Сравнительное фармакогностическое исследование некоторых представителей рода Орех (Juglans L.)

В качестве объектов исследования диссертационной работы были использованы образцы растительного сырья: ореха черного (Juglans nigra L.), ореха грецкого (Juglans regia L.), ореха серого (Juglans cinerea L.), собранные в период с 2019 по 2021 гг. Сырье было заготовлено на территории Самарской и Ростовской областей, Республики Адыгея, Республики Абхазия в период с марта по сентябрь.
В рамках диссертационной работы исследовались растительные препараты: настойка коры и листьев ореха черного 1:5 (70% этиловый спирт), а также индивидуальные соединения: гиперозид (CAS 482-36-0, ≥95 %, MERK), кверцитрин (CAS 522-12-3, ≥98 %, MERK), кверцетин (CAS 6151-25-3, ≥95 %, MERK), мирицитрин (CAS 17912-87-7, ≥98 %, MERK), мирицетин (CAS 529-44-2, ≥98 %, MERK), югланин (CAS 5041-67-8, 95 %, MERK), юглон (CAS 481-39-0, ≥95 %, MERK).
Исследование указанного растительного сырья и растительных препаратов, а также их стандартизацию проводили с использованием химических и физико-химических методов анализа. Для установления химического состава коры и листьев ореха черного был использован
метод жидкостно-адсорбционной колоночной хроматографии; для разделения применялись силикагель марки L 40/100 мкм (Чехия), полиамид For Column Chromatography (Fluca Analytical, Германия). Спектральные характеристики выделенных индивидуальных веществ исследовали с помощью ЯМР 1Н-спектроскопии и ЯМР 13С-спектроскопии с использованием спектрометров «Bruker AM 300» (300 МГц), «JNM-ECX 400» (399.78 МГц) и «Bruker DRX 500» (126.76 МГц), «JNM-ECX 400» (100.52 МГц) соответственно. Масс-спектры EI-MS и ESI-MS низкого и высокого разрешения были получены на масс-спектрометрах «Kratos MS-30» и Bruker micrOTOF II соответственно.
Для исследования извлечений изучаемых видов сырья, выделенных веществ и разработанных лекарственных растительных препаратов и их стандартизации использовали метод тонкослойной хроматографии с пластинками «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» и «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (Россия). Спектрофотометрическое исследование проводили на спектрофотометрах «Specord 40» (Analytik Jena) и «СФ-2000» (ОКБ Спектр) в кюветах с толщиной слоя 10 мм в диапазоне длин волн от 190 нм до 700 нм. ВЭЖХ-анализ проводили с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») с ультрафиолетовым детектором в следующих условиях: обращенная фаза, изократический режим, стальная колонка колонка КАХ-6-80-4 (No2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза – различные соотношения ацетонитрила и воды с добавлением 1% уксусной кислоты, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента – 2000-2500 мкл, объем пробы 4-8 мкл. Аналитические длины волн – 260, 360 нм.
Анатомо-гистологический и морфологический анализ проводили с использованием цифровых микроскопов марки «Motic DM-111» и «Motic DM-39C-N9GO-A», люминисцентного микроскопа «Альтами» ЛЮМ-2 (голубой и желтый светофильтры) с увеличениями x40, x100, x400.
С использованием фармакологических методов проводили прогнозирование биологической активности индивидуальных соединений, выделенных из коры и листьев ореха черного, и последующее изучение нейротропной активности, а также исследование острой токсичности настоек коры и листьев ореха черного.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Сравнительное фитохимическое исследование сырья некоторых видов рода Орех (Juglans L.)
Предварительное сравнительное исследование растительного видов рода Juglans L. с использованием метода тонкослойной хроматографии позволило выявить наличие соединений флавоноидной структуры в коре и листьях ореха черного, листьях ореха грецкого и ореха серого.
Для подтверждения результатов анализа, полученных методом тонкослойной хроматографии, дополнительно проведен анализ извлечений коры ореха черного, листьев ореха черного, ореха грецкого и ореха серого методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой области спектра. По результатам сравнительного изучения электронных спектров поглощения водно-спиртовых извлечений указанных видов, полученных в условиях прямой спектрофотометрии, установлены особенности спектральных характеристик. Полученные спектры поглощения водно-спиртовых извлечений указанных видов сырья имеют два максимума поглощения. Дальнейшее исследование растительного сырья методом дифференциальной спектрофотометрии позволило установить батохромный сдвиг длинноволновой полосы, появляющийся при взаимодействии с комплексообразователем – спиртовым раствором AlCl3. В условиях дифференциальной спектрофотометрии для извлечения коры и листьев ореха черного
установлен максимум поглощения в области 412-416 нм, который фактически аналогичен зарегистрированному максимуму поглощения раствора стандартного образца мирицитрина при длине волны 416 нм. Проведенное сравнительное спектрофотометрическое исследование показало, что характер спектра поглощения листьев и коры ореха черного во многом определяют соединения, используемые ранее в ТСХ-анализе сырья – мирицитрин и кверцитрин (рис. 1-3). Полученные по результатам хроматографических и спектрофотометрических исследований данные позволили предположить перспективность дальнейшего изучения химического состава коры и листьев ореха черного.
