Влияние доксициклина на экспрессию регуляторов нейропластичности и поведение животных в норме и условиях нейровоспаления

Животные. Исследования проводили на взрослых самцах крыс линии Вистар в
соответствии с инструкциями Минздрава России (приложение к приказу N 267 от 19 июня 2003 г.), Директивой Совета Европы (86/609/EEC) и рекомендациями комиссии по биоэтике ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”. Животные содержались в стандартных условиях вивария ИЦиГ СО РАН при температуре 22 – 24 °C, световом режиме 14С:10Т и свободном доступе к воде и корму.
Схемы введения препаратов и поведенческих тестов.
1. Исследовали влияние отдельных, а также совместных введений ДОКС и ЛПС.
Самостоятельное влияние ДОКС оценивали, вводя препарат ежедневно либо с питьевой водой (2 г/л), либо внутрибрюшинно (в/б; 25 мг/кг/мл). Получаемые при этих способах дозы были сопоставимыми, что было выяснено путем взвешивания бутылочек с антибиотиком, который готовили ежедневно. ЛПС вводили внутрибрюшинно (0.5 мг/кг) 1 раз в два дня, максимальное количество инъекций – 7. Отдельно и совместно ДОКС и
ЛПС вводили в течение 1-14 дней. Контрольные животные получали соответствующие инъекции физиологического раствора. Количество животных в группах составляло 11-12.
2. Поведение животных оценивали в общепринятых тестах. Через сутки после последнего введения в тесте ПКЛ определяли уровень тревожности и двигательную активность. Депрессивно-подобное состояние оценивали по потреблению животными сахарозы (показатель, сопоставимый с клиническим симптомом депрессии – ангедонией), а также в тесте Порсолта. В течение экспериментов животных ежедневно взвешивали. Дни поведенческих тестов в отдельных экспериментах указаны на схеме относительно дней введения препаратов:
Через сутки после окончания тестирования животных забивали быстрой декапитацией, в выделенных отделах мозга определяли уровни белков Iba-1, BDNF, Bcl-xL, MMP-9 и уровни мРНК BDNF и Bcl-xL (референсным геном служил бета-актин). В эксперименте с введением ДОКС с питьевой водой в течение 7 дней, уровни мРНК BDNF и Bcl-xL были определены в совместных исследованиях с д.б.н. Калининой Т.С.
Анализ содержания белков методом иммуноблотинга. Уровни целевых белков Iba-1, MMP-9, BDNF и Bcl-xL определяли с помощью метода Вестерн-блот, как было описано ранее (Баннова и др., 2019).
Определение уровня мРНК методом ПЦР в реальном времени. Выделение РНК проводили одностадийным гуанидин-изотиоцианатным методом. Для получения кДНК суммарную РНК инкубировали 90 мин при 42 ̊С в 20 мкл смеси, содержащей 50U ревертазы. Анализ содержания мРНК целевых генов проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием набора праймеров/зондов TaqMan® Gene Expression Assays (Rn02531967_s1 для bdnf, Rn00437783_m1 для bclxL, и Rn00667869_m1 для actb; Applied Biosystems, USA) на амплификаторе ABI VIIATM 7 (“Applied Biosystems”, USA). Уровни транскриптов рассчитывали относительно actb по методу ΔΔСt.
