Убиквитин-протеасомная система губок в становлении механизмов регуляции обмена железа у эукариот

Сбор экспериментального материала, эксперименты по диссоциации и реагрегации губок были проведены в соответствии с имеющимися в литературе данными. Клеточная линия Sf9 культивировалась в соответствии со стандартным протоколом. Транскриптомные данные в эксперименте по диссоциации/реагрегации губок для трех сезонов были получены стандартными методами (выделение РНК, обратная транскрипция, секвенирование на платформе Illumina Hiseq2500). Анализ и сборка транскриптомных данных (парноконцевые прочтения) были выполнены при помощи Trinity и пакетов trimmomatic v. 0.36, Rcorrector v1.0.3.1, transrate v. 1.0.3, diamond-blastx v.0.9.24.125, Transdecoder v. 5.5.0. Полноту и возможное загрязнение полученного предсказанного протеома затем проверяли с помощью BUSCO v.3. Наряду с базовой аннотацией, предоставляемой для Transdecoder, использовали Trinotate v.3.1.1, KEGG Automatic Annotation Server и пользовательский поиск blastp по белкам видов Demospongiae для расширенной аннотации. Предсказанные белки метаболизма железа и УПС были дополнительно подтверждены ручной аннотацией (анализ доменов) при помощи BLAST и Clustal-Omega 1.2.4. Одноконцевые прочтения были картированы на транскриптомную сборку с помощью bowtie2 v.2.4.1; далее экспрессию рассчитывали при помощи пакетов RSEM v1.3.3 и переводили в значения CPM. Полученные данные визуализированы с помощью пакета ComplexHeatmap v.2.6.2. Относительные скорости дивергенции аминокислотных последовательностей рассчитаны пакетом Erable. Бактериальные транскрипты были определены с использованием базы данных и пакета Phyla-AMPHORA. Протеомная часть работы была выполнена как с использованием стандартных протоколов (нативный и денатурирующий электрофорез, вестерн-блоттинг, жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией, определение ферментативной активности протеасом), так и при помощи оригинального метода нативного электрофореза для разделения ферритинов и протеасом губок и клеточной линии Sf9. Конфокальная микроскопия была выполнена на микроскопе Carl Zeis 880 Airyscan ЦКП ИБР РАН.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика метаболизма железа у губок
На основе полученных транскриптомов губок H. dujardinii и H. panacea были впервые реконструированы de novo белки биосинтеза гема у губок, гомологичные имеющимся у высших животных (Рис.1 А), а именно: ферменты его митохондриальной стадии ALAS (5-Аминолевулинатсинтаза), CPOX (Копропорфириноген-III-оксидаза), PPOX (Протопорфириноген оксидаза), FeCH (Феррохелатаза), а также ферменты цитоплазмитечкой стадии ALAD (5-Аминолевулинатдегидротаза), PBGD (Порфобилиноген деаминаза), UROS, UROD (Уропорфириноген-III-синтаза), а также продукты этого пути – нейроглобин (NGB) и андроглобин (ADGB) – предковые гем-связывающие белки. Были реконструированы de novo белки метаболизма железа, связанные с метаболизмом и транспортом железа и ответом клетки на гипоксический стресс. Чтобы оценить консервативность этих белков у эукариот, последовательности белков биосинтеза гема и глобинов губок H. dujardinii и H. panicea сравнили с соответствующими белковыми последовательностями губки A. queenslandica, аннотированный геном которой представлен в международной базе данных NCBI, и генами соответствующих белков человека. Далее были рассчитаны относительные скорости дивергенции аминокислотных последовательностей этих белков с помощью пакета программ Erable (Рис. 1Б).
Рис. 1. Биосинтез гем-связывающих глобинов у губок. А. Схема пути биосинтеза гема, NGB и ADGB в клетках губок, полученная реконструкцией белков de novo. Б. Относительные скорости дивергенции последовательностей белков биосинтеза гема и глобинов NGB и ADGB у эукариот.
