7 образцах сырья из Западно-Сибирского региона установлен диапазон содержания: полисахаридов– 4,34-8,12 %, фенолкарбоновых кислот – 3,87- 5,47 % (в пересчете на хлорогеновую кислоту). Таким образом, определили нормативы качества сырья ряски по содержанию фенолкарбоновых кислот – должно быть не менее 3,5 % и полисахаридов – должно быть не менее 4,0 %. ВЫВОДЫ Проведенноесравнительноефармакогностическоеисследование произрастающих на территории Сибири отдельных представителей подсемейства рясковые – ряски малой (Lemna minor L.), ряски тройчатой (Lemna trisulca L.) и многокоренника обыкновенного (Spirodella polyrrhiza Schleid (Lemna polyrrhiza L.)) и выделенных из них комплексов БАС позволило сформулировать следующие выводы: 1. Все исследуемые виды накапливают фенольные соединения: кумарины (мажорным компонентом LM являются хаплоперозид А и эскулин, LM – эскулин и эскулетин, SP – эскулин и фраксетин); флавоноиды (мирицетин) и изофлавоноиды (ононин); фенолкарбоновые кислоты (2,5-дигидрокси-1,4-бензолдиуксусная, 2,6- дигидроксибензойная, 3,5-дигидроксикарбоновая); гидроксикоричные кислоты (хлорогеновая – 0,15-0,61%, кофейная – 0,03-0,26%). SP отличается от LM и LT накоплением м-кумаровой кислоты и отсутствием коричной, о-кумаровой и ванильной кислот. 2. Во всех видах установлено наличие 19 аминокислот, в том числе 8 незаменимых. Среди заменимых аминокислот преобладают аспарагиновая и глютаминовая кислоты, аргинин, аланин и глицин. Мажорными компонентами незаменимых аминокислот для всех видов являются лейцин, валин, лизин, фенилаланин, треонин и изолейцин. 3. Все объекты содержат преимущественно связанные сахара: содержание связанных сахаров LM в 2 раза превышает количество свободных, LT и SP – в 14 и 7,5 раза соответственно. Полисахариды, выделенные из исследуемых растений, характеризуются низким содержанием органических примесей (белка и нуклеиновых кислот) и высокой степенью полидисперсности. Изученные полисахариды отличаются по мономерному составу, как нейтральных, так и кислых сахаров: в ПС LM и SP преобладающими моносахаридами являются глюкоза и уроновые кислоты, при этом в LM обнаружена ксилоза, а в SP – арабиноза; в ПС, полученных из LT мажорным мономером, является галактоза, а содержание глюкозы и уроновых кислот значительно ниже. 4. ПС и ПФ всех исследованных видов не оказывают токсического действия на иммунокомпетентные клетки мышей, а ПС в большой концентрации, напротив, активируют пролиферацию спленоцитов. ПС, выделенные как из отдельных видов, так и из межвидовых смесей этих растений эндотоксин-независимо стимулируют продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных. ПС, выделенные из LM, LT, SP поляризуют антигенпрезентирующие клетки по классическому пути, усиливая Th-1 тип иммунного ответа. ПС, выделенные из межвидовых смесей растений рода рясок в различных соотношениях, сохраняют иммунотропную активность на уровне ПС из отдельных видов рясок. Результаты сравнительного исследования иммунотропной активности БАВ LM, LT, SР, обосновывают возможность заготовки смешанных зарослей данных растений. 5. Общими макро- и микроскопическими признаками LM, LT, SP являются: наличие жилок, волосовидно-нитевидных корней, карманов, аэренхимы, рафид, друз. Установлены отличительные признаки для каждого вида, заключающиеся в особенностях окраски, формы и размеров листецов, количества корней, карманов, жилок и их расположения, формы и степени извилистости клеток эпидермиса, степени развития аэренхимы, наличия (отсутствия) устьиц и пигментов. 6. Разработаны параметры качества и проект ФС на лекарственное растительное сырье «Ряски трава». Предложены методики количественного определенияполисахаридовифенолокислотвсырье.Методика спектрофотометрическогоопределенияфенолокислотвалидированапо показателям: линейность, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность и правильность. Установлен диапазон содержания в сырье для полисахаридов (4,34- 8,12 %) и фенолокислот (3,87-5,47 %). Определены нормы качества для стандартизации и разработки проекта ФС на сырье. Перспективы дальнейшей разработки темы Результаты диссертационного исследования имеют научно-прикладное значение для фармацевтической химии и фармакогнозии, в частности для дальнейшей разработки активных фармацевтических субстанций на основе полифенолов и водорастворимых полисахаридов представителей подсемейства рясковые, обладающих иммунотропной активностью.