Статистическую обработку полученных поведенческих и нейробиологических данных проводили однофакторным и двухфакторным дисперсионным анализом с использованием программы STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., USA). Достоверность различий между группами устанавливали согласно LSD критерию Фишера и t-критерию Стьюдента. Прирост массы тела анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа
для повторных измерений. Наличие корреляционных взаимоотношений оценивали по Пирсону. Уровень значимости p < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ДОКС на прирост веса тела животных, поведение и экспрессию регуляторов нейропластичности в мозге Анализ ежедневного прироста веса тела животных в течение 15-дневного периода после введения ДОКС показал зависимое от продолжительности введения влияние антибиотика на этот показатель, подтверждаемое достоверным взаимодействием факторов ДОКС и продолжительности введения: F15,150 = 6.66, p < 0.001 (Рис.1). Прирост веса тела снижался в течение первых суток, однако в дальнейшем это снижение быстро нормализовалось и, начиная с 13 дня, ДОКС достоверно (p < 0.05) усиливал набор веса тела по сравнению с контрольными животными. Одним из традиционных оценочных показателей тревожности грызунов в тесте ПКЛ является количество входов в открытые рукава лабиринта. Непродолжительное введение ДОКС с питьевой водой вместе с угнетением прироста веса тела увеличивало тревожность животных, что проявлялось достоверным снижением числа входов в открытые рукава у крыс, получавших антибиотик в течение 4 дней по сравнению с контрольными животными: Student t-test (21) = 3.03; p < 0.01 (Рис.2). Этот поведенческий эффект также оказался транзиторным, и после более длительного введения ДОКС, в течение 14 дней, животные достоверно не отличались от контрольных крыс по числу входов в открытые рукава лабиринта: Student t-test (22) = 1.002; p > 0.1. Результаты более продолжительного введения согласуются c наблюдениями других авторов, также не обнаруживших изменений в тревожности животных (мышей) в тестах открытого поля, социального взаимодействия или закапывания шариков (Paris et al., 2014) после введения им ДОКС в дозе 100 мг/кг в течение 7 или 14 дней.
Тест принудительного плавания или тест Порсолта является наиболее используемым тестом для оценки про- и антидепрессивных эффектов препаратов и воздействий. В качестве ключевого оценочного показателя депрессивно-подобного состояния используется общая продолжительность пассивного поведения животных в течение 5- минутного тестового периода. В проведенных исследованиях введение ДОКС как однократно, так и в течение 7 и 14 дней не оказывало значительного влияния на общую продолжительность замирания в течение 5-минутного теста (Рис.3-4). Однако, хотя в наших экспериментах животные после введения ДОКС не отличались от контрольных крыс по продолжительности замирания в тесте Порсолта, анализ других видов поведения
Рис.1. Ежедневный прирост веса тела животных в течение двухнедельного внутрибрюшинного введения ДОКС.
* ‒ p < 0.05 по сравнению с контролем. Рис.2. Процент входов в открытые рукава ПКЛ после введения ДОКС в течение 4 (с водой) и 14 дней (в/б). * ‒ p < 0.05 по сравнению с соответствующим контролем. в этом тесте выявил после введения антибиотика увеличение продолжительности активного плавания, особенно заметное в эксперименте после введения ДОКС с питьевой водой в течение 7 дней: Student t-test (21) = 2.08; p < 0.05 (Рис.4). Активация этого специфического для теста Порсолта типа поведения, характеризующегося активным «царапаньем» о стенки сосуда с водой в попытках из него выбраться, рассматривается некоторыми исследователями как свидетельство антидепрессивно-подобного эффекта. Эти результаты о потенциальной способности 9 Рис.3. Продолжительность (в процентах к контролю) замирания животных в тесте Порсолта после в/б введения ДОКС однократно и в течение 14 дней. Рис.4. Продолжительность (в процентах к контролю) отдельных видов поведения животных в тесте Порсолта после введения ДОКС (с водой) в течение 7 дней. * ‒ p < 0.05 по сравнению с контролем. ДОКС