7

Белки биосинтеза гема демонстрируют высокую степень гомологии с таковыми у человека (65%-85% идентичности) и низкие относительные скорости дивергенции аминокислотных последовательностей, а NGB и ADGB демонстрируют высокие скорости дивергенции аминокислотных последовательностей, низкую гомологию с соответствующими белками у человека (30%-35%) и средний уровень гомологии с NGB и ADGB губки A. queenslandica (60 и 50%, соответственно).
Таким образом, путь биосинтеза гема является консервативным у эукариот, а гены NGB и ADGB, по-видимому, являются древними предковыми генами других глобинов высших животных.
Представляет интерес вопрос об относительном уровне экспрессии генов белков обмена железа при разных физиологических состояниях губок. Для анализа показателей экспрессии белков обмена железа губки H. dujardinii были использованы транскриптомные библиотеки, полученные из образцов губок, собранных в период роста в разные сезоны (зима, январь; лето, август; осень, ноябрь) и в разных состояниях: диссоциация тела губки и агрегация клеток. Самым высоко экспрессирующимся геном пула факторов обмена железа оказался ген белка хранения железа – ферритина FTH1 (средняя экспрессия среди всех библиотек составляет 6280 CPM).
По полученным транскриптомам были предсказаны 3 изоформы ферритина у губки H. dujardinii и 2 изоформы у губки H. panicea. Анализ осветлённых гомогенатов клеток губок с помощью нативного электрофореза показал наличие комплексов ферритина с высокой молекулярной массой (~500 кДа). Комплексы ферритина обеих губок показали поглощение УФ-света с длиной волны около 360 нм (Рис. 2В) и окрашивались Берлинской лазурью (Рис. 2A-Б), что указывает на наличие в комплексах трехвалентного железа. Для подтверждения наличия ферритинов H. panicea и H. dujardinii в высокомолекулярных комплексах соответствующие полосы были вырезаны из нативного геля, окрашенного Кумасси синим без фиксации (Рис. 2Г) и проанализированы с помощью масс-спектрометрии MALDI/TOF. В этих полосах идентифицировались ферритины: ферритин H. panicea – HpF1, и ферритины H. dujardinii – HdF1a/b и HdF2. Для выявления белков, связанных в комплексе ферритина губки H. dujardinii, полосу ферритина, вырезанную из нативного геля анализировали с помощью электрофореза в 12% денатурирующем полиакриламидном геле. Окрашивание Кумасси синим выявило одну основную полосу с приблизительной молекулярной массой 20- 21 кДа и одну минорную молекулярной массой 19 кДа (Рис. 2Д). Анализ с помощью масс-спектрометрии MALDI/TOF подтвердил наличие ферритина HdF1a/b в основной полосе, а также выявил гем-связывющий белок NGB в минорной полоске геля.
Рис. 2. Ферритины губок H. panicea и H. dujardinii. А. Световая микроскопия клеток губки H. dujardinii, окрашенных Берлинской лазурью, выявляющая ионы трёхвалентного железа. Б. Ферритины клеток губок, фракционированные нативным электрофорезом в полиакриламидном геле и окрашенные Берлинской лазурью для выявления связывания трёхвалентного железа. В. Поглощение УФ-излучения при 360 нм ферритином в геле. Образцы тела губок H. panicea (1) и H. dujardinii (2), собранные летом (в августе), и образцы H. panicea (3) и H. dujardinii (4), собранные осенью (в ноябре), М – ферритин лошади (440 кДа) и тироглобулин (670 кДа). Г. Нативный 4-12% градиентный электрофорез в полиакриламидном геле грубых экстрактов клеток губок H. panicea (Н.р.) и H. dujardinii (H.d.), выявивший комплексы ферритинов. Окрашивание Кумасси синим без фиксации. Д. Анализ комплекса ферритина H. dujardinii с помощью электрофореза в нативном полиакриламидном геле и поcледующим денатурирующим 12% электрофорезом. Полоса, соответствующая ферритину отмечена стрелкой, минорная полоса соответствует NGB губки H. dujardinii. M – ферритин лошади (440 кДа) и тироглобулин (670 кДа).