Рисунок 1 – Электронный спектр поглощения раствора водно-спиртового извлечения из коры ореха черного (дифференциальный вариант)
Рисунок 2 – Электронный спектр поглощения водно- спиртового извлечения из листьев ореха черного (дифференциальный вариант)
Рисунок
Электронный
поглощения
мирицитрина (дифференциальный вариант)
Для последующего анализа химического состава коры и листьев ореха черного проводилось выделение индивидуальных биологически активных соединений из указанных видов растительного сырья методом адсорбционной колоночной хроматографии. Для определения химической структуры выделенных веществ использовали методы 1Н-, 13С-ЯМР- спектроскопии, масс-спектрометрии, ТСХ, а также спектрофотометрии.
В ходе исследования химического состава коры и листьев ореха черного методом адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии для коры и листьев ореха черного выделены и идентифицированы вещества, представленные в таблице 1.
С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии был проведен предварительный анализ компонентного состава извлечений коры и листьев ореха черного в целях идентификации выделенных химических соединений. Установлено, что доминирующим и диагностически значимым соединением коры ореха черного является флавонол – мирицитрин. В листьях ореха черного доминирующим также является мирицитрин. При этом проведенное исследование позволило установить, что диагностически значимыми флавоноидами для листьев ореха черного являются 2 флавонола – мирицитрин и кверцитрин (рис. 4-7).
Рисунок 4 –
ВЭЖХ- ВЭЖХ-
хроматограмма извлечения из коры ореха черного
Рисунок 5 –
хроматограмма извлечения из листьев ореха черного Обозначения: 1 – мирицитрин; 2 – мирицетин; 3 – кверцитрин.
Рисунок 6 – Рисунок 7 – ВЭЖХ- ВЭЖХ- хроматограмма хроматограмма мирицитрина кверцитрина
Обозначения Обозначения : 1 – мирицитрин. : 3 – кверцитрин.
Обозначения: мирицитрин; мирицетин; кверцитрин.
1 –
2 – 3 –
3 –
спектр раствора

Таблица 1 – Характеристики веществ, выделенных из коры и листьев ореха черного методом колоночной хроматографии
5.
6.
7.
8.
9.
12
Сакуранетин (5,4’- дигидроски-7- метоксифлаванон)
H3CO O OH O
OH C16H15O5 Белое
кристаллическое вещество λmax=224, 288, 326
Название соединения
Химическая формула
Характеристики
No
1.
2.
3.
4.
Кора ореха черного (Juglans nigra L.)
Листья ореха черного (Juglans nigra L.)
Юглон (5- гидрокси-1,4- нафтохинон)
O OH
O
C10H6O3 Кристаллическое вещество оранжевого цвета λmax=250, 320, 420
Мирицитрин (3-O- α-L- рамнопиранозид 3,5,7,3’,4’,5’- гексагидроксифлав она)
HO O
OH O
OH
OH
OH O – Rha
C21H20O12
Желтое с кремовым оттенком кристаллическое вещество λmax=212, 260, 358
Мирицетин (3,5,7,3’,4’,5’- гексагидроксифлав он)C15H10O8
OH
OH
HO O
OH
OH O
C15H10O8 Желто-зеленое кристаллическое вещество λmax=254, 377
Сакуранин (Сакуранетин-5-O- β-D- глюкопиранозид; 5- O-β-D- глюкопиранозид 5,4’-дигидроски-7- метоксифлаванона)
H3CO O GluO O
OH
C22H24O10
Белое кристаллическое вещество λmax=228, 283, 324
Этоксиюглон (2- этокси-5-гидрокси- 1,4-нафтохинон)
O OH
O
O
C12H10O4 Кристаллическое вещество оранжевого цвета λmax=248, 289, 418
Кверцитрин (3-O-α- L-рамнопиранозид 3,5,7,3’,4’- гексагидроксифлав она)
HO O
O – Rha OH O
OH
OH
С21Н20О11
Белое кристаллическое вещество λmax=258, 264, 356
Кверцетин (5,4’- дигидроски-7- метоксифлаванон)
OH
OH
HO O
OH
OH O
С15Н10О7
Белое кристаллическое вещество λmax=258, 270, 374
Мирицитрин (3-O- α-L- рамнопиранозид 3,5,7,3’,4’,5’- гексагидроксифлав она)
HO O
OH O
OH
OH
OH O – Rha
C21H20O12
Желтое с кремовым оттенком кристаллическое вещество λmax=212, 260, 358
. Мирицетин (3,5,7,3’,4’,5’- гексагидроксифлав он)
OH
OH
HO O
OH
OH O
C15H10O8 Желто-зеленое кристаллическое вещество λmax=254, 377

2. Разработка подходов к стандартизации коры и листьев ореха черного (Juglans nigra L.)
