Турбидиметрия в стандартизации и контроле качества лекарственных средств (на примере антибиотиков группы аминогликозидов)

В работе использовали следующие ЛС на основе антибиотиков группы аминогликозидов
отечественного и зарубежного производства и стандартные образцы (СО).
Лекарственные средства на основе антибиотиков группы аминогликозидов: Гентамицин, раствор для внутривенного и внутримышечного введения 40 мг/мл, Республика Беларусь; Целестодерм-В с гарамицином (гентамицина сульфат), крем для наружного применения, 0,1%, Бельгия; Полидекса (неомицина сульфат + полимиксина В сульфат), спрей назальный, Франция; Стрептомицина сульфат, субстанция, Китай; Стрептомицина сульфат,
порошок, Россия; Тобрамицин Медисорб, капли глазные, 0,3%, Россия.
Стандартные образцы: гентамицина сульфат СО Европейской фармакопеи (Gentamicin
sulfate EP CRS batch 14, 17352 IU/vial, валидный на момент исследований); неомицина сульфат для микробиологических анализов СО Европейской фармакопеи (Neomycin sulfate for microbiological assay CRS batch 5, 19200 IU/vial, валидный на момент исследований); стрептомицина сульфат СО фармакопеи США (Streptomycin sulfate USP RS, 754 мкг/мг, валидный на момент исследований); Стрептомицина сульфат СО Европейской фармакопеи (Streptomycin sulfate EP CRS batch 4.1, 77000 IU/vial, валидный на момент исследований); тобрамицин СО фармакопеи США (Tobramycin USP RS, 954 мкг/мг, валидный на момент исследований).
Исследования проводили с применением: 1. Тест-штаммов микроорганизмов: Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Staphylococcus epidermides ATCC 12228, Bacillus pumilus NCTC 8241, Bacillus cereus var. mycoides 537, Klebsiella pneumonia ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 8739;
2. Питательных сред и компонентов питательных сред: среда для испытания антибиотиков No1, ; среда для испытания антибиотиков No3, ; среда для испытания антибиотиков No11, HiMedia Laboratories ; питательная среда No9 ГФ РФ XIV Том I ОФС.1.2.4.0010.18; триптиказо-соевый агар, Merck; пептон для бактериологических питательных сред сухой (ТУ 9385-060-39484474- 2009), ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии»; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей (ГОСТ 13805-76), ООО НПО «Порт- Петровск»; основа бактериологических питательных сред сухая (гидролизат мяса ферментативный – ГМФ), ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии»; панкреатический гидролизат рыбной муки сухой (ПГРМ) (ТУ 9283-241-78095326-2016), ФБУН

Pvt. Limited
«ГНЦ ПМБ»; панкреатический гидролизат казеина сухой (ПГК) (ТУ 9283-241-78095326-2016), ФБУН «ГНЦ ПМБ»; экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред сухой (ЭКД) (ТУ 9385-090-1437183-08), ФГУП «НПО «Микроген»; глюкоза (ГОСТ 6038-79), ФБУН «ГНЦ ПМБ»;
3. Реактивов: набор реагентов для окраски по Граму (ТУ 9389-083-70423725-2007), ООО «ЭКОлаб»; реактив для определения оксидазы (BBL Oxidase Reagent), Becton, Dickinson (BD); реактив для определения каталазы (BBL Catalase Reagent), BD; калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) (ГОСТ 4198-75), ООО «Компонент-Реактив»; натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4) (СТП ТУ КОМП 2-460-11), ООО «Компонент- Реактив»; формальдегид (Formaldehyde solution ACS reagent, 37%), Sigma Aldrich; хлороформ (Chloroform), Merck; ацетонитрил (Azetonitrile), Fisher Chemical; 2,4-динитрофторбензольный реагент (Fluoro-2,4-dinitrobenzene), Sigma Aldrich; трис(гидроксиметил)аминометановый реагент (Tris(hydroxymethyl)aminomethane), Merck; триэтиламин (Triethylamine), Merck.
В работе использовали аттестованное и поверенное оборудование: инкубаторы (Binder, Германия), термошейкер Excella E-24/24R (NEW Brunswick Scientific Co., США), стерилизатор паровой (Sterivap, Чехия), прибор для считывания зон Viewer readbiotic (PBI International S.P.A., Италия), шкаф ламинарный Jouan (Jouan SA, Франция), микроскоп стереоскопический СХ41 (Olympus Corp, Филиппины), денситометр DEN-1 (Bio San SIA, Латвия), система для фильтрации Контур П4 (Измерительный завод, Россия), хроматограф-ВЭЖХ Agilent 1200 MWD (Agilent Technologies, Щвейцария), спектрофотометр Agilent 8453 (Agilent Technologies, Щвейцария), установка для получения очищенной воды Millipore Corp., Германия), баня водяная GFL (GFL, Германия), весы лабораторные электронные МВ 210-А (Сартогосм, Россия), весы электронные аналитические XP205DR (Mettler Toledo AG, Щвейцария), рН-метр Seven Compact S220 (Mettler Toledo AG, Щвейцария), дозаторы механические одноканальные Biohit 5- 50 мкл; 100-1000 мкл; 1-5 мл (Sartorius AG, Финляндия).
