Инфузии T-лимфоцитов памяти в низких дозах у детей после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток на платформе деплеции αβ Т-лимфоцитов

В экспериментальную группу включена когорта из 131-го, пациента, перенесшего аллогенную ТГСК с процессингом трансплантата посредством технологии αβ T и СD19–деплеции в клинике НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева за период с 15.04.2014 по 17.03.2017. В настоящей работе, данным пациентам, для профилактики и терапии вирусных инфекций используется адоптивный перенос субпопуляции CD45RA-негативных лимфоцитов. В качестве группы контроля, определена когорта из 91-го пациента, которым также проведена алло-ТГСК с αβ T и СD19–деплецией трансплантата в клинике НМИЦ ДГОИ в схожем временном периоде, но без применения дополнительных посттрансплантационных инфузий Т-лимфоцитов памяти (таблица 1).

Исследовательская группа n=131
Контрольная группа n=91
Р, Критерий Манна – Уитни

Возраст на момент ТГСК, медиана, годы
9 (1-25)
6 (1-18)
0,5

Медиана наблюдения,
годы (диапазон)
3 (2-5)
4 (3-5)
0,08

Р, тест Фишера

Пол, м:ж
85:46
63:28
0,9

ЦМВ IgG+ реципиент, n (%)
89 (68)
67 (74)
0,6

Номер ТГСК для пациента

Первая ТГСК, n (%)
Повторная ТГСК, n (%)
126 (96)
87 (96)