В рамках диссертационной работы в рамках фитохимического исследования коры ореха черного было выделено и идентифицировано диагностически значимое соединение группы флавонолов – мирицитрин. Установлено, что мирицитрин и кверцитрин являются диагностически значимыми соединениями листьев ореха черного. Следовательно, указанные соединения целесообразно использовать в качестве стандартных образцов при разработке методик определения основных групп БАC и количественного анализа коры и листьев ореха черного.
Определение подлинности основных групп БАC методами ТСХ и спектрофотометрии
Предварительный фитохимический анализ показал, что при определении подлинности коры ореха черного методом ТСХ в системе хлороформ – спирт этиловый – вода (25:18:2) на хроматограмме обнаруживается зона адсорбции доминирующего соединения на уровне СО мирицитрина. Таким образом, в качестве внутреннего вещества-свидетеля предлагается использовать СО мирицитрина.
При определении подлинности листьев ореха черного методом ТСХ в системе хлороформ – спирт этиловый – вода (25:18:2) на хроматограмме обнаруживаются зоны адсорбции диагностически значимых соединений на уровне СО мирицитрина и кверцитрина. Следовательно, в качестве стандартных образцов (веществ-свидетелей) предлагается использовать СО мирицитрина и СО кверцитрина. На хроматограмме испытуемого раствора листьев ореха черного должны обнаруживаться зоны адсорбции ярко-желтого цвета, расположенные на уровне зон адсорбции СО мирицитрина и СО кверцитрина. Детектирование хроматографических пластин представлено в таблице 2.
Таблица 2 – Детектирование основных зон адсорбции коры и листьев Juglans nigra L.
при анализе растительного сырья
Вид анализируемого Rf образца
Кора ореха черного
Хроматографическая 0,40 зона No 1
СО мирицитрина 0,40 СО кверцитрина 0,65
Детекция в видимом свете
Желтая
Желтая
Желтая
Детекция в УФ- свете (λ=365 нм)
Темно-коричневая
Темно-коричневая
Темно-коричневая со светлой каймой
Детекция AlCl3 и в УФ- свете
Ярко-желтая
Ярко-желтая
Ярко-желтая
Детекция раствором ДСК
Желто- оранжевая
Желто- оранжевая
Желто- оранжевая
Листья ореха черного Хроматографическая зона No 1
Хроматографическая зона No 2
0,40
Желтая
Темно-коричневая
Ярко-желтая
Желто- оранжевая
0,65
Желтая
Темно-коричневая со светлой каймой
Ярко-желтая
Желто- оранжевая
Дополнительно для определения подлинности сырья рекомендовано проведение спектрофотометрического анализа. Испытуемые растворы извлечений коры и листьев ореха черного фотометрировали и устанавливали максимумы поглощения (табл. 3).