оказывать антидепрессивно-подобное действие согласуются с данными Mello с соавторами (2013), наблюдавшими снижение продолжительности замирания животных в тесте Порсолта даже после однократной внутрибрюшинной инъекции ДОКС в дозе 25 или 50 мг/кг (Mello et al., 2013). С целью прояснения механизмов наблюдаемого после ДОКС повышения поведенческой активности, у животных после введения антибиотика в течение 7 дней в гиппокампе и фронтальной коре были промеряны уровни мРНК и белков BDNF и Bсl-xL, являющихся важными регуляторами нейропластичности и вовлекаемых в контроль поведения в тесте Порсолта. По сравнению с контрольными животными, введение ДОКС в течение 7 дней не повлияло на уровни белка BDNF ни в гиппокампе, ни во фронтальной коре, однако оказало достоверное повышающее влияние на уровень экспрессии мРНК Bcl-xL в гиппокампе: Student t-test (11) = 2.75; p < 0.05 (Рис.5). Небольшое увеличение уровня белка Bcl-xL в этой структуре, наблюдаемое после ДОКС, не достигало, однако, статистического уровня значимости. Между продолжительностью активного плавания в тесте Порсолта и уровнем белка Bcl-xL в гиппокампе обнаружена достоверная положительная корреляция (Рис.6; r = 0.71, p < 0.01, n = 15), что может свидетельствовать о вовлечении повышения экспрессии антиапоптозного белка в транзиторное увеличение после ДОКС двигательной активности в тесте Порсолта и умеренное антидепрессивное действие антибиотика. Предположение о связи этих двух событий согласуется с результатами работы Jiang с соавторами (2014), в которой ослабление индуцированного хроническим стрессом депрессивно-подробного поведения после введения антидепрессантов сопровождалось повышением уровня белка Bcl-xL в гиппокампе (Jiang et al., 2014). Повышение уровня белка Bcl-xL в гиппокампе может иметь адаптивное значение, увеличивая, например, выживаемость клеток в условиях стресса принудительного плавания и, тем самым, устойчивость к развитию индуцируемой стрессом депрессии (Shishkina et al., 2010; Dygalo et al., 2012). Результаты этой части работы свидетельствуют, что ДОКС при отдельном введении может умеренно влиять на регуляторы нейропластичности и поведение нормальных животных. Эти эффекты антибиотика наблюдались, как правило, после непродолжительных введений и отсутствовали после более длительных воздействий. Рис.5. Уровни (в процентах к контролю) мРНК и белков BDNF и Bcl-xL в гиппокампе и фронтальной коре после введения ДОКС в течение 7 дней. * ‒ p < 0.05 по сравнению с контролем. Рис.6. Корреляция между уровнем анти- апоптозного белка Bcl-xL в гиппокампе и продолжительностью активного плавания в тесте Порсолта. В следующей серии экспериментов выяснялось, может ли ДОКС влиять на поведение и факторы нейропластичности в условиях активированного ЛПС нейровоспаления, рассматриваемого в настоящее время среди причин, провоцирующих психопатологии. Влияние совместного введения ДОКС и ЛПС на прирост веса тела, поведение животных и показатели периферического и центрального провоспалительного ответов Ежедневный прирост веса тела животных в течение двух недель (Рис.7) достоверно снижался введением в этот период ЛПС - общий эффект ЛПС: F1,22 = 18.23, p < 0.001. Этот эффект не менялся совместным с ЛПС введением ДОКС - общий эффект ДОКС: F1,22 = 1.02, p > 0.1; взаимодействие ЛПС и ДОКС: F1,22 = 0.070, p > 0.1.
Наиболее часто наблюдаемым в многочисленных предшествующих исследованиях поведенческим эффектом после ЛПС является угнетение двигательной активности животных, которое отчетливо проявлялось и в нашем эксперименте в тесте ПКЛ достоверным (p < 0.05) снижением числа вставаний на задние лапы в закрытых рукавах лабиринта у животных, получавших эндотоксин в течение двух недель (Рис.8). Совместное с ЛПС введение ДОКС предотвращало снижение значения этого часто используемого для определения двигательной активности грызунов параметра (Cruz et al., 1994) - общий эффект ДОКС: F1,22 = 7.58, p < 0.05. Тест ПКЛ применяется для оценки тревожности животных, классическими показателями которой общепринято считаются количество входов в открытые рукава и продолжительность проведенного на этих