Данные, полученные в результате исследований, обрабатывались с помощью программного пакета Microsoft Office – Exel, а также программного обеспечения CombiStats 6.1. Метрологические характеристики рассчитывали согласно ГФ РФ XIV изд. «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами» (ОФС.1.1.0014.15). Валидацию аналитических методик оформляли в соответствии с документацией ГФ РФ XIV изд. «Валидация аналитических методик» (ОФС.1.1.0012.15).
Определение методических подходов к разработке количественного определения антибиотиков турбидиметрическим методом (на примере антибиотиков группы
аминогликозидов), составление дизайн-проекта исследования
В рамках настоящей работы был составлен дизайн-проект исследования (рис. 1), с одной стороны отражающий предлагаемые методические подходы к количественному определению антибиотиков турбидиметрическим методом и включение метода в отечественную практику фармацевтического анализа, а с другой стороны определяющий и общую организацию диссертационного исследования, представляя собой описание всех его основных этапов:
– подготовительный (теоретический) – информационный анализ, постановка проблемы, планирование, определение основных направлений экспериментального исследования;
– основной (практический) – организация и проведение экспериментальных исследований, сбор данных;
– заключительный – обработка данных и интерпретация результатов, завершающаяся разработкой турбидиметрических методик, оценкой их применимости для анализа ЛС на основании метрологических характеристик и результатов валидационных испытаний, с подтверждением целесообразности включения материалов в ОФС для последующего введения в ГФ РФ и легитимности использования в отечественной фармакопейной практике.
Подготовительный (теоретический) этап
(информационно-аналитическое исследование научной литературы, отечественной и зарубежных фармакопей, регламентирующих условия определения антимикробной активности антибиотиков в ЛС)
Основной (практический) этап
Выбор питательной среды
Выбор тест-штамма микроорганизма
Пробоподготовка образцов (в зависимости от ЛФ образцов)
Определение соответствия критериям приемлемости (прозрачность, цветность, ростовые свойства)
Определение оптимальных условий проведения анализа (температура и время инкубации, аэрация, количество посевного материала)
Выбор математической модели метода для расчета антимикробной активности антибиотиков
(модель параллельных линий (3х3 дизайн; 2х2 дизайн); модель стандартной кривой (5х1 дизайн); определение аналитической области методики
Заключительный этап
Разработка методики
Информационно-аналитическое исследование (теоретический этап) позволило установить, что степень проявления биологической активности антибиотиков и достоверность полученных результатов зависит от условий её определения.
испытаний по количественному определению ЛС микробиологическими методами,
Оценка применимости разработанной методики для анализа ЛС на основании её метрологических характеристик и результатов валидационных испытаний. Подготовка материалов для включения в ОФС «Турбидиметрия» и ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом»
Рисунок 1 – Дизайн-проект исследования.
Среди основных параметров,
которые должны быть тщательным образом проанализированы и изучены при разработке и
проведении
можно выделить следующие: выбор тест-штамма микроорганизма; выбор питательной среды;
пробоподготовка образцов; определение условий проведения испытания. В этой связи
необходимость проведения экспериментальных исследований в данном направлении явилась
очевидной, и послужила основанием для перехода к следующему практическому этапу
исследования.

Показатель
Наименование тест-штамма микроорганизма
Культуральные свойства тест- штаммов микроорганизмов
Время появления роста тест-штаммов микроорганизмов, (ч)
МПК, мкг/мл («in vitro»)
Практический этап. Выбор тест-штамма микроорганизма. Применение турбидиметрического метода при определении антимикробной активности антибиотиков предопределяет особые требования к тест-штамму микроорганизма. Для получения достоверных и воспроизводимых результатов тест-штамм должен проявлять чувствительность к исследуемому антибиотику, а также характеризоваться достаточно интенсивным и равномерным ростом в жидкой питательной среде без образования пленки и выраженного осадка (Hewitt W., 2003 г; Kavanagh F., 1968 г.,1972 г.).
По результатам проведенных экспериментальных исследований, среди грамположительных тест-штаммов St. aureus ATCC 6538Р и St. epidermidis ATCC 12228, а также грамотрицательного тест-штамма K. pneumoniae ATCC 13883, для дальнейших исследований был выбран тест-штамм St. aureus ATCC 6538Р (табл.1). Данное решение было обусловлено рядом факторов:
– тест-штамм St. aureus ATCC 6538Р характеризуется высокой чувствительностью к антибиотикам исследуемой группы (МПК не превышала 0,8 мкг/мл), что было установлено методом серийных разведений;
– быстро и равномерно растет в разработанной жидкой питательной среде «Т», в отличие от St. epidermidis ATCC 12228;
– так как некоторые аминогликозидные антибиотики часто используют в комбинированных препаратах, содержащих в своем составе второй антибиотик, имеющий направленное действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов, целесообразно в качестве тест-штамма использовать грамположительный тест-микроорганизм (каким является St. aureus ATCC 6538Р) для устранения перекрестного влияния на рост и размножение тест- штамма со стороны второго антибиотика и получения достоверных данных по определению активности анализируемого аминогликозидного антибиотика.
