Таксономическое разнообразие кишечной микробиоты и его клиническое значение в развитии патологии пищеварительного тракта на фоне инвазии Opisthorchis felineus у детей

Клинические группы и методы исследования. Исследование выполнено на базе ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России в период 2016-2019 гг. при поддержке гранта РФФИ No 16-44-700148 «Фундаментальные подходы к оптимизации диагностики и терапии природно-очаговой инвазии O. felineus эндемичных регионах». В качестве клинических баз использованы: детская клиника ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (заведующий отделением канд. мед. наук Козырицкая Д.В.), ОГБУЗ «Областная детская больница» (главный врач канд. мед. наук Тимошина Е.Л.), ОГБУЗ «Шегарская районная больница» (главный врач Мазеина С.В.). Выделение бактериальной ДНК из образцов стула, а также биоинформатический и статистический анализ метагеномных данных, выполняли на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (заведующий д-р мед наук, профессор Е.В. Удут). Секвенирование образцов проводили на базе лаборатории института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и ООО «Кномикс» (г. Москва). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (заключение от 31 октября 2016 г., регистрационный номер 4981).
В соответствии с поставленными задачами исследование выполнено в три этапа. Первый этап (скрининговый) спланирован в дизайне одномоментного исследования в рандомизированной выборке жителей Шегарского района Томской области (в рамках «Эпидемиологического исследования распространенности инвазии O. felineus в Томской области»). Общая численность репрезентативной выборки жителей подворий 9 сельских населенных пунктов составила 600 человек, в том числе включены 85 детей в возрасте 7– 18 лет (рис. 1).
I. Скрининговый этап
Дизайн: одномоментное исследование в рандомизированной выборке
Дети 7-18 лет
II. Клинико-фармакологический этап
Дизайн: проспективное клинико-фармакологическое исследование «случай контроль»
600 участников (7-85 лет)
Группа 1 – дети, не страдающие инвазией
O. felineus
(n = 50)
Группа 2- дети, страдающие инвазией
O. felineus
III. Этап исследования микробиоты кишечника
Группа 1 – дети, не страдающие инвазией O.felineus (n = 50)
Группа 2 – дети, страдающие инвазией O.felineus (n = 50)
Дети, страдающие инвазией O. felineus
Дети, не страдающие инвазией O. felineus
V0 V1 V2 V3 V4 V5
12-24ч 7 дней часа
1 мес.
3 мес.
felineus(n = 50)
Сбор анамнеза Физикальное обследование
УЗИ ГБС Микроскопия образцов стула Сбор образцов Дегельминтизация
– Выделение бактериальной ДНК из образцов стула
– Ампликонное секвенирование микробиоты по фрагменту V4 гена бактериальной 16SрРНК
– Биоинформатический анализ
Группа 3 – через 3 месяца после дегельминтизации (n = 48)
Рисунок 1 – Схема этапов и дизайн исследования
Критерии включения скринингового этапа: дети от 7 до 18 лет, проживающие в Шегарском районе Томской области. Критерии исключения скринингового этапа: наличие клинически значимых неконтролируемых состояний или заболеваний, которые, по мнению исследователя, могут повлиять на участие пациента в исследовании и/или проведении каких- либо процедур и интерпретации результатов в рамках исследования; отказ от участия в исследовании. На данном этапе применены следующие методы исследования:
– Сбор анамнеза и интервьюирование
– Физикальное обследование
– УЗИ гепатобилиарной системы (ГБС) – Микроскопия образцов стула
– Сбор образцов крови, стула
1. Клинико-анамнестические: интервьюирование по индивидуальному клиническому вопроснику, содержащему разделы о демографических, социокультурных, медицинских данных; физикальное обследование; 2. Лабораторные: биохимическое исследование сыворотки крови (DiaSys Diagnostic Systems GmbH, Германия); 3. Инструментальные: ультразвуковое исследование гепатобилиарной системы (портативный ультразвуковой аппарат М7, Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics, Co, Ltd). Степень перидуктального фиброза оценивали в соответствии с критериями, используемыми в эпидемиологических исследованиях в эндемичных по описторхозу районах: степень 0 – отсутствие эхо-сигналов в печени, степень 1 – эхо-сигнал в одном сегменте печени, степень 2 – эхо-сигнал в 2–3 сегментах печени и степень 3 – более чем в трех сегментах печени [B. Sripa, 2009]; 4. Микроскопия образцов стула с применением одноразовых концентраторов «PARASEP» (Diasys Ltd, Великобритания) и определением интенсивности инвазии (низкая – 0-999 яиц в одном грамме стула, средняя – 1000-9999, высокая – 10000 и более).
Второй этап (клинико-фармакологический) проведен в дизайне проспективного исследования «случай-контроль», в рамках которого включены 100 детей: группа 1 – дети, не страдающие инвазией O. felineus, а также не имеющие острых и хронических болезней (n = 50, средний возраст 10,3 ± 2,8 лет), группа 2 – дети, страдающие инвазией O. felineus (n = 50, средний возраст 11 ± 3,4 лет). Антигельминтная терапия проведена празиквантелом в дозе 60 мг/кг массы тела в три приема с интервалом четыре часа. Проспективное наблюдение включало в себя 6 визитов. Через три месяца после терапии проводили сбор образцов стула для контрольного паразитологического исследования, а также для выделения бактериальной ДНК.