5 (4)
4 (4)
1,0

Диагноз

Злокачественные: незлокачественные
80:51
45:46
0,1
ОЛЛ, n (%)
30 (23)
13 (14)
ОМЛ в ремиссии, n (%)
30 (23)
9 (10)
ОМЛ вне ремиссии, n
(%)
12 (9)
9 (10)
Лимфомы, n (%)
4 (3)
7 (8)
0,03
Другие злокачественные, n (%)
4 (3)
7 (8)
ПАА, n (%)
12 (9)
16 (18)
ВАА, n (%)
5 (4)
6 (6)
ПИДС, n (%)
29 (22)
22 (24)
0,4
HLH, n (%)
9/10 HLA-cовместимые неродственные, n (%)
5 (4)
2 (2)
Характеристика доноров
Гаплоидентичные, n (%)
79 (60)
36 (40)
10/10 HLA-cовместимые неродственные, n (%)
35 (27)
38 (42)
16 (12)
12 (13)
0,05
10/10 HLA-cовместимые родственные, n (%)
1 (1)
5 (5)
Пол доноров, м:ж
63:68
56:35
0,05
ЦМВ IgG +, n (%)
131 (100)
67 (74)
<0,0001 ОМЛ – острый миелобластный лейкоз; ОЛЛ– острый лимфобластный лейкоз; ПАА – тяжелая приобретенная апластическая анемия; ВАА – врожденная костномозговая недостаточность; HLH – гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз; ПИДС – первичное иммунодефицитное состояние Таблица 1. Характеристика пациентов экспериментальной и контрольной групп Критериями включения пациентов в исследование и инициирования курса инфузий СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов, помимо факта проведенной алло-ТГСК с αβ T-деплецией, были документированное приживление трансплантата, отсутствие активных признаков РТПХ и тяжелого неконтролируемого инфекционного процесса на момент планируемой инфузии донорских лимфоцитов (ИДЛ), а также ЦМВ- серопозитивный статус донора. Допускалось включение пациентов с купированными проявлениями предшествующей оРТПХ при условии отсутствия терапии стероидами в дозе выше 0,5 мг/кг/сутки на момент планируемой инфузии T-лимфоцитов памяти. Общий план клинического исследования представлен на рисунке 1. ЦМВ, АДВ, ЭБВ (ПЦР крови) еженедельно1. Elispot 12 Elispot 2 Elispot 3 Elispot 4 Elispot 5 TCR seq3 TCR seq ИДЛ No14 ИДЛ No2 ИДЛ No3 Контрольная точка t0 t1 Рисунок 1. План исследования 1 Вирусологический мониторинг методом ПЦР крови к цитомегаловирусу, аденовирусу и вирусу Эпштейна-Барра выполнялся рутинно еженедельно всем пациентам. 2 Мониторинг реактивности к основным исследуемым вирусным патогенам методом «ELISPOT» проводился всем пациентам, включенным в анализ перед каждой инфузией клеток памяти, а также через 1 месяц после заключительной инфузии и в точке 1 год после ТГСК. 3 Глубокое секвенирование T-клеточного рецептора (TCR) было запланировано для шестнадцати пациентов экспериментальной группы в контрольных точках t3 (1 месяц после 3-й инфузии) и t4 (1 год после ТГСК). 4 Инфузия донорских лимфоцитов памяти. Запланировано 3 инфузии клеточного продукта в дозах от 25×103 до 100×103 /кг (для реципиентов t2 t3 t4 День после ТГСК 60 120 14 гаплоидентичных трансплантаций) либо от 100×103 до 300×103 /кг (для реципиентов полностью совместимых неродственных алло-ТГСК). После приживления трансплантата и разрешения острых осложнений (~ 1 месяца после ТГСК), выполнялась первая инфузия CD45RA-деплетированных лимфоцитов. Стартовая доза составляла (расчет на CD3+ лимфоциты) 25 × 103 /кг (для реципиентов гаплоидентичных трансплантаций) либо 100 × 103 /кг (для реципиентов полностью совместимых неродственных алло-ТГСК). Далее ИДЛ памяти выполнялись с интервалом в 1 месяц и эскалацией дозы до максимума – 100 × 103 /кг при гаплоидентичных ТГСК и 300 × 103 /кг при ТГСК от неродственных совместимых доноров. В исследовании предусмотрено 5 контрольных точек, в которые исследовались ключевые параметры: химеризм, субпопуляционный состав лимфоцитов, количественный анализ вирус-специфичных T-лимфоцитов. Еженедельно, до 120 суток после ТГСК, а далее в зависимости от темпа иммунореконституции и факта проведения иммуносупрессивной терапии, всем пациентам осуществлялся регулярный вирусологический мониторинг методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) крови к ЦМВ, АДВ, ЭБВ. За реактивацию считали положительный результат ПЦР (> 500 копий/мл) после двух последовательных отрицательных результатов. Клинически оценивались параметры безопасности (вероятность развития оРТПХ и хРТПХ, а также развитие немедленных реакций, непосредственно ассоциированных с введение клеточного продукта) и эффективность: частота и длительность реактивации вирусных инфекций, их влияние на основные клинические исходы, темп патоген-специфической и общей иммунологической реконституции.