рукавах времени. Вместе с тем, эти показатели зависят от двигательной активности животных, изменение которой искажает реальную оценку тревожности. Учитывая выявленное влияние ЛПС и ДОКС на двигательную активность животных, для оценки их тревожности в тесте ПКЛ был выбран не зависящий от двигательной активности, другой, также ассоциированный с уровнем страха показатель – количество дефекаций (каловые болюсы) (Archer, 1973; Clinton et al., 2014). После введения ЛПС у животных в течение тестового периода наблюдалось значительное увеличение количества каловых болюсов (p < 0.05), эффект, который ослаблялся совместным с ЛПС введением ДОКС - общий эффект ДОКС: F1,22 = 4.91, p < 0.05. Результаты теста ПКЛ показывают, что поведенческие эффекты эндотоксина, такие как угнетение двигательной активности и повышение тревожности животных, предотвращались совместным с ЛПС введением ДОКС. Изменение поведения после ЛПС могло быть обусловлено активацией эндотоксином иммунного/нейровоспалительного ответа. Ключевым органом, отвечающим за общий иммунный ответ организма, в том числе и на ЛПС, является селезенка. Вес селезенки значительно (p < 0.05) увеличивался после 12 Рис.7. Влияние введения ЛПС отдельно или совместно с ДОКС в течение двух недель на прирост веса тела животных. * ‒ p < 0.05 по сравнению с Физиол. р-р. Рис.8. Количество (в процентах к контролю) вставаний на задние лапы и каловых болюсов в тесте ПКЛ после введения ЛПС отдельно или вместе с ДОКС в течение 14 дней. * ‒ p < 0.05 по сравнению с Физиол. р-р.; # ‒ p < 0.05 по сравнению с ЛПС. ЛПС, независимо от продолжительности введения (однократно, в течение 7 или 14 дней; Рис.9). Сходное увеличение веса этого органа в ответ на повторные введения ЛПС продемонстрировано в работах многих исследователей, например, у мышей после введения ЛПС в течение 13 недель (Krishna et al., 2016). Совместное с ЛПС введение в течение 14 дней ДОКС предотвращало вызванное эндотоксином увеличение веса селезенки животных - общий эффект ДОКС: F1,22 = 25.78, p < 0.01 (Рис.10). Помимо активации периферической иммунной стистемы, на что указывает увеличение веса селезенки, системное введение ЛПС может индуцировать иммунные и провоспалительные ответы также и в центральной нервной системе. Развивающееся в результате этой индукции так называемое нейровоспаление характеризуется активацией микроглии, резидентных иммунных клеток мозга, и увеличением экспрессии цитокинов, полагаемых причиной ослабления нейропластичности и нейродегенеративных нарушений (Block, Hong 2005). Для оценки влияния введения ЛПС в течение 14 дней на активацию нейровоспаления были определены уровни белков Iba-1 (маркерный белок активированной микроглии) и провоспалительного фактора MMP-9. Введение ЛПС значительно повысило (p < 0.05) уровень белка Iba-1 в большинстве исследованных отделов мозга: префронтальной коре, миндалине, гипоталамусе, среднем мозге, стволе, но не в стриатуме и гиппокампе (Рис.11). Данный результат согласуется с работами, где были показаны повышенные уровни белка Iba-1 и провоспалительных цитокинов в отделах мозга животных после острого и хронического введения ЛПС (Dang et al., 2018; Zhao X. et al., 2019; Shishkina et al., 2019). Введение в течение двух недель одного ДОКС не повлияло 13 Рис.9. Вес селезенки (в процентах к контролю) животных после введения ЛПС однократно, в течение 7 или 14 дней. * ‒ p < 0.05 по сравнению с Физиол.р-р. Рис.10. Вес селезенки животных после введения ЛПС в течение 14 дней отдельно и совместно с ДОКС. * ‒ p < 0.05 по сравнению с Физиол.