Критерии включения в группу 1 (дети, не страдающие инвазией O. felineus): дети от 7 до 18 лет, проживающие в Томской области; отсутствие инвазии O. felineus по данным паразитологического и серологического исследования и/или другой гельминтной инвазии; отсутствие ранее установленных тяжелых хронических заболеваний. Критерии включения в группу 2 (дети, страдающие инвазией O. felineus): дети от 7 до 18 лет, проживающие в Томской области, с подтвержденной инвазией O. felineus (по результатам микроскопии стула); отсутствие ранее установленных тяжелых хронических заболеваний.
Критерии исключения для всех исследуемых групп: прием антибактериальных препаратов или других антимикробных средств в течение трех месяцев, предшествующих исследованию; длительный прием системных глюкокортикостероидных препаратов; прием эубиотиков в течение одного месяца до начала исследования; кишечные инфекции в течение одного месяца до начала исследования, наличие клинически значимых состояний или заболеваний, которые могут повлиять на участие пациента в исследовании и/или проведении процедур и интерпретации результатов в рамках исследования.
В рамках третьего этапа выполнено исследование микробиоты образцов стула с использованием метода 16S рРНК секвенирования в группах, сформированных в результате клинико-фармакологического этапа: 1 – дети, не страдающие инвазией O. felineus (n = 50), 2 – дети, страдающие инвазией O. felineus до антигельминтного лечения (n = 50) и группа 3 – пациенты через три месяца после дегельминтизации празиквантелом (n=48). Для оценки вклада микробиоты в формирование клинической формы описторхоза дети, страдающие инвазией, стратифицированы на три подгруппы: группа 2А – клинически выраженная форма с явлениями холепатии (n = 22); группа 2В – клинически выраженная форма с явлениями гастродуоденопатии (n = 18); группа 2С – пациенты с латентной формой(n = 10).
Критерии включения в группу 3 (пациенты через три месяца после дегельминтизации): пациенты, страдающие инвазией O. felineus, после дегельминтизации празиквантелом и имеющие отрицательный результат при двукратной микроскопии образцов стула на наличие яиц O. felineus через три месяца после дегельминтизации.
На данном этапе применены следующие методы исследования: выделение бактериальной ДНК из образцов стула по стандартному протоколу к набору FastDNA® SPIN Kit for Soil (MPBio, США, www.mpbio.com) и ампликонное секвенирование микробиоты по маркерному фрагменту V4 гена бактериальной 16S рРНК осуществляли согласно протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Part #15044223 Rev. B), рекомендованному Illumina для секвенатора MiSeq.
Статистические методы. Статистическую обработку клинико-анамнестических данных и лабораторно-инструментальных параметров проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows version 10.0». Для установления зависимости исхода от фактора рассчитывали отношение шансов, приведено в виде OR (95 % CI). Различия в клинических и параклинических параметрах между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни-Уилкоксона и критерия χ2, в связанных выборках (до и после лечения) использовали критерий Уилкоксона. Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные – при нормальном распределении в виде М ± m, где М – среднее арифметическое, m – стандартное отклонение, при распределении, отличном от нормального – Mediana (Q25; Q75). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Биоинформатический анализ. Таксономический анализ прочтений секвенатора осуществляли с использованием программного обеспечения QIIME2 версия 2019.1.0. Для всех прочтений проводили фильтрование по качеству с порогом в 30 баллов phred, дерепликацию, а также de novo идентификацию и удаление химерных последовательностей. Пригодные прочтения кластеризовали по сходству (не менее 99%) с базой данных SILVA 132 с использованием алгоритма q2-vsearch. Таксономическую классификацию кластеров осуществляли с использованием плагина q2-feature-classifier в основе которого лежит использование наивного байесовского классификатора, обученным на области 515F / 806R последовательностей гена 16S рРНК из базы данных SILVA 132. Статистический анализ данных состава кишечной микробиоты проводили с использованием языка программирования R версии 3.6.1. Анализ ассоциаций между альфа- разнообразием, наличием инвазии и влиянием терапии - линейная смешанная регрессия; связь между