Таблица 1 – Результаты экспериментальных исследований по выбору тест-штамма микрооргнизма.
1 2 34567
St. aureus ATCC 6538Р St. epidermidis ATCC 12228
K. pneumoniae ATCC 13883
Равномерное помутнение среды
Равномерное помутнение среды
Равномерное помутнение среды
4,8±0,1 0,2 5,6±0,1 0,1 4,7±0,1 0,4
0,8 0,8 0,4 0,8 0,4 0,1 1,6 0,8 0,8
Разработка питательной среды (конструирование состава и определение технологии приготовления) с учетом требований, предъявляемых к питательным средам для турбидиметрии. Перед началом исследования нами были сформулированы требования,
Гентамицина сульфат
Стрептомицина сульфат
Неомицина сульфат
Тобрамицин
которым должна удовлетворять питательная среда, предназначенная для культивирования тест- штаммов микроорганизмов при количественном определении антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом. Жидкая питательная среда должна:
).
ыла изучена возможность использования следующих белковых гидролизатов: пептон ферментативный (ПФ); гидролизат казеина панкреатический (ПГК); гидролизат рыбной муки панкреатический (ПГРМ).
Таким образом, для дальнейших исследований были приготовлены экспериментальные серии питательных сред следующего состава:
до желтой
– обеспечивать хорошие условия для роста микроорганизмов;
– являться прозрачной;
– быть не интенсивно окрашенной (предпочтительно иметь цветность от светло-желтой
На первом этапе конструирования жидкой питательной среды для турбидиметрии была
проведена работа по выбору белковой основы, определяющей эффективность и качество
питательных сред. Б
белковый гидролизат
(один из трех, обозначенных выше)
ГМФ
(дополнительный источник питательных веществ)
дрожжевой экстракт
– 6 г/л;
– 1,5 г/л;
– 1,5 г/л;
(ростостимулирующая добавка, источник витаминов, макро- и микроэлементов)
натрий фосфорнокислый 2-замещеный
калий фосфорнокислый 1-замещенный
хлорид натрия
Для всех вариантов питательных сред устанавливали рН в диапазоне 7,2 ±0,2. Приготовленные экспериментальные серии питательных сред удовлетворяли
требованию по показателю «цветность» и имели окраску от светло-желтой до желтой. Вместе с тем, питательная среда на основе ПФ имела выраженный осадок, что не позволило нам использовать ее в дальнейшем.
Оставшиеся варианты экспериментальных серий питательных сред: первый на основе ПГК+ГМФ и второй на основе ПГРМ+ГМФ оценивали по чувствительности и времени инкубации до появления видимого роста изучаемых тест-штаммов микроорганизмов. Оба варианта питательных сред полностью отвечали критериям пригодности по биологическим показателям и характеризовались максимальной чувствительностью (разведение 10-7) в отношении использованных тест-штаммов микроорганизмов. Вместе с тем, видимый рост тест- штамма микроорганизма S. aureus ATCC 6538 P в жидкой экспериментальной среде первого варианта ПГК+ГМФ появлялся через 5,2±0,1 ч, в то время как при использовании комбинации ПГРМ+ГМФ через 6,1±0,1 ч. Это может быть связано с питательными потребностями данного тест-штамма микроорганизма, для которого обязательным является наличие в питательной среде «незаменимой» аминокислоты – триптофана (Поляк М.С. 2008 г).
Исходя из полученных результатов, подкрепленных литературными данными о питательной ценности гидролизатов казеина (сбалансированный состав «незаменимых» аминокислот, таких как триптофан, метионин и др.) (Курбанова М.Г. 2012 г.), и того обстоятельства, что в качестве тест-штамма микроорганизма при определении антимикробной активности антибиотиков часто используются штаммы микроорганизма S. aureus, поэтому учитывая его особенные питательные потребности, для дальнейших исследований был выбран
– 3,68 г/л; – 1,32 г/л; – 3,5 г/л

вариант питательной среды, включающий в качестве белковой основы комбинацию ПГК+ГМФ. В качестве источника углеводов, выполняющих функцию энергообеспечения, в разрабатываемую жидкую питательную среду была включена глюкоза (1,0 г/л).
Для получения качественных и стабильных по составу питательных сред необходимо соблюдать в процессе их приготовления определенные технологические приемы (последовательность внесения ингредиентов, способы очистки и осветления среды, способы стерилизации и т.д.). Жидкую питательную среду для культивирования тест-штаммов микроорганизмов при определении антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом готовили следующим образом: взвешивали все ингредиенты, смешивали и доводили водой очищенной до 1 л, полученный раствор нагревали до полного растворения ингредиентов и устанавливали рН 7,2±0,2. Для достижения прозрачности жидкую питательную среду фильтровали, решая одновременно таким приемом и другую технологическую задачу – осветление питательной среды. Готовую среду разливали в 0,25 л бутылки по 100,0±10,0 мл и стерилизовали в автоклаве при температуре 121 °С и давлении 0,11±0,01 МПа в течение 15 мин.