Таблица 3 – Установленные значения максимумов поглощения испытуемых растворов извлечений коры и листьев ореха черного
Условия фотометрии
Прямой метод
Дифференциальный метод
Кора ореха черного
= 270±2 нм; =360±2 нм
= 416±2 нм
Листья ореха черного
= 270±2 нм ; =356±2 нм
= 412±2 нм
Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в коре и листьях ореха черного
С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного были определены основные параметры пробоподготовки. Результаты исследования зависимости различных параметров экстракции на выход действующих веществ из сырья показали, что оптимальными условиями экстракции являются: однократное извлечение 80 % этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье- экстрагент» – 1:30 и степени измельчения сырья – 2 мм.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного. Аналитическую пробу коры Juglans nigra L. измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. В термостойкую коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл помещают около 1,0 г измельченного сырья (точная навеска), прибавляют 30 мл спирта этилового 80 % концентрации. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с погрешностью ±0,01 г и оставляют на 1 час. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 1 часа. После охлаждения в течение 30 мин полученного извлечения, колбу закрывают той же пробкой, взвешивают и содержимое при необходимости восполняют экстрагентом до первоначального значения. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная полоса (раствор А испытуемого извлечения). Испытуемый раствор: 1,0 мл раствора А испытуемого извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % концентрации (раствор Б испытуемого извлечения). Оптическую плотность раствора Б испытуемого извлечения измеряют на спектрофотометре при длине волны 416 нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1,0 мл раствора А испытуемого извлечения (1:30), доведенного спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Примечание: Приготовление раствора мирицитрина-стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) мирицитрина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл 96 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы в течение 30 минут, доводят объем раствора 96 % этиловым спиртом до метки (раствор А мирицитрина). 1,0 мл раствора А раствора СО мирицитрина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б мирицитрина). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 416 нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1,0 мл раствора А мирицитрина доведенного спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл (раствор сравнения Б мирицитрина).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин и абсолютно сухое сырье в
процентах (X) вычисляют по формуле:
где A – оптическая плотность испытуемого раствора; Ao – оптическая плотность раствора СО мирицитрина; m – масса сырья, г;
mо – масса СО мирицитрина, г;
W – потеря в массе при высушивании в процентах.
Для целей количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин при отсутствии стандартного образца мирицитрина было экспериментально определено значение показателя экстинкции (удельный показатель поглощения). Его величина при длине волны 416 нм составляет 432.
Метрологические характеристики средних результатов проведенных опытов 11 проб образцов из одной серии сырья свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости результатов анализа. Ошибка единичного определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин в коре Juglans nigra L. с доверительной вероятностью 95 % составляет ± 8,58 % (табл. 4).
Таблица 4 – Метрологические характеристики средних результатов методики количественного определения суммы флавоноидов в коре Juglans nigra L.
n f ̅ S2 S ̅ P(%) T(P, t) ±ΔX ±Δ̅ E,% 11 10 3,17 0,0149 0,1221 0,0368 95 2,23 ±0,27 0,08 ±8,58
Для валидации проводилась оценка аналитической методики по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность. Специфичность методик количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин определялась по соответствию максимумов поглощения суммы флавоноидов листьев ореха черного и стандартного образца мирицитрина в условиях дифференциальной спектрофотометрии после реакции с комплексообразователем. Линейную зависимость оптической плотности от концентрации в диапазоне от 400 до 3000 мкг/мл СО мирицитрина определяли с использованием серии из 5 проб растворов указанного образца. Скорректированный коэффициент детерминации составил 0,9954. Правильность методики определяли методом добавок. Систематическая составляющая неопределенности (δ) анализа – 4,56 %. Погрешность, определяемая для проб с добавками мирицитрина, находилась в пределах погрешности единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической погрешности.
Содержание суммы флавоноидов варьировало от 2,82±0,20 % до 3,17±0,25 %, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела для сырья данного растения содержание суммы флавоноидов не менее 2,5 %. Разработанная методика количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного в пересчете на мирицитрин методом дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 416 нм включена в проект фармакопейной статьи «Ореха черного кора».
С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин в листьях ореха черного установлены оптимальные условия пробоподготовки: однократное извлечение 80 % этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 30 минут в соотношении «сырье-экстрагент» – 1:30 и степени измельчения сырья – 2 мм.

Методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях ореха черного. Аналитическую пробу коры Juglans nigra L. измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. В термостойкую коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл помещают около 1,0 г измельченного сырья (точная навеска), прибавляют 30 мл спирта этилового 80 % концентрации. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с погрешностью ±0,01 г и оставляют на 1 час. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 минут. Дальнейший анализ проводят в соответствии с методикой, изложенной выше.
Метрологические характеристики средних результатов проведенных опытов 11 проб образцов из одной серии сырья свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости результатов анализа. Ошибка единичного определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин в листьях Juglans nigraL. с доверительной вероятностью 95% составляет ± 8,21 % (табл. 5).
Таблица 5 – Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях Juglans nigra L.
n f ̅ S2 S ̅ P(%) T(P, t) ±ΔX ±Δ̅ E,% 11 10 3,28 0,0146 0,1209 0,0365 95 2,23 ±0,27 0,08 ±8,21
Линейную зависимость оптической плотности от концентрации в диапазоне от 400 до 3000мкг/мл СО мирицитрина определяли с использованием серии из 5 проб растворов указанного образца. Скорректированный коэффициент детерминации составил 0,9954. Правильность методики определяли методом добавок. Систематическая составляющая неопределенности (δ) анализа – 4,16 %.