интенсивностью инвазии и индексами альфа-разнообразия - метод отрицательной биномиальной регрессии. Для определения достоверности попарного различия сообществ по составу микробиоты - парный пермутационный (перестановочный) дисперсионный анализ с оценкой значимости при 9999 перестановках. Анализ численности таксонов с использованием обобщенной линейной смешанной модели с предположением об отрицательном биномиальном распределении зависимой переменной – представленности бактерий. Все модели были проверены с помощью ANOVA II-типа; для значимых моделей расчет предельных средних значений и дополнительный анализ Тьюки. Поправка на множественное сравнение методом FDR, различия считались достоверными при p < 0,05 после применения поправки. Дополнительно анализ данных микробиоты выполнен с использованием платформы Knomics- Biota и доступен онлайн в виде интерактивных отчетов на сайте https://biota.knomics.ru/opisthorchis-and-gut-microbiome-2019 [D. Efimova, 2018]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты скринингового этапа. В диссертационной работе представлены результаты обследования 85 детей (средний возраст 11 ± 3 лет), включенных в состав выборки «Эпидемиологического исследования распространенности инвазии O. felineus в Томской области». Доля мальчиков, включенных в исследование, была равна 41 % (n = 35), девочек - 59 % (n = 50). Анализ результатов интервьюирования показал, что детское население не имеет достаточно знаний о способах заражения и профилактики инвазии O. felineus. Так, осведомленность об описторхозе детского населения составила 63,5 %, при этом в группе детей в возрасте 7–10 лет данный показатель статистически значимо ниже, чем в возрасте 11–18 лет – 47,4 и 76,3 % соответственно (OR = 3,6; 95 % CI 1,34–9,56; р = 0,01). В то же время осведомленность в группе детей почти в два раза ниже по сравнению со взрослыми (63,5 % против 98,6 %, OR 39,1; CI95 % 15,5-98,2). Большинство детей регулярно употребляют в пищу речную рыбу (76,5%), в том числе в термически необработанном виде. Только 35,8% респондентов указали, что употребление речной рыбы в термически необработанном виде является основной причиной описторхоза. Инвазия O. felineus установлена у 17,6 % детей (11,6 % - в выборке детей 7–10 лет, 23,8 % - в выборке детей 11–18 лет; р = 0,1, табл. 1). Различий по гендерному признаку в зависимости от наличия инвазии O. felineus у детей не установлено. Интенсивность инвазии O. felineus варьировала в диапазоне 2–3800 яиц гельминта в грамме фекалий (среднее значение 321 ± 969,2), превалировала низкая интенсивность инвазии (≤999 яиц в грамме стула – 93,3 %). Таблица 1 - Характеристика участников скринингового этапа в зависимости от наличия инвазии O. felineus Возраст n%n%n% 7-10 лет 43 50,6 38 88,4 5 11,6 11-18 лет 42 49,4 32 76,2 10 23,8 По данным ультразвукового исследования печени и желчевыводящей системы у детей, страдающих описторхозом, в сравнении с неинфицированными участниками чаще выявляли следующие изменения: наличие эхогенного содержимого в желчном пузыре и утолщение и неровность его стенок (71,4 % и 37,1 % соответственно, OR = 1,9; 95 % CI 1,2–3,1; p = 0,012), перидуктальный фиброз внутрипеченочных протоков первой степени (26,7 % и 8,6 %, соответственно, OR = 3,1; 95 % CI 1,0–9,7; p = 0,04). Результаты клинико-фармакологического этапа. В структуре клинических проявлений превалировал болевой синдром (боль в животе – 92 %, в том числе в правом подреберье – 56 %), диспепсические проявления (изжога – 8 %, тошнота – 52 %, нарушения стула – 50 %). По данным УЗИ печени и желчевыводящей системы изменения со стороны желчного пузыря значимо чаще регистрировали у детей, страдающих инвазией O. felineus, в сравнении с неинвазированными (42 % и 24 %, соответственно, OR = 1,8; 95 % CI 1,0–3,2; p = 0,03). По результатам эндоскопического обследования у 72 % детей выявлены умеренные и у 7 % выраженные проявления экссудативно–эритематозного дуоденита. Дуоденогастральный рефлюкс с признаками рефлюкс–гастрита регистрировали у 16 % детей. Проявления рефлюкс– эзофагита выявлены у 35 % пациентов. Согласно результатам клинико–фармакологического исследования выявлено, что дегельминтизация празиквантелом в дозе 60 мг/кг имеет достаточно высокий профиль безопасности у пациентов детского возраста, с низкой частотой нежелательных реакций – только 14 % детей предъявляли жалобы в первые сутки после приема препарата, среди которых