В следующем опыте выясняли зависит ли экспрессия ферритинов в соматических клетках губки от сезонов и меняется ли в процессе реагрегации. Обнаружено, что у губок, собранных осенью и зимой, экспрессия изоформ ферритина HdF1a/b на уровне РНК резко снижалась в диссоциированных клетках и затем восстанавливалась в клеточных агрегатах. Экспрессия изоформы ферритина HdF2 увеличивалась в реагрегирующих клетках во все
исследованные сезоны (Рис. 3А). Содержание ферритина резко падает (в 10 раз) в процессе реагрегации клеток губок, собранных осенью (Рис. 3В), что может быть связано с активным расходованием железа в период завершения роста губки в данный сезон.
Рис. 3. Ферритины губки H. dujardinii. А-Б. Экспрессия мPНК изоформ ферритинов HdF2 и HdF1a/b в процессе реагрегации клеток губок, собранных в разные сезоны. В. Содержание ферритина в теле губки (1), диссоциированных клетках (2) и клеточных агрегатах (3), выявленное методом Вестерн-блоттинга. Ниже показано относительное содержание ферритина нормированное на содержание в пробах актина. Содержание ферритина в теле губки принято за 100%.
Для определения субклеточной локализации ферритина у губки H. dujardinii было проведено иммуногистохимическое окрашивание фиксированных препаратов клеток и ядерных фракций у губок, собранных летом (пострепродуктивный период, начала роста) и осенью (период завершения роста тела губки). Обнаружено, что ферритин имеет как цитоплазматическую локализацию (Рис. 4A, Б), так и ядерную локализацию (Рис. 4В, Г). В цитоплазме клеток ферритин находится в диффузном состоянии или компартментализован с гранулами. В ядрах клеток ферритин обнаруживается в виде гранул, которые могут колокализоваться с ядрышком. Таким образом, ферритин в клетках губок имеет цитоплазматическую и ядерную локализацию, в период начала роста тела губки (лето) ферритин имеет преимущественно ядерную локализацию.
10

Рис. 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание ферритина клеток губки H. dujardinii. Использованы поликлональные антитела кролика pAb к FTH1 для выявления ферритина (зелёный цвет) и обработка Hoechst-33342 для выявления ДНК ядер (синий цвет). A-Б. Локализация ферритина в цитоплазме клеток губок, собранных в период начала роста (лето) и в период завершения роста (осень), соответственно; В, Г, Д – Локализация ферритина в ядрах клеток губки, собранной в период начала роста (лето).
Микробные сообщества, сосуществующие с губками, по-видимому, участвуют в обмене железа в клетках губок, и их состав меняется в разные периоды жизненного цикла губок. Всего нами идентифицирован 21 класс бактерий. Установлено, что Proteobacteria являются доминирующим типом бактерий у H. dujardinii (80% всех бактериальных прочтений в транскриптомах), а самыми многочисленными классами из Proteobacteria являются Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria (74% от всех бактериальных прочтений Proteobacteria). Помимо классов Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria и Gammaproteobacteria также идентифицированы другие классы бактерий, не относящиеся к Proteobacteria, а именно классы: Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Cyanobacteria, Deinococcus-Thermus, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Planctomysetes, Spirochaetes, Thermotogae и Verrucomicrobia. Наибольшее количество прочтений среди этих классов относилось к Cyanobacteria губок, собранных летом. В транскриптоме микробиома H. dujardinii обнаружены основные представители бактериального суперсемейства ферритинов, а именно рубреритрины, негемовые ферритины, бактериоферритины и белки защиты от голодания/стационарной фазы ДНК (Dps). Идентифицированные ферритины и другие белки обмена железа бактерий относились к грамотрицательным бактериям, принадлежащим к классам Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria. Обнаруженные в губках бактерии по литературным данным являются симбионтами морских беспозвоночных. Таким образом, нами выявлены бактериальные симбионты губки H. dujardinii, участвующие в обмене железа и экспрессирующие собственные ферритины.