Режимы кондиционирования и профилактики РТПХ
Пациентам экспериментальной и контрольной группы применяли аналогичные режимы кондиционирования, серотерапии и профилактики РТПХ. Базисными алкилирующими препаратами в составе кондиционирования у пациентов, трансплантированных по поводу гемобластозов являлись треосульфан в дозе 42 г/м2 в комбинации c мельфаланом – 140 мг/м2 или тиотепой – 10 мг/кг. Для пациентов с острым лимфобластным лейкозом и острым миелобластным лейкозом, для которых ТГСК была повторной, был предусмотрен курс тотального облучения тела (ТОТ) в курсовой дозе 12 Гр и этопозид в суммарной дозе 60 мг/кг (либо тиотепа 10 мг/кг). Больные с первичными иммунодефицитными состояниями и гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом в качестве основного алкилирующего препарата кондиционирования перед аллогенной ТГСК получали треосульфан в дозе от 36 до 42 г/м2 в комбинации с мельфаланом – 140 мг/м2 или тиотепой – 10 мг/кг. Пациентам с синдромом Ниймеген в кондиционировании вводили бусульфан – 4 мг/кг и циклофосфамид – 40 мг/кг. Пациентам с тяжелой приобретенной апластической анемией и синдромами врожденной костномозговой недостаточности в кондиционирование включали циклофосфамид в дозе 100 мг/кг ± тиотепа – 10 мг/кг и торакоабдоминальное облучение в дозе от 2 до 6 Гр. Все пациенты получили флударабин в дозе 150 мг/м2 – с -6 по -2-е сутки и ритуксимаб – 100 мг/м2 за день до ТГСК. Серотерапия была представлена кроличьим антитимоцитарным иммуноглобулином (Тимоглобулин, Genzyme) в дозе 5 мг/кг или лошадиным антитимоцитарным иммуноглобулином (АТГАМ, Pfizer) – 100 мг/кг. Схема кондиционирования и серотерапии пациентов экспериментальной и контрольной групп представлены в таблице 2.
Режимы кондиционирования
Исследовательская группа n=131
Контрольная группа n=91
Р, тест Фишера
МАК: Треосульфан, флударабин, мельфалан / тиотепа, n (%)
87 (66)
58 (71)
РИК: Флударабин, циклофосфамид, бусульфан / TАО, n (%)
21 (16)
25(27)
0,13
ТОТ 12Гр, этопозид / тиотепа, n (%)
23 (18)
8 (9)
Тимоглобулин, n (%)
96 (73)
57 (63)
0,05
АТГАМ, n (%)
12 (9)
19 (21)
МАК – миелоаблативный режим кондиционирования, РИК – режим
кондиционирования редуцированной интенсивности, ТАО – торакоабдоминальное облучение тела, ТОТ – тотальное облучение тела, АТГАМ – антитимоцитарный глобулин.
Таблица 2. Особенности кондиционирования и серотерапии перед аллогенной ТГСК пациентов экспериментальной и контрольной групп
В рамках фармакологической профилактики оРТПХ пациенты с гемобластозами получали бортезомиб в дозе 1,3 мг/м2 в -5, -2, +2 и +5-й дни, либо такролимус с -1 до +30-х суток. Пациентам с рефрактерными лейкозами вместо антитимоцитарного глобулина применяли комбинацию иммуносупрессивных препаратов в составе: тоцилизумаб – 8 мг/кг в -1-й день и абатацепт – 10 мг/кг в -1, +7, +14, +28-й дни. Все пациенты с заболеваниями незлокачественной природы получали профилактику РТПХ в составе такролимуса либо циклоспорина до + 60-го дня, либо такролимус в сочетании с микофенолата мофетилом или метотрексатом– 5 мг/м2 на +1-й, +3-й, +6-й дни после ТГСК.
Режимы профилактики РТПХ
Исследовательская группа n=131
Контрольная группа n=91
Р, тест Фишера
Бортезомиб ± Абатацепт, тоцилизумаб, n (%)
65 (50)
43 (47)
Циклоспорин/такролимус
± метотрексат ± микофенолата мофетил, n (%)
54 (41)
48 (53)
0,3
Таблица 3. Особенности посттрансплантационной профилактики РТПХ для пациентов экспериментальной и контрольной группы
Выбор донора, заготовка трансплантата и приготовление Т-лимфоцитов памяти
Пятидесяти одному пациенту из экспериментальной группы проведена алло-ТГСК от совместимых неродственных доноров: 35 от 10/10 HLA- cовместимых и 16 от 9/10 HLA-cовместимых доноров. Один пациент получил ТГСК от полностью совместимого родственного донора. Семьдесят девять пациентов экспериментальной группы трансплантированы от гаплоидентичных доноров. В контрольной группе 36 пациентов получили ТГСК от гаплоидентичных доноров, 50 от неродственных совместимых, в том числе 38 от 10/10 HLA-cовместимых и 12 от 9/10 HLA-cовместимых доноров. У пяти пациентов контрольной группы использовали 10/10 HLA-cовместимых родственных доноров.