Содержание суммы флавоноидов варьировало от 3,02+0,22 % до 3,28+0,24 %, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела для сырья данного растения содержание суммы флавоноидов не менее 3,0 %. Разработанная методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях ореха черного в пересчете на мирицитрин методом дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 416 нм включена в проект фармакопейной статьи «Ореха черного листья».
Разработка методик количественного определения мирицитрина и кверцитрина в коре и листьях ореха черного методом ВЭЖХ
Для разработки методик количественного определения содержания мирицитрина (мирицитрина и кверцитрина) методом ВЭЖХ в коре и листьях ореха черного в качестве прототипа была использована методика ВЭЖХ анализа листьев ореха грецкого с градиентным элюированием и детектированием на диодной матрице. Разделение осуществляли на колонке Hypersil Gold C18 с обращенной фазой (размер частиц 5 мкм, 250 × 4,6 мм). Подвижная фаза состояла из 1% водного раствора уксусной кислоты (А) и метанола (Б) (Nour V. et al., 2013). Отличием полученной методики является состав элюентной системы, длины волн для детектирования, время анализа, а также использование изократического элюирования.
Испытуемые растворы извлечений коры и листьев ореха черного получены в соответствии с параметрами пробоподготовки методики количественного определения суммы флавоноидов впересчете на мирицитрин в условиях дифференциальной спектрофотометрии. Расчет содержания мирицитрина проводили методом внешнего стандарта.
Методика количественного определения мирицитрина в коре ореха черного. Полученный ранее испытуемый раствор А (см. методику количественного определения суммы флавоноидов в

коре ореха черного) использовали для методики количественного определения мирицитрина в коре ореха черного методом ВЭЖХ. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса) и затем дополнительно через мембранный фильтр Milipore с диаметром пор 0,45 мкм (испытуемый раствор).
В жидкостной хроматограф «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») с УФ-детектором вводят 4 мкл полученного раствора. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме на стальной колонке «КАХ-6-80-4» (No2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), элюентная система – ацетонитрил:вода в соотношении 2:8 с добавлением 1% уксусной кислоты, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента – 2000 мкл, объем пробы испытуемого раствора – 4 мкл. Рабочая длина волны 360 нм.
Для дальнейших расчетов осуществляют не менее 3 параллельных определений для испытуемого раствора извлечения и стандартного раствора мирицитрина. Определяют хроматографические пики мирицитрина на хроматограммах испытуемого раствора извлечения и раствора стандартного образца. По результатам 3 параллельных определений рассчитывают среднюю площадь пика мирицитрина на хроматограмме раствора СО мирицитрина и испытуемого раствора А извлечения.
Содержание мирицитрина в коре ореха черного в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
где S – среднее значение площади пика мирицитрина на хроматограмме испытуемого раствора; S0 – среднее значение площади пика мирицитрина на хроматограмме стандартного раствора; V – объем извлечения, мл; V1 – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл; V0 – объем раствора СО мирицитрина, мл; V2 – объем вводимой пробы раствора СО мирицитрина, мкл; m – масса сырья, г; m0 – масса СО мирицитрина, г; 0,98 – содержание основного вещества в СО мирицитрина; W – потеря в массе при высушивании сырья, %.
Метрологические характеристики средних результатов проведенных опытов 11 проб образцов из одной серии сырья свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости результатов анализа. Ошибка единичного определения содержания мирицитрина в коре ореха черного с доверительной вероятностью 95 % составляет ±7,88 % (табл. 6).
Таблица 6 – Метрологические характеристики средних результатов методики количественного определения мирицитрина в коре Juglans nigra L.
n f ̅ S2 S ̅ P(%) T(P, t) ±ΔX ±Δ̅ E,% 11 10 3,10 0,0120 0,1096 0,0331 95 2,23 ±0,24 0,07 ±7,88
С целью проверки пригодности хроматографической системы проводили 5-кратное хроматографирование 4 мкл раствора извлечения коры Juglans nigra L. Показатель эффективности хроматографической колонки составил 5115 теоретических тарелок, разрешение между пиками – 1,74, фактор асимметрии – 1,35.