головная боль, слабость, снижение аппетита, тошнота и боль в животе. Все нежелательные явления относились к категории легких. Динамическое наблюдение детей после Всего (n = 85) Дети, не имеющие инвазии O. felineus (n = 70) Дети, страдающие инвазией O. felineus (n = 15) антигельминтного лечения показало, что клиническое улучшение регистрируется через 3 месяца и выражается снижением частоты болей в животе (92 % против 40 %, p < 0,01), тошноты (52 % против 8 %, p < 0,01), зудящих высыпаний (24 % против 6 %, p < 0,01). По данным УЗИ после дегельминтизации через три месяца сохраняются изменения в гепатобилиарной системе в виде утолщения стенки желчного пузыря и неоднородности структуры паренхимы печени. Однако, у пациентов уже через три месяца значимо реже регистрировали наличие эхогенного содержимого в желчном пузыре (20 % и 32 %, соответственно, р = 0,02). Через один месяц после антигельминтного лечения положительные результаты паразитологического исследования отмечали у 8 % пациентов (среднее значение 6 ± 6,8 яиц O. felineus в грамме стула), через три месяца - дегельминтизация показала 100 % эффективность у детей. Результаты метагеномного анализа микробиоты кишечника детей. В результате оценки альфа-разнообразия по индексам таксономического разнообразия Фэйта, Шеннона и observed OTUs выявлена тенденция к увеличению таксономического богатства у пациентов с инвазией O. felineus по сравнению с неинвазированными участниками, однако данные различия не были значимы (индекс Фэйта: р = 0,73; индекс Шеннона: р = 0,44; observed OTUs: р = 0,76). Состав кишечной микробиоты пациентов после лечения характеризовался таким же таксономическим разнообразием, как и до дегельминтизации и у детей группы сравнения. У пациентов с описторхозом по результатам оценки трех индексов разнообразия (Фэйта: R = 0,5; р < 0,01; Шеннона: R = 0,4; р < 0,01; observed OTUs: R = 0,3, р < 0,01) выявлена положительная ассоциация между интенсивностью инвазии, выраженной количеством яиц на один грамм стула, и альфа-разнообразием (рис.2). Рисунок 2 - Различия в таксономическом разнообразии микробиоты кишечника в зависимости от интенсивности инвазии O. felineus П р и м е ч а н и е – на рисунке графики представляют ассоциации между интенсивностью инвазии, измеренной как количество яиц O. felineus на один грамм фекалий, и индексами Фэйта, Шеннона и числом наблюдаемых OTU в группе детей, страдающих инвазией O. felineus. В ходе исследования проведена оценка бета-разнообразия микробиоты. При оценке вклада статуса пациента в бета-разнообразие микробиоты выявлены различия между составом метагенома у детей с инвазией O. felineus и группы детей, не страдающих инвазией (R2 = 0,05; p = 0,01), а также между неинвазированными участниками и пациентами после лечения (R2 = 0,07; р < 0,01). Не выявлено значимых различий по бета-разнообразию между образцами, полученными до и после дегельминтизации (R2 = 0,02; p = 0,18). Для детальной оценки состава микробиоты кишечника определены таксоны, которые встречаются более чем в 10 % образцов и составляют не менее 0,01 % от состава микробиома в каждом образце. Наиболее представленными типами в микробиоте кишечника исследуемых групп были Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes и Proteobacteria. Менее представленными типами во всех образцах были Verrucomicrobia, Tenericutes, Euryarchaeota, Cyanobacteria, Synergistetes. В среднем, соотношение Firmicutes/ Bacteroidetes у детей составило 7,5. На уровне семейств в микробиоте кишечника во всех группах преобладали Lachnospiraceae (35,4 ± 17 %), Ruminococcaceae (21,6 ± 12,3 %), Bifidobacteriaceae (11 ± 11,2 %), Bacteroidaceae (4 ± 5,8 %), Prevotellaceae (3,7 ± 7 %). Всего идентифицировано 45 семейств с представленностью более 0,01 % от состава метагенома. Среди наиболее представленных бактериальных родов в структуре идентифицированных метагеномов определены Blautia (13,1 ± 9,9 %), Bifidobacterium (11,2 ± 11,7 %), Faecalibacterium (6,7 ± 6,8 %), Bacteroides (4,1 ± 5,9 %), Agathobacter (3,2±3,5%), Ruminococcus (2,7±3,4%) и Prevotella 9 (3,1±6,3%), Dorea (3,1±2,1%) и Eubacterium hallii group (2,9 ± 2,1 %). Всего идентифицировано 138 родов, представленность которых была выше 0,01 %. Влияние инвазии O. felineus и дегельминтизации на микробиоту кишечника. На уровне типов в микробиоте кишечника у пациентов с инвазией O.felineus выявлено уменьшение представленности бактерий типа