Клеточная терапия СD45RА-деплетированными донорскими лимфоцитами проводилась пациентам экспериментальной группы от тех же доноров, от которых был получен основной трансплантат. Все доноры пациентов экспериментальной группы были ЦМВ-серопозитивны.
У всех пациентов основной и контрольной групп использовали периферические стволовые клетки крови, полученные от доноров после предварительной стимуляции перед аферезом в течении 5 последовательных дней препаратом гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г- КСФ) в дозе 10 мкг/кг веса подкожно. С трансплантатом проводилась процедура процессинга: удаление αβ T-лимфоцитов, а также B-лимфоцитов с
помощью аппарата CliniMACS Plus или CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec, Германия).
Для всех пациентов экспериментальной группы проводили процессинг с удалением СD45RA-позитивной клеточной фракции из материала, содержавшего от 2 до 5 × 109 мононуклеаров крови (MNC), посредством технологии иммуномагнитной сортировки на платформе CliniMACS Plus, Depletion 2,0 (n = 35) или CliniMACS Prodigy (n = 96). Медиана эффективности деплеции для CD3+CD45RA+ фракции составила 3,6 log (от 2,5 до 5,5), а «выход» CD3+CD45RO+ – 37% (от 10 до 76). Замороженные образцы впоследствии ретроспективно оценивали на предмет содержания ЭБВ, ЦМВ и АДВ-специфичных клеток памяти посредством методики IFN-γ ELISPOT.
Исследование общей и патоген-специфичной иммунореконституции
Пациентам экспериментальной группы проводился мониторинг становления патоген-специфичной иммунореконституции посредством технологии IFN-γ ELISPOT. В основе метода лежит способность визуализировать СD3+CD4 + T-хелперные и CD8 + цитотоксические T-клетки (CTL), секретирующие после предварительной активации. Исследования ELISPOT выполняли в лаборатории физиологии и патологии стволовых клеток клиники НМИЦ ДГОИ (зав. лаб. проф. д.б.н. Осипова Е.Ю). Мониторинг субпопуляций лимфоцитов крови проводили в лаборатории трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов ФБГУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (Москва) (зав. лаб. Першин Д.Е.).
Исследование клональной динамики в крови реципиента инфузируемых в продукте СD45RA-деплеции донорских клонотипов TCR проводилось на базе лаборатории сравнительной и функциональной геномики «Института биоорганической химии. им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук (зав. лаб. проф. д.б.н. Лебедев Ю.Б.) с целью доказательства гипотезы возможности переноса донорской
иммунологической памяти реципиенту посредством данных ИДЛ. Для этого была собрана коллекция образцов T-лимфоцитов периферической крови 16 реципиентов алло-ТГСК с αβ T-деплецией трансплантата в 2-х контрольных точках. В точке t3: 7 -74 дни после заключительной ИДЛ No3 (90-190 дни после ТГСК) и в точке t4: 220-370 дни после ИДЛ No3 (350-500 дни после ТГСК. Для каждого клеточного образца библиотеки ДНК TCR были секвенированы с использованием аппарата Illumina HiSeq2000/2500 либо NextSeq500/550.
В рамках оценки безопасности методики, клиническую диагностику и стадирование оРТПХ осуществляли в соответствии со стандартными критериями. Диагностика и стадирование хРТПХ выполнялось в соответствии с критериями NIH [Arora и соавт., 2009]. Риск возникновения РТПХ анализировали с момента трансплантации гемопоэтических клеток до первого дня оРТПХ ≥II стадии, требующей назначения системной иммуносупрессивной терапии. Отдельно, среди пациентов, не имевших клинических проявлений оРТПХ до первой ИДЛ памяти, оценивали вероятность возникновения «de novo» оРТПХ – активировавшейся после любой ИДЛ. Конкурирующими событиями считали отторжение трансплантата, рецидив/прогрессия основного заболевания (в случае пациентов с гемобластозами), а также клинические проявления хРТПХ либо смерть, наступившие до развития оРТПХ. Терапия оРТПХ и хРТПХ проводилась в соответствии с принятыми в клинике НМИЦ ДГОИ стандартами.