Для валидации проводилась оценка аналитической методики по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность. Специфичность методик количественного определения содержания мирицитрина определялась по показателю разрешение между пиками, а также хроматографированием испытуемых растворов СО мирицитрина. Линейную зависимость площади пика от концентрации в диапазоне от 250 до 2000 мкг/мл СО мирицитрина определяли с использованием серии из 5 проб растворов указанного образца. Скорректированный коэффициент детерминации составил 0,9957. Правильность методики

определяли методом добавок. Систематическая составляющая неопределенности (δ) анализа – 3,96 %. Погрешность, определяемая для проб с добавками стандартных образцов, находилась в пределах погрешности единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической погрешности.
Установлено, что количественное содержание доминирующего вещества – мирицитрина для коры ореха черного, определенное с помощью метода ВЭЖХ, варьирует от (3,08±0,18) % до (3,14±0,22) %. Разработанная методика количественного определения мирицитрина в коре ореха черного методом ВЭЖХ включена в проект фармакопейной статьи «Ореха черного кора».
Методика количественного определения мирицитрина (кверцитрина) в листьях ореха черного. Полученный ранее испытуемый раствор А (см. методику количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного) использовали для методики количественного определения мирицитрина в коре ореха черного методом ВЭЖХ. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса) и затем дополнительно через мембранный фильтр Milipore с диаметром пор 0,45 мкм (испытуемый раствор).
В жидкостной хроматограф «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») с УФ-детектором вводят 4 мкл полученного раствора. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме на стальной колонке «КАХ-6-80-4» (No2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), элюентная система – ацетонитрил:вода в соотношении 2:8 с добавлением 1% уксусной кислоты, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента – 2500 мкл, объем пробы испытуемого раствора – 4 мкл. Рабочая длина волны 360 нм.
Метрологические характеристики средних результатов проведенных опытов 11 проб образцов из одной серии сырья свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости результатов анализа. Ошибка единичного определения содержания мирицитрина в листьях ореха черного с доверительной вероятностью 95 % составляет +8,05 % (табл. 7).
Таблица 7 – Метрологические характеристики средних результатов методики количественного определения мирицитрина (кверцитрина) в листьях Juglans nigra L.
n f ̅ S2 11 10 2,62 0,009 11 10 1,41 0,006
S 0,094 0,077
̅ P(%) T(P, t) ±ΔX ±Δ̅ E,% 0,029 95 2,23 ±0,21 0,06 ±8,05 0,023 95 2,23 ±0,17 0,05 ±11,11
Линейность методики определяли для серии растворов мирицитрина и кверцитрина (с концентрациями в диапазоне от 250 до 2000 мкг/мл). Скорректированный коэффициент детерминации определении СО мирицитрина составил 0,9957. Коэффициент детерминации при определении СО кверцитрина – 0,9967. Правильность методики определяли методом добавок. Систематическая составляющая неопределенности анализа – 4,75 %.
3. Морфолого-анатомическое исследование коры и листьев ореха черного (Juglans nigra L.)
Морфолого-анатомическому анализу подвергали кора и листья ореха черного. Данное исследование позволило выявить диагностические признаки, характерные для коры ореха черного: особенности внешнего вида, расположения тканей и локализации включений. Кроме того, выявлены основные диагностические признаки листьев ореха черного: особенности внешнего вида, формы эпидермиса и локализации его производных и различных включений
Рисунок 8 – Результаты морфолого-анатомического исследования листьев ореха черного (Juglans nigra L.)
Обозначения: А – центральная жилка листовой пластины– поперечное сечение (x 100); Б – проводящая система центральной жилки (х 400); В – фрагмент поперечного сечения черешка
(х 100); Г – фрагмент боковой жилки.
К диагностическим особенностям черешков и листовой пластинки листьев ореха черного можно отнести: очертания центральной жилки округлой формы, уплощенной с адаксиальной стороны с 3 пучками проводящих тканей: одного основного – в форме полумесяца, а также 2 других с адаксиальной стороны. Центральная жилка достаточно армирована: склеренхима окружает проводящие пучки центральной жилки, отмечается значительное содержание крупных округлых друз в базальной части листовой пластинки (рис 8 А-Г).
Рисунок 9 – Люминесцентная микроскопия: 1-5 – индивидуальных соединений СО; А-Г – тканей коры и листьев ореха черного
Обозначения: 1 – юглон; 2 – мирицитрин; 3 – кверцетин; 4 – кверцитрин; А – кора ореха черного – поперечное сечение; Б – фрагмент основной паренхимы коры ореха черного – поперечное сечение; В – центральная жилка листовой пластины листа ореха черного; Г – проводящая
система центральной жилки листовой пластины листа ореха черного.