Сравнительную оценку качества питательных сред для культивирования микроорганизмов при количественном определении антибиотиков турбидиметрическим методом (применяемых в настоящее время в фармакопейном анализе и разработанной питательной среды) по физико-химическим
Таблица 2 – Некоторые физико-химические показатели жидких питательных сред.
проводили
(рН, содержание аминного азота,
хлоридов) и биологическим показателям (чувствительность, характер роста и стабильность
морфологических признаков микроорганизмов).
В качестве среды сравнения использовали
среду для антибиотиков No3, производства HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия). Пропись
данной среды полностью соответствует среде No3, рекомендованной для турбидиметрического
анализа фармакопеями США и Индии.
Питательная среда Физико-химические показатели
No3 HIMEDIA
Разработанная питательная среда
Внешний вид
рН «Натрия хлорид», % «Аминный азот»,%
Прозрачная Светло-желтого цвета 7,4±0,2
0,35 0,046
Прозрачная Светло-желтого цвета 7,2±0,2
0,48 0,060
При сравнении физико-химических показателей (табл. 2), видно, что рН исследуемых сред находится в оптимальном для роста и размножения широкого спектра микроорганизмов диапазоне – рН 7,0-7,5. Разработанная питательная среда не уступала среде сравнения и по содержанию аминного азота, а, следовательно, и по питательной ценности. Особо необходимо отметить прозрачность и низкую интенсивность окраски разработанной питательной среды, которые являются одними из важных критериев (требований), предъявляемых к питательным средам, используемым для турбидиметрического анализа, с целью получения более корректных экспериментальных данных (рис. 2).
Примечание: 1.
Рисунок 2 – Рост тест-штаммов микроорганизмов в разработанной питательной среде.
На следующем этапе были изучены биологические показатели разработанной питательной среды и контрольной среды. Для этой цели были выбраны грамположительные и грамотрицательные тест-микроорганизмы, характеризующиеся чувствительностью к основным группам антибиотиков.
Таблица 3 – Изучение некоторых биологических показателей качества изучаемых питательных сред для турбидиметрии.
K. pneumoniae ATCC 13883; 2. E. coli ATCC 8739; 3. S. aureus ATCC 6538Р; 4. контроль
(неинокулированная разработанная питательная среда).
Наименование тест-штамма
S. aureus ATCC 6538Р
E. coli ATCC 8739
Наименование биологического показателя Чувствительность
Чувствительность
Чувствительность
Жидкие питательные среды
No3 HIMEDIA
10-7
10-7
10-7
Разработанная питательная среда
10-7
10-7
10-7
Стабильность основных свойств
Равномерное помутнение среды. Грамположительные кокки в виде гроздей. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны.
Равномерное помутнение среды. Грамположительные кокки в виде гроздей. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны.
Стабильность основных свойств
Равномерное помутнение среды. Грамотрицательные палочки. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны.
Равномерное помутнение среды. Грамотрицательные палочки. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны.
K. pneumoniae
ATCC 13883
Стабильность основных свойств
Равномерное помутнение среды. Грамотрицательные палочки. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны.
Равномерное помутнение среды. Грамотрицательные палочки. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны.
Данные представленные в таблице 3, свидетельствуют об оптимальном составе среды, так как культуральные, морфологические, тинкториальные и биохимические свойства тест- штаммов, выращенных на разработанной питательной среде, были типичными и не отличались от свойств этих же тест-микроорганизмов, культивированных на среде сравнения. В
равномерный рост тест-штаммов S. без образования пленки и осадка (рис. 2).
Таким образом, проведенные исследования показывают, что разработанная жидкая питательная среда может применяться для культивирования микроорганизмов, используемых в качестве тест-штаммов при количественном определении антибиотиков в лекарственных
разработанной жидкой питательной среде наблюдался
aureus, K. pneumoniae и E. coli
средствах турбидиметрическим методом. Разработанная питательная среда получила название – «жидкая питательная среда «Т».
Установление оптимальных условий выполнения методики количественного определения антибиотиков группы аминогликозидов
Основные условия выполнения пробоподготовки. Условия пробоподготовки определяются исходя из физико-химических свойств фармацевтической субстанции, входящей в состав ЛС, и лекарственной формы испытуемого препарата. Антибиотики группы аминогликозидов хорошо растворяются в водных растворителях (Навашин С.М. 1977 г.), поэтому выбор растворителя, необходимого для приготовления растворов стандартного и испытуемого образцов, определяется, прежде всего, уровнем рН. Было установлено, что для
создания среды, в которой одновременно возможно обеспечить оптимальные условия, как для
проявления антимикробной активности аминогликозидных антибиотиков (лучше проявляется
активность в интервале рН 7,2 – 7,6)
(Навашин С.М. 1977 г.; Topolyan A.P. 2016 г.)