Статистический анализ
В рамках изучения эффективности ИДЛ памяти, в обеих группах исследовали основные клинические исходы, включая общую выживаемость, смертность, ассоциированную с ТГСК, а также кумулятивную вероятность развития рецидива основного заболевания для пациентов с гемобластозами и отторжения трансплантата для пациентов с незлокачественной патологией.
При сравнении групп использовали критерий Манна–Уитни и точный тест Фишера. Проводилось вычисление медианы, доверительного интервала (95%-й ДИ). Данные считали статистически значимыми при p <0,05. Общую выживаемость рассчитывали по Каплан–Мейеру. В качестве конкурирующего события по отношению к смертности, ассоциированной с ТГСК, был определен рецидив злокачественного заболевания. Для анализа общей и бессобытийной выживаемости все живые пациенты были цензурированы 01.06.2019. Математическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программ XLSTAT, Addinsoft, 2019 версии Windows 10 лично автором. Результаты В ходе исследования 131 реципиенту алло-ТГСК с αβ-Т и СD19- деплецией трансплантата было выполнено 343 инфузии CD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов; медиана кратности введений клеточного продукта составила 3 (от 1 до 4) инфузии для пациента. В ИДЛ содержалоcь различное количество вирус-специфичных Т-клеток (таблица 4). ИДЛ No 1 (n = 131) День ИДЛ* 36 (17–56) ИДЛ No2 (n = 118) 72 (41–219) ИДЛ No3 (n = 94) 106 (60-372) CD3(CD45RO) доза, 103/кг. Гапло (n = 79) ** 25(n=75) 50 (n = 3) 100 (n = 1) 25 (n = 7) 50(n=59) 100 (n = 6) 25 (n = 2) 50 (n = 24) 100 (n = 32) Совместимые (n = 52) *** 100 (n = 29) 50 (n = 3) 25 (n = 20) 200 (n = 27) 100 (n = 2) 50 (n = 16) 25 (n = 1) 300 (n = 18) 200 (n = 2) 100 (n = 11) 50 (n = 5) ЦМВ-специфические T-лимфоциты/кг, медиана (уровень) 45 (0-112000) 60 (0-26916) 106 (0-40374) АДВ-специфические T-лимфоциты/кг, медиана (уровень) 11 (0-12037) 22 (0-24075) 28 (0-22329) ЭБВ-специфические T-лимфоциты/кг, медиана (уровень) 24 (0-21472) 43 (0-42944) 129 (0-33600) * – донорская инфузия лимфоцитов, ** - реципиенты гаплоидентичных ТГСК. ***- реципиенты ТГСК от совместимых неродственных (родственных) доноров. Таблица 4. Состав и тайминг инфузий CD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов Медиана длительности наблюдения пациентов экспериментальной группы (n = 131) на момент написания данной работы составила 3 (от 2 до 5) года, для пациентов контрольной группы (n = 91) – 4 (от 3 до 5) года (критерий Манна- Уитни, p = 0,08). Оценка безопасности Ни одна инфузия T-лимфоцитов памяти не была осложнена аллергическими и иными инфузионными реакциями, либо сопряжена с присоединением септического процесса. Признаки оРТПХ II–III стадии на любом этапе наблюдения среди всей экспериментальной группы больных (n = 131), возникли у 16 (13%) больных. Трое пациентов имели признаки оРТПХ III cтадии, 11 больных - оРТПХ II cтадии. Случаев оРТПХ IV cтадии среди пациентов экспериментальной и контрольной групп не было. Кумулятивная вероятность возникновения оРТПХ II-III стадии у пациентов экспериментальной группы (n=131), составила 13% (95%-й ДИ: 8–20), контрольной группы - 19% (95%-й ДИ: 12–29), соответственно, (тест Грея, p = 0,17), (рисунок 2). 100% 80% 60% 40% 20% 0% Кум.вер. оРТПХ контр. гр. 19%, n=91, 17 событий Кум.вер. оРТПХ экспер. гр. 13%, n=131, 16 событий тест Грея, p = 0,17 0 50 100 150 200 250 300 350 400 дни после ТГСК Контрольная группа Экспериментальная группа Рисунок 2. Кумулятивная вероятность возникновения оРТПХ II-III стадии у пациентов экспериментальной и контрольной групп Среди 124 пациентов экспериментальной группы, не имевших признаков оРТПХ до ИДЛ, активация оРТПХ случилась у 8 пациентов, таким образом, кумулятивная вероятность de novo оРТПХ II-III стадии составила 7% (95% ДИ 4-20) (рисунок 3). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Кум.