р-р.; # ‒ p < 0.05 по сравнению с ЛПС. на уровень белка Iba-1 в мозге. Вместе с тем, введение антибиотика в течение этого периода совместно с ЛПС значительно ослабило индуцированное эндотоксином повышение уровня белка Iba-1 в ряде областей мозга, включающих миндалину (F1,22 = 8.22, p < 0.01), гипоталамус (F1,22 = 7.45, p < 0.05) и средний мозг (F1,21 = 5.21, p < 0.05). Эти данные согласуются с результатами, полученными на культуре микроглиальных клеток, о способности ДОКС оказывать угнетающее влияние на вызванную ЛПС активацию микроглии (Santa-Cecília et al., 2016). Новым результатом, полученным в работе, являются свидетельства вовлечения активации нейровоспаления, прежде всего в миндалине, играющей ключевую роль в формировании эмоций и, в частности, страха, в угнетение двигательной активности и увеличение тревожности животных после ЛПС. Между значениями этих поведенческих параметров в тесте ПКЛ и уровнем белка Iba-1 в миндалине обнаружены достоверные корреляции: отрицательная – для числа вставаний на задние лапы (r = 0.44, p < 0.05) (Рис.12), и положительная корреляция – для количества каловых болюсов (r = 0.52, p < 0.01) (Рис.13). Рис.11. Уровень белка Iba-1 (в процентах к контролю – Физиол. р-р) в отделах мозга после введения ДОКС и ЛПС отдельно или совместно в течение 14 дней. PFC – префронтальная кора, HIPP – гиппокамп, AMY – миндалина, HYPO – гипоталамус, STR – стриатум, MID – средний мозг, STEM – ствол. # ‒ p < 0.05 по сравнению с группами без ЛПС (Физиол. р-р, ДОКС); * ‒ p < 0.05 по сравнению с ЛПС. Рис.12. Отрицательная корреляция между количеством вставаний на задние лапы в тесте ПКЛ и уровнем белка Iba-1 в миндалине. Рис.13. Положительная корреляция между количеством каловых болюсов в тесте ПКЛ и уровнем белка Iba-1 в миндалине. Определение уровня другого белка - фермента MMP-9, также ассоциируемого с провоспалительными процессами, выявило достоверное повышающее влияние ЛПС на этот провоспалительный параметр в миндалине (F1,21 = 4.39, p < 0.05). Однако, в отличие от белка Iba-1, индуцированное ЛПС повышение уровня MMP-9 не ослаблялось совместным с ЛПС введением ДОКС (Рис.14), несмотря на то, что ДОКС является мощным ингибитором MMP-9, прежде всего, в гиппокампе, способным через этот механизм предотвращать гибель клеток в структуре после глобальной церебральной ишемии (Lee et al., 2009). Вместе с тем, повышение уровня этого провоспалительного фактора, как и белка Iba-1, по-видимому, вовлекается в повышение тревожности, наблюдаемое после введения эндотоксина. Достоверная положительная корреляция, выявленная между уровнями белка MMP-9 в миндалине и количеством каловых болюсов в тесте ПКЛ (r = 0.50, p < 0.05), свидетельствует о возможной связи индуцированного ЛПС повышения тревожности с увеличением уровня MMP-9 в миндалине (Рис.15). Рис.14. Влияние введения ЛПС и ДОКС в течение 14 дней, отдельно или совместно, на уровень белка MMP-9 в миндалине (в процентах к контролю). * ‒ p < 0.05 по сравнению с группами без ЛПС. Рис.15. Достоверная положительная корреляция между уровнем белка MMP-9 в миндалине и количеством каловых болюсов в тесте ПКЛ. Депрессивно-подобное состояние животных после ДОКС и ЛПС оценивали в общепринятых тестах принудительного плавания (тест Порсолта; выученная беспомощность) и потребления сахарозы (тест на ангедонию). Развитие депрессивно-подобного состояния в тесте Порсолта увеличением продолжительности замирания после ЛПС, как правило, наиболее отчетливо фиксируется в экспериментах с острым введением эндотоксина. Поведенческие эффекты повторных инъекций изучены недостаточно и противоречивы. В наших экспериментах повторяющиеся введения ЛПС в течение двух недель не повлияли на продолжительность замирания в тесте (Рис.16). Однако, как показано на этом рисунке 16, совместное с ЛПС введение в течение двух недель ДОКС оказало умеренное, на уровне тенденции (Student t- test (9) = 2.0004; p = 0.076), понижающее влияние на продолжительность замирания. На антидепрессивно-подобный эффект ДОКС на фоне ЛПС в тесте Порсолта также указывает достоверное (p < 0.05) увеличение продолжительности активного плавания (Рис.17). Эти результаты согласуются с опубликованными данными других исследователей (Mello et al., 2013), показавших предотвращение вызванного эндотоксином увеличения продолжительности замирания в тесте Порсолта у мышей однократным до ЛПС введением ДОКС. Рис.16. Влияние введения ЛПС, отдельно и совместно с ДОКС, однократно, а также в течение 14 дней на продолжительность замирания (в процентах к контролю) в тесте Порсолта. Рис.17. Влияние введения ЛПС, отдельно и совместно с ДОКС, однократно, а также в течение 14 дней на продолжительность активного плавания (в