, так и для
роста тест-микроорганизма (физиологически оптимальное значение для St. aureus соответствует
рН 7,0 – 7,5) (Аристовский В.М. 1949 г.), целесообразно использование буферного раствора (рН
7,8-8,0), рекомендованного ГФ РФ в качестве растворителя при определении
антибактериальной активности антибиотиков группы аминогликозидов. После добавления к
жидкой питательной среде «Т» раствора антибиотика, где в качестве растворителя
использовался буферный раствор (рН 7,8-8,0), уровень рН соответствовал установленному
оптимальному интервалу и находился в диапазоне рН=7,4±0,1. Для большинства ЛФ
антибиотиков дополнительная пробоподготовка не требуется. Однако для анализа ЛС в виде
мазей необходимо предварительно выделить фармацевтическую субстанцию антибиотика из
мазевой основы. В рамках диссертационного исследования нами было проведено
количественное определение антимикробной активности в лекарственном препарате
Целестодерм В с гарамицином (крем для наружного применения), изготовленный из
фармацевтической субстанции гентамицина сульфата (действующее вещество) и отработана
методика приготовления раствора гарамицина состоящая из следующих этапов: растворение
мазевой основы в органическом растворителе (антибиотики группы аминогликозидов не
растворимы в органических растворителях) и экстракция действующего вещества буферным
раствором (рН 7,8-8,0). Полученный раствор используют в дальнейшем при количественном
определении действующего вещества в ЛП.
Определение оптимальных условий проведения анализа. Температура инкубации при выполнении турбидиметрического анализа определяется, прежде всего, температурным оптимумом выбранного тест-штамма микроорганизма (для St. aureus составляет 35-37°С) (Аристовский В.М. 1949 г.). Еще одним важным параметром (условием) инкубации, который целесообразно учитывать и применять при проведении турбидиметрического анализа аминогликозидов – является использование термостатируемого шейкера, обеспечивающего встряхивание или вращение пробирок.
Оценку влияния температуры инкубации и аэрации на интенсивность размножения клеток тест-штамма микроорганизма
Оптическую плотность бактериальной суспензии измеряли Agilent 8453 при длине волны 530 нм. Оптическая плотность, измеренная в видимом диапазоне, отражает концентрацию клеток тест-штамма микроорганизма в суспензии (Уткин Д.В. 2014 г). Более высокие значения оптической
St. aureus ATCC 6538Р, проводили на основании
измерения оптической плотности бактериальной суспензии после культивирования в жидкой
питательной среде «Т» в течение 4 ч.
с помощью спектрофотометра

плотности в пробирках с жидкой питательной средой свидетельствуют о более высокой
концентрации микробных клеток тест-штамма микроорганизма в данной микробной суспензии,
что позволяет сделать вывод о более благоприятных условиях для культивирования
микроорганизма.
Результаты инкубации
условия для роста, так как средние значения оптической плотности бактериальной популяции
были в 1,5 раза выше, чем при температуре 32,5±2,5°С (рис. 3 А).
Примечание: * – статистически достоверно; 1, 2, 3 – номер повторности.
Рисунок 3 – Сравнительный анализ влияния температуры инкубации (А) и аэрации (Б) на концентрацию клеток тест-штамма микроорганизма St. aureus ATCC 6538Р.
Сравнительный анализ показал также более высокие (в 1,7 раза) средние значения оптической плотности бактериальной популяции при выращивании в аэрируемой питательной среде в течение 4 ч, что свидетельствует о более благоприятных условиях (рис.3.Б). Статистическая обработка результатов подтвердила значимость различий (tрасч = 122 > tтабл = 2,78). Полученные данные можно объяснить тем, что аэрируемые культуры характеризуются более интенсивным обменом веществ и скоростью размножения.
ыли проведены исследования по изучению кинетики роста бактериальной популяции тест-штамма
наиболее благоприятной для определения антибактериальной активности (Ланчини Д. 1985 г.; Лысак В.В. 2007 г.).
Для установления аналитической области турбидиметрических методик была проведена серия предварительных определений с использованием стандартных образцов в широком диапазоне концентраций. Установлено, что линейная зависимость величины оптической плотности взвеси тест-штамма от концентрации антибиотика наблюдалась в диапазоне концентраций: для стрептомицина сульфата от 3 МЕ/мл до 9 МЕ/мл; для гентамицина сульфата от 0,5 МЕ/мл до 1,6 МЕ/мл; для неомицина сульфата от 1,2 МЕ/мл до 3,7 МЕ/мл; для тобрамицина от 0,8 МЕ/мл до 2,5 МЕ/мл (рис. 4).
St. aureus ATCC 6538Р при двух температурных режимах
показывают, что температура инкубации соответствующая 36
±1°С обеспечивала лучшие
Продолжительность турбидиметрического анализа находится в прямой зависимости от
времени затраченного на инкубацию тест-микроорганизма. Б
жидкой питательной среде «Т» в условиях аэрации при температуре 36
период культивирования тест-штамма не должен превышать 5 ч, т.к. именно этот временной
St. aureus ATCC 6538Р в
±1°С
. Установлено, что
интервал соответствует логарифмической фазе,
Рисунок 4 – Результаты определения линейной зависимости оптической плотности бактериальной суспензии от логарифма концентрации стандартного образца.