Анализ с использованием люминесцентной микроскопии выявил активное свечение тканей феллемы, проводящей и механической систем коры ореха черного (рис. 9-А). Кроме того, в основной паренхиме поперечного сечения с достоверной повторяемостью обнаруживаются скопления мелких кристаллов. При облучении поперечных сечений УФ-светом при 360 нм обнаруживается характерное желтое и оранжевое свечение кристаллических включений (рис. 9- Б), что соответствует свечению при тех же длинах волн образцов юглона и мирицитрина (рис. 9- 1). Такой же анализ проведен и для тканей листьев ореха черного. Полученные данные люминесценции свидетельствуют о том, что кверцитрин обнаруживается в основном в области флоэмных тканей, а в клетках основной паренхимы локализуются кристаллические включения мирицитрина (рис. 9-В, 9-Г).

4. Разработка методик стандартизации экстракционных препаратов коры и листьев ореха черного
В результате проведенных фармакогностических и аналитических исследований обоснована целесообразность создания экстракционных препаратов на основе коры и листьев ореха черного.
В лабораторных условиях нами получены образцы настоек коры и листьев ореха черного на 70 % этиловом спирте методом модифицированной дробной мацерации. Определение основных групп БАС образцов настоек коры и листьев ореха черного проводили методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии в УФ и видимой части спектра по методикам анализа соответствующих видов растительного сырья, адаптированных для препаратов. В качестве внутреннего свидетеля использовались стандартные образцы мирицитрина и кверцитрина, ранее применяемые для стандартизации коры и листьев ореха черного.
Разработанные методики количественной оценки содержания флавоноидов в пересчете на мирицитрин в коре и листьев Juglans nigra L. были адаптированы для контроля качества настоек из указанных видов сырья. Рекомендуемое содержание суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин в препаратах «Ореха черного коры настойка» и «Ореха черного листьев настойка» должно составлять не менее 0,5 %.
Разработанные методики количественной оценки содержания мирицитрина в коре Juglans nigra L., мирицитрина и кверцитрина в листьях коре Juglans nigra L. были также адаптированы для контроля качества настоек из указанных видов сырья. Рекомендуемое содержание мирицитрина и кверцитрина в препаратах «Ореха черного коры настойка» и «Ореха черного листьев настойка» – не менее 0,1 % соответственно.
5. Определение фармакологической активности растительного сырья и препаратов коры и листьев ореха черного
Проведенный прогноз фармакологической активности субстанций мирцитрина и кверцитрина с использованием программы PASS позволил принять решение о проведении дальнейших исследований нейротропной активности мирицитрина. В результате исследования нейротропной активности мирицитрина, выделенного из коры ореха черного, установлено, что при однократном внутрижелудочном введении мирицитрина в дозе 0,5 мг/кг отмечалось достоверное повышение двигательной активности опытных крыс относительно водного контроля (на 25% по отношению к водному контролю). В тоже время при однократном внутрижелудочном введении мирицитрина в дозе 5 мг/кг наблюдалось достоверное снижение двигательной активности животных в опытной группе на 46 % по отношению к водному контролю.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное сравнительное фармакогностическое исследование некоторых видов рода Орех (Juglans L.) позволило сделать следующие общие выводы:
1. Сравнительное фитохимическое исследование растительного сырья видов рода Орех (Juglans L.) позволило выявить присутствие в коре и листьях ореха черного, листьях ореха грецкого и ореха серого химических соединений флавоноидной природы, что представляет интерес в плане дальнейшего изучения сырьевой базы видов рода Juglans L., среди которых наиболее перспективными источниками биологически активных соединений флавоноидной природы являются кора и листья ореха черного.
2. С использованием хроматографических (колоночной хроматографии, ТСХ, ВЭЖХ), спектральных (ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии) методов из коры ореха черного впервые выделены и идентифицированы мирицитрин (3-O-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,3’,4’,5’-
гексагидроксифлавона), его агликон мирицетин (3,5,7,3’,4’,5’-гексагидроксифлавон), сакуранин (сакуранетин-5-O-β-D-глюкопиранозид; 5-O-β-D-глюкопиранозид 5,4’-дигидроски-7- метоксифлаванона) и его агликон сакуранетин (5,4’-дигидроски-7-метоксифлаванон). Кроме того, выделен юглон (5-гидрокси-1,4-нафтохинон), уже описанный для коры ореха черного. Из листьев ореха черного были выделены и идентифицированы этоксиюглон (2-этокси-5-гидрокси- 1,4-нафтохинон), кверцитрин (3-O-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,3’,4’-гексагидроксифлавона) и его агликон кверцетин (5,4’-дигидроски-7-метоксифлаванон), мирицитрин (3-O-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,3’,4’,5’-гексагидроксифлавона) и его агликон мирицетин (3,5,7,3’,4’,5’- гексагидроксифлавон).