При анализе транскриптомов губок H. panicea и H. dujardinii и опубликованного генома A. queenslandica нами выявлены у морских губок
ортологи белков-регуляторов обмена железа высших животных. Среди них самыми консервативными являются белки IRP1/ACO и NFkB1. Убиквитин- лигаза FBLX5 является наиболее быстро дивергирующим белком обмена железа, обеспечивающим тонкую настройку регуляции гомеостаза протеома клеток.
Для выяснения особенностей УПС губок мы провели анализ экспрессии белков протеасом и их регуляторов, а также провели сравнение структурных компонентов УПС беспозвоночных, на примере губок и эволюционно удалённых от губок беспозвоночных класса Насекомых, характеризующихся широким спектром адаптивных реакций, имеющих развитую систему врождённого и адаптивного иммунитета и освоивших все экологические ниши для своего обитания.
2. Характеристика убиквитин-протеасомного комплекса губки H. dujardinii
Для оценки экспрессии компонентов УПС губки были идентифицированы последовательности субъединиц протеасом и их регуляторов на основе транскриптомов, собранных по парноконцевым прочтениям. Экспрессию генов факторов УПС сравнивали для трёх сезонов, характеризующих период роста губки (лето и осень) и период начала спермато- и оогенеза (зима), и для различных состояний губки H. dujardinii (интактное тело губки, диссоциированные клетки, клеточные агрегаты через 24 часа после диссоциации тела губки). Характерной особенностью экспрессии генов УПС на уровне мРНК является то, что в процессе реагрегации значительно возрастает экспрессия всех субъединиц 20S коровой частицы протеасом (α1- α7, β1- β7) и 19S регулятора протеасом (Rpt1-Rpt6, Rpn1-Rpn13). Наиболее выраженные изменения экспрессии для 19S регулятора наблюдаются в период начала сперматогенеза и оогенеза, а для 20S субчастицы в период роста тела губки. Интересно, что в эти же периоды жизненного цикла наблюдается значительное изменение экспрессии ядерного регулятора протеасом PA200 и важнейших транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию функций протеасом, NFkB и NRF1. Средняя же экспрессия генов УПС в клетках тела губок остается на постоянном уровне (50-100 CPM) во все исследованные периоды, что подтверждает значимость УПС для поддержания гомеостаза протеома клеток.
Для структурного анализа нативных форм протеасом губок на протеомном уровне было проведено фракционирование белков осветленных гомогенатов губок методом нативного электрофореза в 3,5% полиакриламидном геле. Для выявления форм протеасом использовали флуоресцентную метку Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS (R&D Systems, Inc., США), которая связывается с каталитическими субъединицами протеасом. В УПС губки H. dujardinii входят, как минимум, две формы протеасом – 20S и 26S (Рис. 5 А). Основной формой протеасом губки H. dujardinii является форма 20S. Выявленные формы протеасом были подтверждены методом
Вестерн- блоттинга с антителами к сумме альфа- субъединиц протеасом (Рис. 5Б, 1-4).
Рис.5. Нативный электрофорез осветлённых гомогенатов клеток губок. А. Выявление форм протеасом губки H. dujardinii при помощи флуоресцентной метки Me4BodipyFL- Ahx3Leu3VS (R&D Systems, Inc., США). 1 – клетки интактной губки, 2 – клеточные агрегаты через 24 часа после диссоциации тела губки. Б. Выявление форм протеасом при помощи Вестерн-блоттинга. 1 – клетки губки H. panicea, 2 – клетки губки H. dujardinii, 3 – клеточная линия насекомых Sf9, 4 –мозг мыши.