Разработка методик количественного определения антибиотиков группы аминогликозидов в лекарственных средствах турбидиметрическим методом
Анализ всех полученных экспериментальных данных позволил установить оптимальные условия проведения анализа антибиотиков группы аминогликозидов и использовать их при последующей разработке методик количественного определения этой группы ЛС турбидиметрическим методом (табл. 4).
Таблица 4 – Оптимальные условия анализа при количественном определении антибиотиков группы аминогликозидов турбидиметрическим методом.
Параметр
Тест-микроорганизм
Питательная среда
Пробоподготовка (растворитель) Аналитическая область методики (МЕ/мл) Математическая модель метода для расчета антимикробной активности
Условия инкубации Посевная доза*(мл) Время инкубации (ч)
Фармацевтическая субстанция Стрептомицина Гентамицина Неомицина
сульфат сульфат сульфат
St. aureus ATCC 6538Р Жидкая питательная среда «Т» Буферный раствор (рН 7,8-8,0)
3,0-9,0 0,5-1,6 1,2-3,7 Модель параллельных линий
(3х3 дизайн) 36±1°С; 125 об/мин
Тобрамицин
0,8-2,5
1 1 2 1 4-5
Примечание: посевная доза* – количество стандартизованной суспензии тест-штамма микроорганизма (2,7±0,1 по МакФарланду) вносимое в каждые 100 мл питательной среды.
В таблице 4 представлены условия, обеспечивающие достижение требуемого результата при разработке методики и ее выполнении (на примере наиболее широко используемых фармацевтических субстанций антибиотиков группы аминогликозидов).
В основу турбидиметрических методик количественного определения антибиотиков группы аминогликозидов был положен разработанный общий алгоритм проведения испытания.

1 Приготовление растворителя.
Для приготовления основных и рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов используют буферный раствор (рН 7,8-8,0) следующего состава, г/л:
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный
Калий фосфорнокислый 1-замещенный
Вода очищенная
2 Приготовление растворов испытуемого и стандартного образцов.
Для проведения испытания готовят основные растворы испытуемого и стандартного
образцов. Берут точную навеску (или объем (мл), при анализе ЛП в жидкой ЛФ) испытуемого образца и растворяют в мерной колбе, используя буферный раствор (рН 7,8-8,0). При использовании СО EP CRS, активность которых выражается в МЕ/vial (МЕ/флакон), для приготовления основных растворов используют содержимое целого флакона. При использовании СО USP RS, активность которых выражается в мкг/мг, берут навески.
Из основных растворов испытуемого и стандартного образцов путем разведения готовят рабочие растворы испытуемого образца Т1, Т2, Т3 необходимой концентрации и рабочие растворы стандартного образца С1, С2, С3 необходимой концентрации (малая, средняя и большая дозы антибиотика), исходя из установленной для каждого антибиотика аналитической области методики.
3 Питательная среда.
Для определения антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом используют жидкую питательную среду «Т».
4 Приготовление посевного материала.
Тест-штамм S. aureus ATCC 6538 P инкубируют в жидкой питательной среде «Т» при 36±1 °С в течение 16-18 ч. Далее стандартизуют культуру для достижения мутности суспензии 2,7±0,1 McF. Полученную суспензию используют в качестве посевного материала. На каждые 100 мл жидкой питательной среды прибавляют 1 мл посевного материала (для гентамицина сульфата, стрептомицина сульфата и тобрамицина), или 2 мл посевного материала для неомицина сульфата.
5 Процедура испытания.
1мл рабочего раствора испытуемого образца с соответствующей приблизительной концентрацией или 1мл рабочего раствора стандартного образца с соответствующей концентрацией вносят в пробирку объемом 20 мл и добавляют 9 мл инокулированной жидкой питательной среды «Т». Каждая концентрация (малая, средняя и большая дозы антибиотика) испытуемого и стандартного образца исследуется не менее чем в трех параллельных пробирках. Все используемые пробирки должны иметь одинаковые параметры (толщина стенки, диаметр, длина).
Для контроля роста тест-штамма микроорганизма S. aureus ATCC 6538P в условиях без добавления антибиотика готовят контрольные пробирки (не менее двух, содержащие 9 мл инокулированной питательной среды «Т» и 1 мл буферного раствора (рН 7,8-8,0).
Все пробирки, содержащие рабочие растворы стандартного образца, содержащие рабочие растворы испытуемого образца, а также контрольные пробирки инкубируют при 36±1 °С в условиях аэрации в течение 4-5 ч.
Схематично этапы проведения испытания при определении антимикробной активности антибиотиков группы аминогликозидов турбидиметрическим методом отражены на рисунке 5.
10,99 0,68 до 1 л

Стандартный образец Испытуемый образец
С1 С2 С3 T1 T2 T3
S.aureus ATCC 6538P
Шейкер-инкубатор (4-5 ч)
Рисунок 5 – Схема проведения испытания при определении антимикробной активности антибиотиков группы аминогликозидов турбидиметрическим методом.