Firmicutes и увеличение содержания Proteobacteria в сравнении с участниками без инвазии (табл. 2). Таблица 2 – Различия в составе кишечной микробиоты на уровне типов Тип Proteobacteria Firmicutes Synergistetes Группа 1 71,64 (14,31) 3757,84 (118,74) 0,37 (0,33) Группа 2 257,19 (54,49)* 3287,1(102,87)* 0,59(0,51) Группа 3 96,67 (17,96)** 3717,67(118,7)** 0,01 (0,01) *** p# < 0,01 0,02 0,04 Примечание– данные представлены в виде emmean ± SE; # различия в представленности таксонов статистически значимы при уровне р<0,05 (ANOVA, значения p даны с поправкой FDR);* различия значимы при сравнении с Группой 1, р < 0,05; ** различия значимы при сравнении с Группой 2, р < 0,05; *** различия значимы при сравнении с Группой 1 и Группой 2, р < 0,05. После дегельминтизации через три месяца отмечали увеличение содержания Firmicutes и снижение Proteobacteria относительно их представленности у пациентов с инвазией до лечения и, таким образом, были сопоставимы с уровнем в группе детей, не страдающих инвазией. В образцах стула после лечения выявлено снижение представленности бактерий типа Synergistetes в сравнении с группой детей без инвазии и пациентами до лечения. На уровне семейств в микробиоте кишечника пациентов с инвазией O. felineus в сравнении с группой детей, не страдающих инвазией, преобладали бактерии Enterobacteriaceae (табл. 3). Содержание Enterobacteriaceae в образцах, полученных после лечения, снижалось до уровня, сопоставимого с группой детей, не страдающих инвазией. Дегельминтизация привела к уменьшению представленности Atopobiaceae по сравнению с группой неинвазированных детей и пациентами с инвазией. Таблица 3 – Различия в составе кишечной микробиоты на уровне семейств Семейство микроорганизмов Группа 1 Группа 2 150,61(48,97)* 6,69 (3,24) Группа 3 21,03 (6,76)** 0,57 (0,24) *** p# < 0,01 < 0,01 Enterobacteriaceae 31,62 (9,94) Atopobiaceae 12,44(4,9) Примечание– данные представлены в виде emmean ± SE; # различия в представленности таксонов статистически значимы при уровне р<0,05 (ANOVA, значения p даны с поправкой FDR);* различия значимы при сравнении с Группой 1, р < 0,05; ** различия значимы при сравнении с Группой 2, р < 0,05; *** различия значимы при сравнении с Группой 1 и Группой 2, р < 0,05. Различия в представленности бактерий на уровне рода между исследуемыми группами представлены в таблице 4. Таблица 4 – Различия в составе кишечной микробиоты на уровне родов Род микроорганизмов Escherichia-Shigella Lachnospira Anaerosporobacter Ruminiclostridium 6 Группа Eubacterium eligens Faecalitalea Bacteroides Barnesiella Blautia Группа Eubacterium hallii Lachnospiraceae FCS020 Flavonifractor Leuconostoc Oscillibacter Группа 1 27,71 (9.21) 2,67 (0.78) 0,18 (0.10) 1,72 (0.73) 3,42 (1.13) 0,02 (0.02) 105,37 (24.28) 2,54 (0.81) 789,02 (90.70) 182,82 (22.52) 13,90 (2.13) 0,36 (0.16) 0,12 (0.10) 0,99 (0.26) Группа 2 131,61 (45.48)* 9,70 (2.83)* 1,50 (0.70)* 6,24 (2.33)* 13,00 (4.53)* 0,52 (0.29)* 238,04 (50.03)* 7,81 (2.80)* 444,76 (50.65)* 110,84 (13.55)* 6,96 (1.09)* 0,95 (0.33) 0,52 (0.37) 2,19 (0.53) Группа 3 p# 18,66 (6.21)** 4,04 (1.27)** 0,03 <0,01 0,02 (0.02)** 1,69 (0.66)** 0,04 5,63 (1.73) 0,04 1,21 (0.66)* 0,04 235,06 (51.92)* 0,04 8,97 (3.19)* 0,04 685,46 (79.62)** 0,02 123,77 (15.43) 0,04 10,02 (1.57) 0,04 1,68 (0.57)* 0,03 4,60 (3.24)* 0,03 3,05 (0.88)* 0,04 <0,01 Продолжение таблицы 4 Род микроорганизмов Группа Ruminococcus gauvreauii Howardella Slackia Lachnospiraceae NK4A136 Lachnospiraceae ND3007 Tyzzerella 4 Prevotella 2 Megasphaera Roseburia Olsenella Группа Rikenellaceae RC9 Sellimonas Faecalibacterium Erysipelatoclostridium Varibaculum Eisenbergiella Группа 1 45,35 (9.55) 3,39 (1.10) 3,04 (0.87) 11,35 (2.13) 6,15 (1.53) 1,45 (0.74) 2,14 (1.28) 16,96 (11.86) 54,37 (9.86) 3,51 (1.42) 2,31 (1.36) 1,49 (0.76) 0,90 (0.32) 1,13 (0.45) 0,02 (0.02) 1,18 (0.58) Группа 2 26,35 (5.86) 1,14 (0.39) 1,96 (0.57) 18,14 (3.34) 7,86 (1.97) 3,10 (1.54) 11,62 (6.78) 18,52 (12.82) 53,60 (9.38) 2,26 (0.91) 2,70 (1.57) 1,08 (0.55) 2,07 (0.61) 1,10 (0.37) 0,18 (0.10) 0,88 (0.43) Группа 3 p# 18,38 (4.13)* 0,04 0,79 (0.28)* 0,04 0,79 (0.25)* 0,04 6,23 (1.21)** <0,01 3,04 (0.93)** 0,04 0,25 (0.14)** 0,03 0,75 (0.46)** 0,04 0,04 (0.04)*** 27,8 (4.97)*** 0,03 <0,01 0,25 (0.12)*** 0,13 (0.09)*** 0,02 <0,01 19,4 (9.71)*** 5,94 (1.79)*** 3,40 (1.38)*** 0,04 <0,01 <0,01 2,48 (1.22)*** 9,40 (4.51)*** 0,01 <0,01 Примечание– данные