процентах к контролю) в тесте Порсолта. * ‒ p < 0.05 по сравнению с ЛПС. С результатами теста Порсолта согласуются и данные теста на ангедонию. В этом тесте снижение потребления воды с сахаром считается проявлением ангедонии у грызунов (Hasler et al., 2004). В нашем эксперименте потребление сахарозы значительно не менялось после однократного или в течение 7 дней введения ЛПС, но было достоверно снижено после введения эндотоксина в течение 14 дней: Student t-test (10) = 3.74; p < 0.05 (Рис.18). Эти данные являются важным свидетельством, что введение ЛПС в течение двух недель провоцировало развитие депрессивно-подобного состояния у животных. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей (Wang et al., 2011; Biesmans et al., 2016; Guo et al., 2016) об индуцирующем влиянии ЛПС на ангедонию даже в случае отсутствия поведенческого эффекта в тесте Порсолта. Совместное с ЛПС введение ДОКС не повлияло на потребление сахарозы после однократного или в течение 7 дней введения, но, как было обнаружено впервые, предотвращало снижение потребления сахарозы животными после 14-дневного введения ЛПС (Рис.18). По общему объему потребляемой жидкости группы животных не различались ни в один из сроков исследования (Рис.19). Рис.18. Влияние введения ЛПС, одного и совместно с ДОКС, однократно, а также в течение 7 и 14 дней на процент потребления сахарозы животными; * ‒ p < 0.05 по сравнению с Физиол. р-р.; # ‒ p < 0.05 по сравнению с ЛПС. Рис.19. Влияние введения одного ЛПС однократно, а также в течение 7 и 14 дней на общее потребление животными жидкости (в процентах к контролю). Активация иммунной системы в центральной нервной системе может сопровождаться снижением нейротрофической активности, на что, например, указывает снижение экспрессии гена и белка BDNF в гиппокампе крыс после введения животным ЛПС или провоспалительных цитокинов (Guan and Fang, 2006; Zhang et al., 2015). Однако в нашей работе повторные введения ЛПС не оказали значительного влияния на уровни белка BDNF в отделах мозга, включающих гиппокамп (Рис.20), что может быть обусловлено различиями в условиях экспериментов. В нашей работе также не было обнаружено влияния ДОКС, вводимого как отдельно, так и совместно с ЛПС, на BDNF, что исключает участие нейротрофина в антидепрессивном действии антибиотика. Сходный результат был обнаружен с использованием другого тетрациклинового антибиотика, миноциклина, который также оказывал антидепрессивно-подобное действие, но не влиял на экспрессию BDNF в гиппокампе крыс (Arakawa et al., 2012). Вместе с тем, в работе других исследователей однократное введение ДОКС сопровождалось антидепрессивно-подобным ответом вместе с увеличением уровня белка BDNF в гиппокампе (Mello et al., 2013). Данный эффект может быть специфичным для непродолжительного введения ДОКС и нуждается в дополнительной проверке. Рис.20. Уровень белка BDNF (в процентах к контролю – Физиол. р-р) в гиппокампе крыс после введения ДОКС и ЛПС, отдельно или совместно, в течение 14 дней. В отличие от BDNF, уровень белка Bcl-xL, также ассоциируемого с регуляцией нейропластичности, в ответ на введение ЛПС значительно снижался в гипоталамусе и стриатуме, в то время как совместное с ЛПС введение ДОКС предотвращало эти эффекты ЛПС (F1,21 = 13.08, p < 0.01) (Рис.21). Снижение экспрессии анти-апоптозных белков, показано, ослабляет жизнеспособность клеток мозга, что может явиться причиной нейродегенеративных и психоэмоциональных нарушений. Ослабление угнетающего влияния ЛПС на уровень белка Bcl-xL, обнаруженное при его совместном введении с ДОКС, может представлять один из механизмов предотвращения обусловленных эндотоксином негативных психоэмоциональных проявлений. Рис.21. Уровень белка Bcl-xL (в процентах к контролю – Физиол. р-р) в отделах мозга после введения ДОКС и ЛПС, отдельно или совместно, в течение 14 дней. PFC – префронтальная кора, HIPP – гиппокамп, AMY – миндалина, HYPO – гипоталамус, STR – стриатум, MID – средний мозг, STEM – ствол. # ‒ p < 0.05 по сравнению с группами без ЛПС (Физиол. р-р, ДОКС); * ‒ p < 0.05 по сравнению с ЛПС. Обобщая результаты работы, можно заключить, что