После завершения процесса инкубации размножение микроорганизмов останавливают добавлением 0,5 мл 12 %-ного раствора формальдегида в каждую из пробирок, в том числе с контролями. Оптическую плотность взвеси тест-штамма микроорганизма S. aureus ATCC 6538P во всех пробирках определяют при длине волны 530 нм, используя в качестве раствора сравнения 9 мл стерильной питательной среды «Т» и 1 мл буферного раствора, рН 7,8-8,0.
6 Расчет антимикробной активности.
Расчет антимикробной активности основан на линейной зависимости степени угнетения роста бактериальной популяции от логарифма концентрации антибиотика. Эту связь отражает уравнение линейной регрессии:
y=a+b*x,
где a – свободный член линейной регрессии;
b – угловой коэффициент линейной регрессии;
x – логарифм концентрации (ГФ РФ XIV изд.).
Определение антимикробной активности при использовании 3х3 модели параллельных
линий проводят путем сравнения линий дозозависимости стандартного и испытуемого образцов. После измерения оптической плотности взвеси тест-штамма микроорганизма S. aureus ATCC 6538P для расчета антимикробной активности используют валидированное ПО (например CombiStats) или рассчитывают по формулам самостоятельно.
Математическую и статистическую обработку результатов осуществляют с применением дисперсионного анализа в соответствии с существующими рекомендациями (ГФ РФ XIV изд.).
На следующем этапе была проведена оценка применимости турбидиметрических методик для анализа ЛС в различных ЛФ на основании метрологических характеристик. Статистическая обработка результатов анализов разработанными методиками и фармакопейными методиками представлена в таблице 5.
Вычисление антимикробной активности

Таблица 5 – Метрологические характеристики количественного определения действующего вещества в ЛС турбидиметрическим методом и фармакопейным методом.
No Действующее вещество в f Χср Sx S t(95%) ΔX Ɛср, % п/п составе ЛС
1 2 3456789 турбидиметрический
1
3
5
Стрептомицина сульфат, субстанция
Стрептомицина сульфат, порошок
0,86 2,57 0,90 0,91
диффузия в агар
1,18 2,57 1,24 1,25
турбидиметрический
0,37 2,57 0,39 0,39
диффузия в агар
0,336 0,80 2,57 0,84 0,84
турбидиметрический
0,36 0,89 2,57 0,94 0,96
диффузия в агар
1,02 2,64 2,57 2,61 2,72
турбидиметрический
0,60 1,47 2,57 1,54 1,56
диффузия в агар
0,76 1,86 2,57 1,95 2,02
турбидиметрический
0,25 0,61 2,57 0,64 0,65
диффузия в агар
0,7 1,72 2,57 1,81 1,86
турбидиметрический
0,40 0,97 2,57 1,02 1,03
ВЭЖХ
0,16 0,27 4,3 0,68 0,7
5
5
98,94 0,35
98,89 0,48
100,19 0,15
Гентамицина сульфат, 5 раствор
100,89
97,74 96,06
98,56
96,53
98,16 97,12
98,51
97,07
Гентамицина сульфат, крем
Неомицина сульфат, спрей
Тобрамицин, капли глазные
5
5 5
2
Данные свидетельствуют о сопоставимости результатов определения фармакопейными и турбидиметрическим методами. Относительная ошибка определения для турбидиметрического метода с 95% вероятностью не превышала 1,56%. При этом турбидиметрические методики оказались более точными по сравнению с методиками на основе метода диффузии в агар.
Валидация методик количественного определения антибиотиков группы аминогликозидов в ЛС турбидиметрическим методом. Подготовка материалов для включения в проект ОФС «Турбидиметрия» и проект ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом»
Для подтверждения применимости турбидиметрического метода было выполнено также валидационное исследование с обработкой данных и оценкой валидационных параметров, позволяющих охарактеризовать пригодность разработанных методик количественного определения антибиотиков группы аминогликозидов в ЛС. Методики количественного определения активных компонентов ЛС должны соответствовать таким параметрам валидации как: «специфичность», «линейность», «прецизионность», «правильность».
Специфичность, как способность методики однозначно оценивать определяемое вещество, была доказана использованием высокочувствительного к воздействию антибиотиков группы аминогликозидов тест-штамма микроорганизма St.aureus ATCC 6538P. А также по результатам оценки специфической антибактериальной активности испытуемого образца в сравнении со СО. Для оценки специфичности методики устанавливали следующие критерии приемлемости:
– стандартный образец и испытуемый образец должны обладать специфической антибактериальной активностью и ингибировать рост тест-штамма микроорганизма St.aureus ATCC 6538P;
– прямая линия дозозависимости испытуемого образца должна быть параллельна прямой линии дозозависимости стандартного образца, доказывая таким образом, что разработанная методика способна однозначно оценивать определяемое действующее вещество.
В результате проведенных экспериментов по определению аналитической области применения методики устанавливали также линейную зависимость величины оптической плотности взвеси тест-штамма от концентрации антибиотика. Линейность считали доказанной, когда значение коэффициента детерминации линейной регрессии (R2) составляло не менее 0,98.