представлены в виде emmean ± SE; # различия в представленности таксонов статистически значимы при уровне р<0,05 (ANOVA, значения p даны с поправкой FDR);* различия значимы при сравнении с Группой 1, р < 0,05; ** различия значимы при сравнении с Группой 2, р < 0,05; *** различия значимы при сравнении с Группой 1 и Группой 2, р < 0,05. Состояние микробиоты кишечника в зависимости от интенсивности инвазии. На уровне типов выявлено, что рост представленности Firmicutes (R = 0,55, р < 0,01) и Tenericutes (R = 0,57, р = 0,02) положительно связан с интенсивностью инвазии. Содержание бактерий, относящихся к типам Verrucomicrobia (R = -0,4, р = 0,02) и Proteobacteria (R = -0,36, р = 0,04), напротив, уменьшалось при увеличении интенсивности инвазии. На уровне семейств выявлена ассоциация интенсивности инвазии с представленностью Desulfovibrionaceae (R = 0,33, р = 0,02) и Erysipelotrichaceae (R = 0,52, р < 0,01), и отрицательная связь для Bifidobacteriaceae (R = -0,55, р<0,01). Соответствующие тенденции отмечены на уровне родов: представленность бактерий родов Desulfovibrio (R = 0,41, р = 0,01), Catenibacterium (R = 0,62, р = 0,03), группы Eubacterium coprostanoligenes (R = 0,3, р = 0,01), Mitsuokella (R = 0,48, р = 0,03), группы Rikenellaceae RC9 (R = 0,57, р = 0,03), Ruminococcaceae UCG-003 (R = 0,34, р = 0,03), Moryella (R = 0,42, р = 0,03), Olsenella (R = 0,46, р = 0,01), Candidatus Soleaferrea (R = 0,57, р = 0,03), Howardella (R = 0,52, р = 0,01), Enterorhabdus (R = 0,39, р = 0,04), и Senegalimassilia (R = 0,44, р = 0,03) коррелировала с интенсивностью инвазии O. felineus. Отрицательная ассоциация установлена между интенсивностью инвазии и представленностью родов Erysipelatoclostridium (R = -0,51, р = 0,01), Bifidobacterium (R = -0,55, р = 0,01), Anaerostipes (R = -0,49, р = 0,01), Gordonibacter (R = -0,54, р = 0,01), Akkermansia (R = 0,4, р = 0,04) и группы Eubacterium hallii (R = -0,37, р = 0,01). Особенности микробиоты кишечника в зависимости от клинических проявлений инвазии O. felineus. В сравнительном аспекте у пациентов с клинически выраженной формой с явлениями холепатии (группа 2А) в образцах кишечной микробиоты зарегистрированы снижение представленности микроорганизмов семейства Methanobacteriaceae, рода Senegalimassilia и повышение Pasteurellaceae, Staphylococcaceae и рода Holdemanella в сравнении с группами 2В и 2С (табл.5). Образцы микробиоты кишечника пациентов группы 2В отличались более высоким содержанием бактерий рода Lachnospiraceae UCG-001 и снижением представленности Atopobiaceae в сравнении с группами 2А и 2С. В то же время, более высокие уровни Methanobacteriaceae, Atopobiaceae и рода Senegalimassilia зарегистрированы у пациентов с латентной формой. Таблица 5 – Различия в составе метагенома между подгруппами пациентов с инвазией Семейство/Род Methanobacteriaceae Staphylococcaceae Atopobiaceae Pasteurellaceae Holdemanella Senegalimassilia Lachnospiraceae UCG- Группа 2А 7,29(0,66)* 17,76 (8,7) 5,59(2,79)* 4,35(2,1) 55,59 (1,81)* 6,59 (0,62) 0,71 (0,35)*** Группа 2В 14,33(1,09)* 2,5(1,52)** 0,42(0,31)* 0,58 (0,39)** 25,33 (1,45)* 9,42 (0,89)** 16,58 (8,1) Группа 2С p# 18,29 (1,04)* 2 (1,03)** 0,04 20,24 (9,94)* 0,01 0,47(0,28)** 0,04 <0,01 32,06 (1,37)* 11,41 (0,82)** 0,76 (0,38)*** <0,01 <0,01 <0,01 Примечание –данные для каждого таксона в группе представлены в виде M ± SD;# различия в представленности таксонов статистически значимы при уровне р<0,05 (ANOVA, значения p даны с поправкой FDR); * различия значимы при сравнении между группами, р<0,05; ** различия значимы при сравнении с Группой 2А, р<0,05; *** различия значимы при сравнении с Группой 2В, р<0,05. Сравнение интенсивности инвазии, выраженной в количестве яиц O. felineus в одном грамме стула, в подгруппах показало, что пациенты с клинически выраженной формой с явлениями гастродуоденопатии характеризуются более высоким уровнем интенсивности инвазии, чем дети с симптомами холепатии (коэффициент линейной модели 1,16 ±1,47, p = 0,03). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Микробиота кишечника детей, страдающих инвазией O. felineus, характеризуется увеличением представленности бактерий с патогенным потенциалом, таких как Proteobacteria, Enterobacteriaceae, Escherichia-Shigella, Bacteroides, и снижением представленности комменсальных, с потенциальным противовоспалительным эффектом, Firmicutes (Blautia, Eubacterium hallii, Lachnospiraceae FCS020). По данным предыдущих исследований микробиоты кишечника подобные особенности состава ассоциированы с воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы и кишечника (в соответствии с результатами предыдущих исследований). На фоне инвазии O. felineus выявлено повышение содержания отдельных бактерий, участвующих в продукции короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) и имеющих противовоспалительный потенциал (Lachnospira, Ruminiclostridium 6, Eubacterium eligens, Faecalitalea, Barnesiella), что демонстрирует возможности компенсаторного механизма микробиоты кишечника в поддержании гомеостаза при гельминтной инвазии. Более высокая интенсивность инвазии связана с увеличением представленности бактерий с патогенным потенциалом (Desulfovibrionaceae, Erysipelotrichaceae, Desulfovibrio, Candidatus Soleaferrea, Rikenellaceae RC9, Catenibacterium), и снижением бактерий с потенциальными пробиотическими свойствами Bifidobacterium и Akkermansia, что сопряжено с увеличением риска развития аллергических и аутоиммунных болезней. Через три месяца после антигельминтной терапии происходит восстановление представленности микроорганизмов Firmicutes и Proteobacteria, измененных на фоне инвазии O. felineus, иснижается представленность бактерий, ассоциированных с патологией гепатобилиарной системы (род Megasphaera) и некоторых бактерий с патогенным потенциалом (Synergistetes, Atopobiaceae, Prevotella 2, Howardella, Slackia). После терапии отмечается увеличение представленности важнейших продуцентов бутирата в кишечнике - бактерий рода Faecalibacterium. Таким образом, инвазия O. felineus у детей и подростков в эндемичном регионе вносит вклад в особенности микробиоты кишечника, которые сопряжены с патологией пищеварительного тракта. Результаты проведенного исследования позволили сформулировать гипотезу о вкладе таксономического разнообразия микробиоты кишечника в развитие хронических неинфекционных заболеваний на фоне описторхоза (рисунок 3). Инвазия O. felineus Модификация микробиоты кишечника* ↑Патогенный потенциал: ↑ Proteobacteria, ↑Enterobacteriaceae, ↑ Escherichia– Shigella, ↑ Bacteroides ↓ Противовоспалительный потенциал: ↓ Firmicutes: ↓ Blautia, ↓ Eubacterium hallii ↓ Lachnospiraceae FCS020 ↑ Противовоспалительный потенциал: ↑Lachnospira, ↑Ruminiclostridium 6 ↑ Eubacterium eligens, ↑Faecalitalea, ↑ Barnesiella Увеличение риска ↓ Патогенный потенциал: ↓ Proteobacteria**:↓ Enterobacteriaceae, ↓Escherichia– Shigella**, ↓ Megasphaera*** ↓Synergistetes***, ↓Atopobiaceae*** ↓Prevotella 2**, ↓Howardella, ↓Slackia* ↓Tyzzerella 4 ** ↑ Противовоспалительный потенциал: ↑ Firmicutes**: ↑ Blautia**,↑Sellimonas*** ↑Faecalibacterium *** ↓Противовоспалительный потенциал: ↓Roseburia***, ↓Lachnospira**, ↓ Ruminiclostridium 6**, ↓Olsenella*** ↑ Провоспалительный и патогенный потенциал: ↑Flavonifractor*, ↑Oscillibacter*,↑Leuconostoc*, ↑Eisenbergiella***, ↑ Varibaculum*** Воспалительные заболевания гепатобилиарной системы Снижение риска Снижение риска Воспалительные заболевания кишечника Высокая интенсивность инвазии O. felineus Увеличение риска Аллергические и аутоиммунные болезни ↑ Провоспалительный потенциал: ↑ Tenericutes, Desulfovibrionaceae,Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae, Rikenellaceae RC9, Catenibacterium и Howardella, Enterorhabdus ↓ Пробиотический потенциал: ↓Bifidobacteriaceae и Bifidobacterium,Anaerostipes, Eubacterium hallii,Verrucomicrobia и Akkermansia Увеличение риска Дегельминтизация через 3 месяца Клинические эффекты микробиоты Рисунок 3 – Вклад особенностей состава микробиоты кишечника в зависимости от наличия и интенсивности инвазии O. felineus в развитии хронических неинфекционных заболеваний. Примечание – * различия значимы при сравнении с Группой 1, р < 0,05; ** различия значимы при сравнении с Группой 2, р < 0,05; *** различия значимы при сравнении с Группой 1 и Группой 2, р < 0,05. Выводы 1. Распространенность инвазии O. felineus у детей, проживающих в эндемичном регионе (Томская область), составляет 17,6 % и увеличивается с возрастом (11,6 % - в группе детей 7–10 лет, 23,8 % - у подростков). У детей и подростков преобладает низкая интенсивность инвазии (93,3 %). Инвазия O. felineus у детей ассоциирована с изменениями желчного пузыря в виде утолщения и неровности стенки, наличия эхогенного содержимого (OR = 1,9; 95 % CI 1,2–3,1; p = 0,012) и признаками перидуктального фиброза первой степени (OR = 3,1; 95 % CI 1,0–9,7; p = 0,04) по данным ультразвукового исследования. 