поведенческие эффекты препаратов, введенных отдельно, зависели от продолжительности воздействия. Непродолжительное введение одного ДОКС в течение 4 дней вызывало транзиторное повышение тревожности, отсутствующее при более длительном введении. Введение ДОКС в течение 7 дней оказывало также транзиторное, отсутствующее после 14-дневного введения, умеренное антидепрессивно-подобное действие, которое ассоциировалось с увеличением уровней антиапоптозного белка Bcl-xL в гиппокампе. Результаты, полученные после введения ЛПС, в целом согласуются с ранее полученными данными, свидетельствующими об угнетении двигательной активности животных, повышении тревожности и развитии депрессивно-подобного состояния. Эти поведенческие эффекты были ассоциированы с провоспалительной активацией в ряде отделов головного мозга, и, кроме того, судя по снижению уровня белка Bcl-xL в гипоталамусе и стриатуме, с ослаблением антинейродегенеративной защиты. Совместное с ЛПС введение ДОКС в течение 14 дней предотвращало индуцируемые эндотоксином поведенческие изменения, ослабляло активацию микроглии и снижение уровня белка Bcl-xL в структурах мозга. Выявленные корреляции между показателями двигательной активности, а также тревожности и уровнями белка активированной микроглии Iba-1 в ряде отделов мозга, включающих миндалину, указывают на ослабление введением ДОКС индуцированной ЛПС активации микроглии в качестве важного механизма поведенческих эффектов антибиотика в условиях нейровоспаления. Заключение В целом в работе впервые обнаружено влияние ДОКС на поведение лабораторных крыс в норме и в условиях активации нейровоспаления. Механизмы этих эффектов могут включать влияние антибиотика на антиапоптозный белок Bcl-xL, а также ослабление индуцируемой провоспалительным стимулом микроглиальной активации. Впервые выявлено участие повышения уровня MMP-9 в миндалине в индуцированном ЛПС повышении тревожности. ВЫВОДЫ 1. ДОКС оказывал транзиторное, зависимое от продолжительности введения, влияние на тревожность и депрессивно-подобное поведение животных. Введение антибиотика в течение 4 дней увеличивало тревожность, а в течение 7 дней оказывало умеренное антидепрессивно-подобное действие, положительно коррелирующее с увеличением уровня белка Bcl-xL в гиппокампе. 2. Введение ЛПС в течение 14 дней индуцировало у животных нейровоспаление, проявляющееся увеличением уровней белка Iba-1 в большинстве исследованных отделов мозга и уровня MMP-9 в миндалине. Введение ЛПС также активировало периферический иммунный ответ, на что указывало достоверное увеличение веса селезенки животных после однократного, в течение 7 и 14 дней введения эндотоксина. Влияние ЛПС, вводимого в течение двух недель, на уровень белка Iba-1 в миндалине, гипоталамусе и среднем мозге, а также вес селезенки предотвращалось совместным в течение этого периода введением ДОКС. 3. Введение ЛПС в течение 14 дней снижало уровни белка Bcl-xL в гипоталамусе и стриатуме; совместное с ЛПС введение ДОКС предотвращало этот эффект эндотоксина. Введение ДОКС и ЛПС, как отдельно, так и совместно в течение 14 дней не оказывало влияния на уровни белка BDNF. 4. Введение ЛПС в течение 14 дней угнетало двигательную активность и повышало тревожность животных, а также, судя по уменьшению потребления сахарозы, провоцировало развитие у них депрессивно-подобного состояния. Эти эффекты предотвращались совместным с ЛПС введением ДОКС. 5. Между уровнями белка Iba-1 в миндалине и значениями двигательной активности, а также тревожности животных обнаружены достоверные корреляции, отрицательная и положительная, соответственно, что позволяет предполагать угнетение повышенной эндотоксином активности микроглиальных клеток в качестве одного из путей влияния ДОКС на индуцированные ЛПС снижение двигательной активности и увеличение тревожности. 6. Повышение эндотоксином уровня белка MMP-9 в миндалине не корректировалось ДОКС. Достоверная положительная корреляция, выявленная между уровнями MMP-9 и значениями тревожности, свидетельствует об участии этого провоспалительного фактора в провоцировании анксиогенного эффекта в условиях нейровоспаления.