С помощью масс-спектрометрии были идентифицированы структурные белки и регуляторы протеасом губки H. dujardinii, а также вспомогательный фактор сегрегаза VCP/р97.Для оценки функциональной активности выявленных форм протеасом были исследованы химотрипсин- и каспазаподобная активности протеасом в процессе диссоциации и реагрегации клеток губки H. dujardinii с использованием специфических для каспазо- и химотрипсинподобных каталитических центров субстратов. Обнаружено, что в диссоциированных клетках снижается химотрипсинподобная активность протеасом (Рис. 6 А). В клеточных агрегатах химотрипсинподобная и каспазоподобная активности протеасом возрастают значительно относительно таких же показателей в клетках тела губки (Рис. 6 А, Б). Интересно, что каспазоподобная активность протеасом клеток губки повышается в процессе диссоциации в условиях инкубация осветлённых гомогенатов губки как при 10оС, так и при 37oС (Рис. 6 Б) тогда как химотрипсинподобная активность остаётся сниженной при 10oC (Рис. 6 А). По анализу химотрипсинподобной активности протеасом в нативном градиентном полиакриламидном геле (Рис. 6 В) обнаружено, что активность 20S формы протеасом значительно увеличивается при реагрегации (более, чем в 1,7 раз), в то время как добавление 3 μМ бортезомиба в период реагрегации полностью ингибирует активность протеасом. (Рис. 6Г). Химотрипсинподобной активности у 26S формы протеасом в нативном геле не было выявлено вследствие того, что эта форма у губок, по-видимому, является минорной.
Рис. 6. Активности протеасом H.dujardinii. A. Химотрипсин- подобная активность протеасом (ХПА) в клетках тела (Тк), диссоциированных клетках (Кл) и клеточных агрегатах 24 ч (24) in vitro. Б. Каспазаподобная активность протеасом губки (КПА). Пустой и закрашенные ящики показывают активность при 10oС и 37oС, соответственно. В-Г. Нативный электрофорез осветленных гомогенатов губок, инкубированный с флуорогенным субстратом Suc-LLVY-AMC. ХПА протеасом губки H. dujardinii,
измеренная по флуоресценции субстрата в геле в клетках тела (Тк), диссоциированных клетках (Кл), клеточных агрегатах 24 ч (24) и в присутствии бортезомиба (Bz).
Для установления субклеточной локализации протеасом у H. dujardinii было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание клеток губки, собранной летом, антителами к сумме альфа субъединиц, а также антителами к субъединице Rpt1 регулятора 19S протеасом. Методом конфокальной микроскопии обнаружено, что 20S протеасомы (Рис. 7, отмечены желтыми стрелками) локализуются как в ядре, так и в цитоплазме клеток. Колоколизация 20S субчастицы и 19S регулятора свидетельствует о наличии 26S/30S форм протеасом, ответственных за распознавание и гидролиз убиквитинированных белков (отмечены бирюзовыми стрелками на Рис. 7).
Рис.7. Субклеточная локализация протеасом в клетках H. dujardinii. Зеленый канал – антитела к Rpt1, красный – к сумме альфа субъединиц, синий – хроматин. Желтыми стрелками обозначена локализация 20S субчастицы, бирюзовыми – колокализация 20S и 19S субчастиц (26S/30S протеасома).
14

Для выявления особенностей функционирования протеасом губки H. panicea при изменении её бактериального симбиотического сообщества мы исследовали ХПА протеасом и содержание белков теплового шока класса 70 (HSP70), ответственных за реактивность организма в отношении стрессовых воздействий у многоклеточных.
При анализе двух морф губки H. panicea: беловато-зеленоватой, тип 1 и жёлтой, тип 2, установлено различие в наборе эндосимбионтов и содержании бактерий рода Pseudoalteromonas а именно клетки губок 1 типа содержат повышенное количество эпибионтов рода Pseudoalteromonas. Было обнаружено, что в диссоциированных клетках тела губки снижено содержание белков теплового шока HSP70 (Рис. 8) и ХПА протеасом (Табл. 1). Однако, в клетках с повышенным содержанием эпибионтов Pseudoalteromonas содержание белков HSP70 было выше, а ХПА ниже, чем в клетках типа 2 (Рис. 8; Табл. 1).
Рис. 8. Вестерн-блоттинг и диаграмма содержания белков HSP70, нормализованных на содержание актина. За 100% принято содержание HSP70 в клетках тела. Т –тело губки, К – диссоциированные клетки, 1 – диссоциированные клетки типа 1 с повышенным содержанием симбионтов Pseudoalteromonas, 2 – диссоциированные клетки типа 2.