2. Инвазия O. felineus вносит вклад в β-разнообразие кишечной микробиоты (R2 = 0,05; p = 0,01). Выявлена положительная связь между интенсивностью инвазии O. felineus, измеряемой как количество яиц на грамм стула, и α-разнообразием кишечной микробиоты. Микробиота кишечника детей, страдающих инвазией O.felineus, характеризуется увеличением представленности бактерий с патогенным потенциалом (Proteobacteria, Enterobacteriaceae, Escherichia-Shigella, Bacteroides), участвующих в продукции КЦЖК и противовоспалительным потенциалом (Lachnospira, Ruminiclostridium 6, Eubacterium eligens, Faecalitalea, Barnesiella) и снижением представленности комменсальных Firmicutes (Blautia, Eubacterium hallii, Lachnospiraceae FCS020). 3. Интенсивность инвазии O. felineus оказывает влияние на кишечную микробиоту, изменяя представленность бактерий на разных таксономических уровнях. Выявлена ассоциация с относительной численностью Desulfovibrionaceae (род Desulfovibrio), Erysipelotrichaceae, Catenibacterium, Eubacterium coprostanoligenes, Senegalimassilia, Mitsuokella, Ruminococcaceae UCG-003, Enterorhabdus, Howardella, Olsenella, Moryella,Rikenellaceae RC9 и отрицательная связь для Bifidobacteriaceae (род Bifidobacterium), Akkermansia, Anaerostipes, Eubacterium hallii, Ruminococcus gnavus, Erysipelatoclostridium, Gordonibacter в зависимости от интенсивности инвазии. 4. После дегельминтизации празиквантелом отмечается положительная клиническая динамика в виде снижения частоты болевого синдрома (92 % против 40 %, p < 0,01), тошноты (52 % против 8 %, p < 0,01), зудящих кожных высыпаний (24 % против 6 %, p < 0,01), а также значимое снижение признаков патологических изменений желчного пузыря в сравнении с исходными результатами по результатам УЗИ (28 % и 42 %, соответственно, p = 0,03). Антигельминтная терапия через три месяца приводит к изменению представленности комменсальных Firmicutes и провоспалительных Proteobacteria до значений, сопоставимых с уровнем данных таксонов у детей, не страдающих инвазией, а также к изменению численности отдельных бутират–продуцирующих (снижению Roseburia и увеличению Faecalibacterium), снижению условно–патогенных бактерий (Synergistetes, Atopobiaceae и др.) и повышению некоторых потенциально провоспалительных бактерий (Flavonifractor, Oscillibacter, Eisenbergiella, Varibaculum). Изменения в некоторых микробиотических сообществах, выявленных у пациентов с инвазией, сохраняются в течение трех месяцев после дегельминтизации (Barnesiella, Bacteroides, Faecalitalea, группы Eubacterium hallii и Eubacterium eligens, Lachnospiraceae FCS020). 5. Клинически выраженная форма описторхоза с явлениями холепатии, ассоциирована с повышением представленности потенциально патогенных Staphylococcaceae, Pasteurellaceae, Holdemanella. Микробиота пациентов с латентной формой инвазии характеризуется более высоким содержанием Methanobacteriaceae, Atopobiaceae, Senegalimassilia в сравнении с другими формами. В образцах микробиоты пациентов с симптомами гастродуоденопатии выявлено повышение представленности Lachnospiraceae UCG-001. 6. Микробиота кишечника на фоне инвазии O. felineus, характеризуется увеличением представленности бактерий, ассоциированных с воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы и кишечника. Более высокая интенсивность инвазии связана с изменениями микробиоты, сопряженными с увеличением риска развития болезней пищеварительного тракта. Дегельминтизация приводит к снижению представленности бактерий, ассоциированных с развитием заболеваний гепатобилиарной системы. Практические рекомендации 1. Для планирования объемов медицинской помощи в эндемичных по описторхозу регионах следует учитывать, что распространенность инвазии Opisthorchis felineus составляет 11,6 % в популяции детей 7–10 лет, 23,8 % - у подростков, в структуре интенсивности инвазии у детей преобладает низкая интенсивность инвазии (93,3 %). 2. В связи с недостаточной осведомленностью детского населения о механизмах передачи инвазии Opisthorchis felineus и мерах профилактики необходимы разработка и внедрение образовательных программ для детей и подростков. 3. Сформированная база данных, содержащая метагеномные данные о составе микробиоты кишечника (DOI:10.5281/zenodo.4304728) может быть использована для научно- исследовательских и клинических задач.