Прецизионность методик оценивали на двух уровнях: повторяемость (сходимость) и внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность.
Правильность аналитической методики характеризуется близостью результатов испытаний, полученных с помощью валидируемой методики, к истинному значению. В соответствии с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» правильность разработанных методик оценивали в сравнении с образцовыми методиками (правильность которых установлена) на основе фармакопейных методов – диффузии в агар (для стрептомицина сульфата, гентамицина сульфата, неомицина сульфата) и ВЭЖХ (для тобрамицина) с использованием критерия Стьюдента. Фармакопейными методами были установлены значения количественного содержания действующего вещества в каждом ЛС, принятые за истинные.
Результаты валидационных исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6 – Результаты валидационной оценки турбидиметрических методик.
Параметр Критерий Результат приемлемости
Специфичность
ИО и СО обладают специфической антибактериально й активностью
да
да
да
да
да
да
прямые линии дозозависимости СО и ИО параллельны
да
да
да
да
да
да
Линейность R2≥0,98 R2=0,99 R2=0,99 R2=0,99 Сходимость CV≤5% 0,87 0,37 0,91
R2=0,99 R2=0,99 R2=0,99 1,49 0,62 0,98 1,37 0,16 0,15 3,01 3,14 3,04
Воспроизводи- мость
Правильность
CV<10 % Fнабл< Fкрит , (%) tнабл< tкрит 0,02 0,12 0,29 1,90 1,10 1,64 Fкрит (5;5) = 5,05 100,05 99,30 0,08 1,91 tкрит =2,23 101,74 1,55 102,00 2,10 tкрит=2,44 101,06 1,40 101,48 2,33 tкрит=2,36 Таким образом, полученные в ходе проведения валидационных исследований данные свидетельствуют, что разработанные турбидиметрические методики отвечают заданным критериям приемлемости и пригодны для использования в фармацевтическом анализе. Результатом проведенных исследований по разработке методик определения антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом и валидационных испытаний стало оформление двух проектов ОФС «Турбидиметрия» и ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом», в которых определена область применения турбидиметрического метода, а также представлены условия и общая схема проведения испытания при определении антимикробной активности антибиотиков с использованием турбидиметрического метода. прецизионность Стрептомицина сульфат, субстанция Стрептомицина сульфат, порошок Гентамицина сульфат, раствор Гентамицина сульфат, крем Неомицина сульфат, спрей назальный Тобрамицин, капли глазные ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. Проведен сравнительный анализ методов, рекомендованных отечественной и зарубежной нормативной документацией для количественного определения антибиотиков в лекарственных средствах и показана необходимость разработки турбидиметрических методик и внедрения их в отечественную практику фармацевтического анализа. 2. Составлен дизайн-проект исследования и определены методические подходы к проведению исследований по включению турбидиметрического метода количественного определения антибиотиков в практику отечественного фармакопейного анализа, заключающиеся: в тщательной теоретической проработке вопроса исследования; в определении направлений практического (экспериментального) этапа; в установлении методических особенностей проведения анализа; в разработке турбидиметричеких методик, оценке их применимости и подтверждения легитимности введения в ГФ РФ. 3. Разработан оригинальный состав жидкой питательной среды на основе отечественных компонентов для культивирования тест-штаммов микроорганизмов при определении антимикробной активности лекарственных средств турбидиметрическим методом. Определены технологические особенности приготовления жидкой питательной среды надлежащего качества. Экспериментально подтверждено, что разработанная питательная среда соответствует требованиям, предъявляемым к питательным средам для культивирования микроорганизмов, используемым при турбидиметрическом анализе и может быть рекомендована к применению в отечественном фармацевтическом анализе. 4. Разработаны методики количественного определения лекарственных средств антибиотиков группы аминогликозидов в различных лекарственных формах турбидиметрическим методом. 5. Проведена сравнительная оценка разработанных турбидиметрических методик количественного определения антибиотиков с существующими фармакопейными методиками на основании метрологических характеристик. По результатам сравнительной метрологической оценки показана сопоставимость результатов количественного определения. Установлено, что турбидиметрические методики превосходят по воспроизводимости и точности методики диффузии в агар. Таким образом, можно сделать вывод о возможности использования турбидиметрического метода для оценки качества лекарственных средств антибиотиков группы аминогликозидов и целесообразности его внедрения в отечественную практику фармацевтического анализа. 6. Изучены основные валидационные характеристики и проведена валидационная оценка разработанных турбидиметрических методик по показателям: специфичность, линейность, аналитический диапазон, прецизионность, правильность. Показано, что разработанные методики отвечают заданным критериям приемлемости и пригодны для использования в фармацевтическом анализе. 7. По материалам диссертационного исследования подготовлены проекты ОФС «Турбидиметрия» и ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков турбидиметрическим методом», введение которых в действие позволит использовать метод турбидиметрического анализа в Российской Федерации, в том числе при стандартизации и оценке качества ЛС антибиотиков группы аминогликозидов.