В клетках тела губки и диссоциированных клетках с повышенным уровнем эпибионтов рода Pseudoalteromonas ХПА оказалась более чувствительна к повышению температуры инкубации по сравнению с клетками типа 2 (Табл. 1).
Возможно, что модуляция ХПА протеасом клеток при повышении температуры, а также повышенная экспрессия HSP70 в присутствии эпибионтов бактерий рода Pseudoalteromonas могут отражать различный иммунный статус клеток холодноводных морских губок H. panicea.
Таблица 1. Химотрипсинподобная активность протеасом в клетках тела и диссоциированных клетках H. panicea при разных температурах инкубации реакционной смеси.
Температура,оС
Активность в теле губки, (усл.ед/мг белка за 30 минут)
Активность в суспензии клеток, (усл.ед/мг белка за 30 минут)
Тип 1
10 2,6±0,56#
37 8,87±1,73*#
Тип 2 15,45±1,11
28,99±1,83*
Тип 1 Тип 2 0,81±0,21# 1,97±0,53
1,68±0,46* 2,21±0,39
M±SEM, n = 6; *p<0,01 по сравнению с ХПА при 10oС; #p<0,01 по сравнению с другим типом. Полученные данные свидетельствуют о наличии в клетках губок H. dujardinii и H. panicea превалирующей активной формы 20S протеасом, специализирующейся на расщеплении повреждённых белков, и ответственной за поддержание гомеостаза протеома их клеток. Являются ли выявленные нами особенности структуры и функций 20S протеасом губок характерной чертой клеток беспозвоночных? Для ответа на этот вопрос мы исследовали клетки Sf9 из яичников чешуекрылого насекомого Spodoptera frugiperda. Клетки яичников имеют особый иммунный статус для поддержания репродуктивной функции у насекомых. Для идентификации форм протеасом было осуществлено фракционирование осветленного гомогената клеток Sf9 электрофорезом в нативном полиакриламидном геле. После электрофореза гель был окрашен Кумасси синим, а полосы белков, соответствующие по молекулярной массе известным формам 20S протеасом, были вырезаны (Рис. 9А) для последующей ВЭЖХ и тандемной масс спектрометрии для установления состава белков. В результате были обнаружены последовательности всех субъединиц 20S протеасомы, а также идентифицированы шапероны протеасомного комплекса PAC1, PAC2 и два ядерных регулятора PA200 и PA28gamma (Рис. 9Б). На тепловой карте (Рис. 9B) продемонстрированы формы 20S протеасом клеток Sf9 по результатам масс-спектрометрии. Обнаружено, что клетки Sf9 обладают пулом различных форм 20S протеасом, включающим в себя формы 20S-(PAC1+PAC2), 20S-2(PAC1+PAC2), 20S-7PA28gamma, 20S-PA200, 20S- 7PA28gamma-(PAC1+PAC2), 20S-PA200-(PAC1+PAC2). Рис. 9. Протеасомы клеток Sf9 в нативном полиакриламидном геле. А. ХПА протеасом выявлена при гидролизе флуорогенного субстрата Suc-LLVY-AMC в 26S и 20S пулах протеасом. Б. Формы 20S протеасом, выявленные с помощью Вестерн-блоттинга к альфа-субъединицам протеасом. В. Тепловая карта прогнозируемого состава комплексов 20S протеасом. Таким образом, на примере клеток Sf9 выявлен уникальный, богатый по составу пул 20S протеасом насекомых, обеспечивающий гомеостаз их протеома. Для оценки эволюционной консервативности факторов УПС у многоклеточных животных аминокислотные последовательности белков субъединиц протеасом, активаторов и шаперонов (предсказанные при помощи транскриптомов и сборки de novo для губки H. dujardinii и масс- спектрометрии протеасом для клеток Sf9) были выравнены с последовательностями соответствующих белков губки A. queeslandica, плодовой мушки D. melanogaster, мыши, человека, а также между собой. Наивысшую эволюционную консервативность показали АТФ-азные субъединицы 19S регулятора – Rpt1, Rpt2, Rpt3, Rpt4, Rpt5, Rpt6, а наименьшую – шапероны 20S протеасомы (PAC2, PAC3, PAC4), регуляторы ядерных форм протеасом