Получение биологически активных рекомбинантных белков: интерлейкина-36 гамма (ИЛ-36г) и рецепторного антогониста интерлейкина-36 (ИЛ-36РА)

Хижина Айгуль Альфретовна
Бесплатно
В избранное
Работа доступна по лицензии Creative Commons:«Attribution» 4.0

Семейство интерелейкина-36 (ИЛ-36) включает в себя: 3 агониста ИЛ-36α, β, γ и один антагонист ИЛ-36РА. Агонисты, связываясь с их общим рецептором – ИЛ-36Р, активируют сигнальные пути NF-kВ и/или МАРК. Антагонист же, связываясь с ИЛ-36Р, препятствует передаче сигнала. Цитокины ИЛ-36 вовлечены в воспалительные процессы в коже, в том числе в патогенез псориаза. Псориаз – это аутоиммунное заболевание кожи, которое встречается примерно у 2% населения в развитых странах. При псориатическом воспалении резко повышается продукция провоспалительных цитокинов кожи – ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36γ -, в отдельных случаях в 100 раз. Среди них наиболее сильным маркером является ИЛ-36γ. Это позволяет использовать его в диагностических целях, как мишень антицитокиновой терапии, направленной на лечение псориаза, или для моделирования псориаза. Мутации в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, ассоциированы с развитием тяжелейшей формы псориаза – генерализованного пустулезного псориаза. Следовательно, ИЛ-36РА может служить потенциальным средством для лечения псориаза. В настоящей работе описано получение биологически активных рекомбинантных белков ИЛ-36РА и ИЛ-36γ человека. Для максимальной биологической активности молекулам ИЛ-36РА и ИЛ-36γ необходим протеолиз. Для получения биологически активной формы ИЛ-36РА важно отщепление N-концевого остатка метионина. Для получения биологически активной формы ИЛ-36γ важно отщепление N-концевого сигнального пептида, поэтому для получения рекомбинантного ИЛ-36γ мы использовали модифицированный ген IL36G, кодирующий уже процессированную форму ИЛ-36γ, которая начинается с 18-го а.к.о. серина. Однако биологическая активность такого рекомбинантного ИЛ-36γ недостаточно высокая по сравнению с препаратами описанными в литературе. Мы предположили, что причиной понижения биологической активности ИЛ-36γ также является недостаточно эффективное отщепление N-концевого остатка метионина. Для отщепления N-концевого остатка метионина ИЛ-36РА и ИЛ-36γ использовали метод коэкспрессии гена интереса с геном метионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных промоторов, а также метод экзогенной обработки рекомбинантного белка ИЛ-36РА и ИЛ-36γ рекомбинантной МАП. В случае с рекомбинантным ИЛ-36РА оба метода позволили получить безметиониновые формы ИЛ-36РА с биологической активностью равной активности стандартного образца. Был получен оптимальный штамм- штамм-продуцент ИЛ-36РА – ИЛ-36РА-МАП-BAD. Анализ полученных препаратов проводили при помощи ИФА, ОФ-ВЭЖХ и биологического теста. К настоящему времени эксперимент с ИЛ-36γ не окончен, требуется дополнительный анализ с помощью масс-спектрометрии.

Псориаз – это аутоиммунное заболевание кожи, которое встречается примерно у 2% населении Европы и Северной Америки (Nestle et al., 2009). Одним из маркеров псориатического воспаления является резкое повышение продукции специфических провоспалительных цитокинов кожи – Интерлейкинов-36 α, β, γ (ИЛ-36α, β, γ) – в отдельных случаях в 100 раз (Blumberg et al., 2010). Среди них наиболее сильным маркером является ИЛ-36γ (D’Erme et al., 2015). Это позволяет использовать его в диагностических целях (Blumberg et al., 2010), как мишень антицитокиновой терапии, направленной на подавление псориаза (D’Erme et al., 2015) или для моделирования псориаза.
Помимо вышеперечисленных, семейство ИЛ-36 включает также один противоспалительный цитокин – рецепторный антагонист ИЛ-36 (ИЛ-36РА) (Walsh and Fallon, 2016). Агонисты, связываясь с их общим рецептором – ИЛ-36Р, активируют сигнальные пути NF-В и/или МАРК. Антагонист же, связываясь с ИЛ-36Р, препятствует передаче сигнала (Walsh and Fallon, 2016). Мутации в гене IL-36RN, кодирующий ИЛ-36РА, ассоциированы с развитием тяжелейшей формы псориаза – генерализованного пустулезного псориаза (Marrakchi et al., 2011). Следовательно, ИЛ-36РА может служить потенциальным средством для лечения псориаза (Marrakchi et al., 2011).
Данная работа была выполнена как фрагмент проекта по разработке средства для лечения тяжелого псориаза на основе ИЛ-36РА. Необходимо было получить ИЛ-36РА, обладающий максимальной биологической активностью, а также ИЛ-36γ, который необходим для оценки биологической активности ИЛ-36РА.
Для максимальной биологической активности молекулам ИЛ-36РА и ИЛ-36γ необходим протеолиз (Towne et al., 2011a). Для получения биологически активной формы ИЛ-36γ важно отщепление N-концевого сигнального пептида, тогда как для ИЛ-36РА достаточно отщепление N-концевого остатка метионина (Towne et al., 2011a). В данной работе для получения рекомбинантного ИЛ-36γ мы использовали модифицированный ген IL36G, кодирующий уже процессированную форму ИЛ-36γ, которая начинается с 18 а.к.о. серина. В случае ИЛ-36РА не требовалось модификаций последовательности гена.
В случае ИЛ-36РА проблемой стало недостаточно эффективное отщепление
N-концевого остатка метионина, что снижало биологическую активность получаемого белка. Биологическая активность получаемого ИЛ-36γ также не соответствовала литературным данным. Мы предположили, что причиной понижения биологической активности ИЛ-36γ также является недостаточно эффективное отщепление
N-концевого остатка метионина.
Исходя из вышесказанного нами была поставлена следующая цель и задачи:

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?
Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

    Нажимая на кнопку, я соглашаюсь на обработку персональных данных и с правилами пользования Платформой

    Хочешь уникальную работу?

    Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

    Вики Р.
    5 (44 отзыва)
    Наличие красного диплома УрГЮУ по специальности юрист. Опыт работы в профессии - сфера банкротства. Уровень выполняемых работ - до магистерских диссертаций. Написан... Читать все
    Наличие красного диплома УрГЮУ по специальности юрист. Опыт работы в профессии - сфера банкротства. Уровень выполняемых работ - до магистерских диссертаций. Написание письменных работ для меня в удовольствие.Всегда качественно.
    #Кандидатские #Магистерские
    60 Выполненных работ
    Елена С. Таганрогский институт управления и экономики Таганрогский...
    4.4 (93 отзыва)
    Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на напис... Читать все
    Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на написании курсовых и дипломных работ, а также диссертационных исследований.
    #Кандидатские #Магистерские
    158 Выполненных работ
    Виктор В. Смоленская государственная медицинская академия 1997, Леч...
    4.7 (46 отзывов)
    Имеют опыт грамотного написания диссертационных работ по медицине, а также отдельных ее частей (литературный обзор, цели и задачи исследования, материалы и методы, выв... Читать все
    Имеют опыт грамотного написания диссертационных работ по медицине, а также отдельных ее частей (литературный обзор, цели и задачи исследования, материалы и методы, выводы).Пишу статьи в РИНЦ, ВАК.Оформление патентов от идеи до регистрации.
    #Кандидатские #Магистерские
    100 Выполненных работ
    Татьяна П.
    4.2 (6 отзывов)
    Помогаю студентам с решением задач по ТОЭ и физике на протяжении 9 лет. Пишу диссертацию на соискание степени кандидата технических наук, имею опыт годовой стажировки ... Читать все
    Помогаю студентам с решением задач по ТОЭ и физике на протяжении 9 лет. Пишу диссертацию на соискание степени кандидата технических наук, имею опыт годовой стажировки в одном из крупнейших университетов Германии.
    #Кандидатские #Магистерские
    9 Выполненных работ
    Дмитрий М. БГАТУ 2001, электрификации, выпускник
    4.8 (17 отзывов)
    Помогаю с выполнением курсовых проектов и контрольных работ по электроснабжению, электроосвещению, электрическим машинам, электротехнике. Занимался наукой, писал стать... Читать все
    Помогаю с выполнением курсовых проектов и контрольных работ по электроснабжению, электроосвещению, электрическим машинам, электротехнике. Занимался наукой, писал статьи, патенты, кандидатскую диссертацию, преподавал. Занимаюсь этим с 2003.
    #Кандидатские #Магистерские
    19 Выполненных работ
    Мария М. УГНТУ 2017, ТФ, преподаватель
    5 (14 отзывов)
    Имею 3 высших образования в сфере Экологии и техносферной безопасности (бакалавриат, магистратура, аспирантура), работаю на кафедре экологии одного из опорных ВУЗов РФ... Читать все
    Имею 3 высших образования в сфере Экологии и техносферной безопасности (бакалавриат, магистратура, аспирантура), работаю на кафедре экологии одного из опорных ВУЗов РФ. Большой опыт в написании курсовых, дипломов, диссертаций.
    #Кандидатские #Магистерские
    27 Выполненных работ
    Евгения Р.
    5 (188 отзывов)
    Мой опыт в написании работ - 9 лет. Я специализируюсь на написании курсовых работ, ВКР и магистерских диссертаций, также пишу научные статьи, провожу исследования и со... Читать все
    Мой опыт в написании работ - 9 лет. Я специализируюсь на написании курсовых работ, ВКР и магистерских диссертаций, также пишу научные статьи, провожу исследования и создаю красивые презентации. Сопровождаю работы до сдачи, на связи 24/7 ?
    #Кандидатские #Магистерские
    359 Выполненных работ
    Катерина В. преподаватель, кандидат наук
    4.6 (30 отзывов)
    Преподаватель одного из лучших ВУЗов страны, научный работник, редактор научного журнала, общественный деятель. Пишу все виды работ - от эссе до докторской диссертации... Читать все
    Преподаватель одного из лучших ВУЗов страны, научный работник, редактор научного журнала, общественный деятель. Пишу все виды работ - от эссе до докторской диссертации. Опыт работы 7 лет. Всегда на связи и готова прийти на помощь. Вместе удовлетворим самого требовательного научного руководителя. Возможно полное сопровождение: от статуса студента до получения научной степени.
    #Кандидатские #Магистерские
    47 Выполненных работ
    Мария А. кандидат наук
    4.7 (18 отзывов)
    Мне нравится изучать все новое, постоянно развиваюсь. Могу написать и диссертацию и кандидатскую. Есть опыт в различных сфера деятельности (туризм, экономика, бухучет... Читать все
    Мне нравится изучать все новое, постоянно развиваюсь. Могу написать и диссертацию и кандидатскую. Есть опыт в различных сфера деятельности (туризм, экономика, бухучет, реклама, журналистика, педагогика, право)
    #Кандидатские #Магистерские
    39 Выполненных работ

    Другие учебные работы по предмету

    Метаболомы литоральных водорослей-макрофитов Белого моря
    📅 2018год
    🏢 Санкт-Петербургский государственный университет