3.Обоснована целесообразность определения мирицитрина и кверцитрина методом тонкослойной хроматографии для коры и листьев Juglans nigra L. с использованием в качестве веществ-свидетелей стандартных образцов мирицитрина (кора и листья), кверцитрина (листья). Кроме того, в оценке подлинности коры ореха черного целесообразно использование метода спектрофотометрии, с помощью которой установлены характерные максимумы поглощения: для коры и листьев ореха черного λmax1 = 270±2 нм ; λmax2=360±2 нм и λmax1 = 270±2 нм ; λmax2 = 356±2 нм в прямом варианте, λmax = 416±2 нм и λmax = 412±2 нм в дифференциальном варианте.
4. Разработаны методики количественного оценки содержания флавоноидов в пересчете на мирицитрин для растительного сырья коры и листьев Juglans nigraL. в условиях дифференциальной спектрофотометрии при λ=416±2 нм. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на мирицитрин в коре и листьях Juglans nigra L. варьирует в пределах от 2,94 % до 3,17 %, и от 3,02 % до 3,28 % соответственно. Величина числового показателя содержания флавоноидов в пересчете на мирицитрин в коре Juglans nigra L. – не менее 2,5 %. Величина числового показателя содержания флавоноидов в пересчете на мирицитрин в листьях Juglans nigra L. – не менее 3,0%.
5. Разработаны методики количественного определения мирицитрина в коре Juglans nigra L., а также мирицитрина и кверцитрина в листьях Juglans nigra L. с использованием метода ВЭЖХ. Содержание мирицитрина в коре Juglans nigra L. варьирует в пределах от 3,08 % до 3,14 %. Содержание мирицитрина и кверцитрина в листьях Juglans nigra L. варьирует в пределах от 2,58 % до 2,62%. и 1,36 % до 1,45 % соответственно. Величина числового показателя содержания мирицитрина в коре Juglans nigraL. – не менее 2,0%. Величина числового показателя содержания мирицитрина и кверцитрина в листьях Juglans nigra L. – не менее 1,5 % и 1,0 % соответственно.
6.Выявлены основные признаки локализации доминирующих и диагностически значимых соединений в коре и листьях ореха черного. С использованием метода люминесцентной микроскопии выявлено, что наибольшая концентрация фенольных соединений (юглон, мирицитрин) находится в тканях основной паренхимы мягкого луба. С использованием метода люминесцентной микроскопии выявлено, что кверцитрин обнаруживается в основном в области флоэмных тканей, а в клетках основной паренхимы локализуются кристаллические включения мирицитрина.
7. Методики качественного и количественного определения БАС коры и листьев ореха черного адаптированы для растительных препаратов «Ореха черного коры настойка» и «Ореха черного листьев настойка» с использованием фотометрических и хроматографических методов анализа. Числовой показатель минимального содержания флавоноидов в пересчете на мирицитрин в препарате «Ореха черного коры настойка» – не менее 0,5 %. Нижний предел содержания мирицитрина в препарате «Ореха черного коры настойка» – не менее 0,1%.
Числовой показатель минимального содержания флавоноидов в пересчете на мирицитрин в препарате «Ореха черного листьев настойка» – не менее 0,5 %. Нижний предел содержания мирицитрина и кверцитрина в препарате «Ореха черного листьев настойка»– не менее 0,1 % соответственно.
8. Программой PASS осуществлен прогноз фармакологической активности выделенных из растительного сырья субстанций. С использованием теста Порсолта установлено, что мирицитрин, выделенный из коры ореха черного, обладает нейротропной активностью.
9.Предложены проекты фармакопейных статей на новые виды лекарственного растительного сырья «Ореха черного кора» и «Ореха черного листья».
Практические рекомендации. Разработанные научно-обоснованные подходы к стандартизации сырья видов рода Juglans L. позволяют объективно оценить качество указазанного растительного сырья. Подготовленные проекты фармакопейных статей рекомендуются для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации следующих изданий. Результаты исследования допускается использовать в учебном процессе, а также в центрах контроля качества ЛС, а также в проиводственном процессе фармацевтических предприятий.
Перспективы дальнейшей разработки темы имеют научно-практическое значение для задач фармакогностического и фармацевтического анализа и заключаются в экспериментально- аналитической работе по углубленому изучению химического состава других видов сырья рода Juglans L., и последующей разработке объективных и унифицированных подходов к стандартизации ЛРС и ЛРП.