PA200 и PA28gamma, а также протеасомный ингибитор PI31. Данные об эволюционной консервативности, оцененные по процентной гомологии аминокислотных последовательностей, соответствуют относительным скоростям дивергенции соответствующих факторов УПС, рассчитанным на основе аминокислотных последовательностей для 28 видов эволюционно удаленных классов животных (Рис. 10). Таким образом, наибольшими скоростями дивергенции обладают шапероны 20S протеасом (PAC2, PAC3, PAC4), регулятор ядерной формы протеасомы PA200 и протеасомный ингибитор PI31, а наименьшими скоростями дивергенции обладают АТФ-азные субъединицы 19S регулятора – Rpt1, Rpt2, Rpt3, Rpt4, Rpt5, Rpt6, сегрегаза VCP и деубиквитиназа 19S регулятора Rpn11. Рис. 10. Относительные скорости диверегенции аминоксислотных последовательностей белков УПС. 3. Влияние ингибиторов протеасом и биосинтеза гема на процесс реагрегации клеток губок Для оценки вклада ключевого пути метаболизма железа, биосинтеза гема, и УПС в процессы клеточной пластичности, реализуемые у губок, были проведены эксперименты с селективным ингибитором дегидратазы 5- аминолевулиновая кислоты, ALAD, - Morphlock (Sigma-Aldrich, USA) в дозах 0,5 и 1 мкM, и ингибитором ХПА протеасом, Bortezomib (Sigma-Aldrich, USA) в дозах 1; 2.5; 5 и 10 мкM, на модели реагрегации клеток губки H. dujardinii. Рис.12. Морфологические характеристики клеточных агрегатов губки H. dujardinii при добавлении ингибитора биосинтеза гема, Morphlock, в дозах 0,5-1 мкМ и ингибитора ХПА протеасом Bortezomib в дозах 1; 2.5; 5 и 10 мкM. Масштабный отрезок – 500 микрон. Множественный факторный анализ параметров размера и формы клеточных агрегатов показал, что при разных дозах используемых ингибиторов (Рис. 13) в опытных группах достоверно меняются размер и форма агрегатов. При этом увеличиваетcя: количество маленьких агрегатов неправильной формы при добавлении 5 мкМ Bortezomib (в 4,1 раза), количество больших агрегатов неправильной формы при добавлении 1 мкМ Morphlock (в 2,7 раза), количество средних размеров агрегатов неправильной формы при добавлении 1 мкМ Bortezomib (в 2,2 раза) и при добавлении 1 мкМ Morphlock (в 3,6 раза). Наблюдается достоверное уменьшение количества маленьких шарообразных агрегатов при добавлении 0,5 мкМ Morphlock (в 3,57 раза) и при добавлении 10 мкМ Bortezomib (в 2,7 раза), а также средних размеров агрегатов правильной формы при добавлении 1 мкМ Morphlock (в 3 раза). Рис.13. Зависимость количества агрегатов разного размера (1 – большие, 2 – средние, 3- маленькие) воздействия концентраций Morphlock (верхняя панель) и Bortezomib (нижняя панель). Множественный анализ вариантов с учетом параметров размера и формы агрегатов и дозы ингибитора. Для Morphlock:Wilks lambda= 0,53989, F(8, 178)=8,0314, p=0,005, а для Bortezomib Wilks lambda= 0,25926, F(16, 298)=17,953, p=0,005. Доверительный интервал 95%. Кроме того, добавление в инкубационную среду Morphlock в дозах (0,5-1 мкМ) приводит к снижению ХПА протеасом клеточных агрегатов губки H. dujardinii. Показания измерений удельной ХПА протеасом спустя 30 минут измерений: для контроля ХПА составляла 6309±662 у.е./мг.белка, для концентрации Morphlock 0,5 μM - 2512,1±501 у.е./мг.белка, а для 1 μM Morphlock - 5095,2±551 у.е./мг.белка. Ингибитор Morphlock вызывает конверсию октомерной формы ALAD в гексамерную форму. Известно, что гексамерная форма ALAD является эндогенным ингибитором активности протеасом у млекопитающих. Возможно, что гексамерная форма ALAD, изменяя активность протеасом, оказывает модулирующее влияние на процесс морфогенеза при реагрегации клеток у губок. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о важной роли 20S протеасом в обмене железа и становлении системы контроля протеома клеток у морских губок, представителей ранних многоклеточных животных и формы от различных ингибиторов ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные в данной работе сведения о белках-регуляторах метаболизма железа и факторах УПС свидетельствуют об их функциональной взаимосвязи и древнем происхождении. Изученные молекулярные аспекты метаболизма железа (изменение уровня экспрессии ферритина, ALAD, NGB и протеасомных белков-регуляторов обмена железа), участие УПС в процессах диссоциации/реагрегации у губки H. dujardinii, а также связь этих процессов с симбиотическими сообществами губки, свидетельствуют о важной роли УПС и метаболизма железа в процессах реализации клеточной пластичности у губок, представителей базальной группы многоклеточных животных. Практическая значимость работы заключается в усовершенствовании методов нативного электрофореза для разделения и анализа комплексов ферритина и форм протеасом у беспозвоночных (губок и насекомых). Полученные данные о структуре, эволюционных особенностях и возможных функциях белков метаболизма железа и УПС у губок позволяют пролить свет на становление и роль УПС в регуляции гомеостаза клеточного протеома у предковых форм Metazoa. Аннотированные белки и транcкриптомы, выложенные в базу данных NCBI, являются вкладом в геномные и протеомные исследования животных. ВЫВОДЫ 1. Впервые de novo реконструированы белки метаболизма железа и его протеасомные белки-регуляторы у губок. Белки-участники биосинтеза гема являются наиболее эволюционно консервативными, в то время как связывающие кислород глобины (нейроглобин и андроглорбин) претерпевали значительные изменения в ходе эволюции. Ингибирование биосинтеза гема приводит к нарушению реагрегации клеток губок. 2. Ферритин является высоко экспрессирующимся белком (на транскриптомном и протеомном уровнях) у древних многоклеточных (тип Porifera). У разных видов губок представлены различные варианты генов ферритинов. Ферритин локализован в цитоплазме и ядрах клеток губок. Кроме собственных ферритинов в транксриптоме Halisarca dujardinii идентифицированы ферритины бактериальных симбионтов. 3. Впервые de novo реконструированы компоненты УПС у губок. Протеолитическая активность протеасом губок повышена у морф губок с высокой бактериальной заселенностью и связана преимущественно с формой 20S. Процесс реагрегации клеток губок сопровождается повышением экспрессии мРНК субъединиц протеасом и повышением их химотрипсин- и каспазоподобной активностей в клетках. Ингибирование ХПА протеасом приводит к нарушению реагрегации клеток губок. 4. В клетках из яичников чешуекрылого насекомого Spodoptera frugiperda (Sf9) присутствует уникальный пул 20S протеасом, ассоциированных в разных комбинациях с шаперонами PAC1 и PAC2 и активаторами PA200 и PA28- gamma. Разнообразие форм протеасом Sf9 может обеспечивать особый иммунный статус Sf9 клеток яичников. 5. Дивергенция аминокислотных последовательностей компонентов УПС в эволюции животных проходит с разной скоростью. Наивысшую эволюционную консервативность демонстрируют АТФ-азные субъединицы 19S регулятора протеасом, сегрегаза VCP/p97, а наименьшую – шапероны PAC2, PAC3, PAC4 и регуляторы PA200 и PA28-gamma. У губок отсутствует шаперон PAC1, а у чешуекрылых насекомых - шапероны PAC3 и PAC4. 6. Полученные результаты подтверждают эволюционно древнее происхождение путей метаболизм железа и УПС, и их взаимосвязь. Возникновение различных регуляторных функций протеасом обеспечило тонкую регуляцию метаболизма железа уже у губок.