вер de novo О. РТПХ II-III 7% (95% ДИ 4-20), n=124 (8 cобытий) 0 100 200 Дни после ИДЛ No1 300 400 Рисунок 3. Кумулятивная вероятность возникновения de novo оРТПХ II- III cтадии для экспериментальной группы пациентов без признаков оРТПХ до ИДЛ No1 Среди 14 пациентов экспериментальной группы, у которых произошла активация клинических проявлений оРТПХ после ИДЛ, трое без дальнейших осложнений ответили на стартовую иммуносупрессивную терапию. Трое пациентов, у которых произошла активация оРТПХ de novo, умерли по причинам, напрямую не связанным с РТПХ. Кумулятивная вероятность возникновения хРТПХ среди пациентов экспериментальной группы составила 8% (95% ДИ: 4–14), тогда как среди пациентов контрольной группы -15% (95% ДИ: 10–25), (тест Грея, p = 0,04), (рисунок 4). Все пациенты экспериментальной группы, у которых зарегистрирована хРТПХ, живы на момент написания работы; трое продолжали терапию РТПХ. Большинство клинических случаев течения хронической РТПХ были нетяжелыми: n = 2 - легкая степень с поражением кожи, n = 4 – умеренная, n = 3 – тяжелая степень. 100% 80% 60% 40% 20% 0% Кум.вер. хРТПХ контр. гр. 15%, n = 91, 14 событий Кум.вер. хРТПХ экспер. гр. 8%, n = 131, 9 событий тест Грея, p = 0,04 0123456 годы после ТГСК Контрольная группа Экспериментальная группа Рисунок 4. Кумулятивная вероятность хРТПХ у пациентов экспериментальной и контрольной групп Таким образом, дополнительное применение инфузий низких доз донорских лимфоцитов памяти у реципиентов алло-ТГСК не ассоциировано с более высоким риском развития оРТПХ. Среди пациентов экспериментальной группы ни для одного пациента не наступило тяжелых инвалидизирующих отдаленных последствий, ассоциированных с перенесенной острой либо хронической РТПХ. Большинство случаев РТПХ успешно поддавалось лечению иммуносупрессивной терапией и не оказало значительного влияния на исход ТГСК. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ Вирусные инфекции ЦМВ-виремия выявлена у n = 73 (56%) пациентов экспериментальной группы, а в группе контроля – у n = 47 (52%) больных, (тест Фишера, p = 0,4). У 56 пациентов экспериментальной группы (77% из числа больных с ЦМВ- реактивацией), ЦМВ-виремия была зарегистрирована до или в течение 1-й недели после первой ИДЛ. Медиана продолжительности ЦМВ-виремии составила 4 (от 1 до 26) недели для пациентов экспериментальной и 3 (от 1 до 14) недели для больных контрольной группы соответственно, (критерий Манна-Уитни, p = 0,27). Медиана количества реактиваций ЦМВ-виремии – 1 (от 1 до 3) как для пациентов экспериментальной, так и для контрольной групп, (тест Фишера, p = 0,27). ЦМВ-болезнь диагностирована у 18 пациентов (25% общего числа пациентов с ЦМВ-виремией и 14% среди всех пациентов) экспериментальной группы и у 11 пациентов контрольной группы (23% от пациентов с ЦМВ-виремией и 12% среди всех пациентов), тест Фишера, p = 0,4. Наиболее часто осложнения в виде ЦМВ-хориоретинита выявлялись у пациентов с первичными иммунодефицитными состояниями (5 из 9 случаев). Необходимо отметить, что у 50% (n = 9) пациентов экспериментальной группы с ЦМВ-болезнью проводилась иммуносупрессивная терапия в рамках терапии (n = 5), либо плановой профиликтики оРТПХ (n = 4). Упреждающую фармакологическую противовирусную терапию ЦМВ-виремии препаратами ганцикловир либо фоскарнет получили 67 пациентов экспериментальной и 47 пациентов контрольной группы. Кумулятивная вероятность ЦМВ-виремии за 3-х летний период наблюдения среди пациентов экспериментальной группы составила 57% (95-й ДИ: 48-65), а у пациентов контрольной группы - 52% (95- й ДИ: 42-63), (тест Грея, p = 0,4), (рисунок 5). 100% 80% 60% 40% 20% 0% Кум.вер. ЦМВ-виремии экспер. гр. 57%, n = 131, 73 события. Кум.вер. ЦМВ-виремии контр. гр. 52%, n = 91, 47 события. тест Грея, p = 0,4 0123456 Контрольная группа Экспериментальная группа годы после ТГСК Рисунок 5. Кумулятивная вероятность ЦМВ-виремии у пациентов экспериментальной и контрольной группы Шесть пациентов экспериментальной группы с умеренной ЦМВ-виремией (до 5 х 103 коп/мл), не имевших данных за течение ЦМВ-болезни, не получавших иммуносупрессивную терапию, у которых по данным ELISPOT – исследования выявлялось более 5 ЦМВ-специфичных лимфоцитов на 300 х 103 мононуклеарных клеток крови, не получали лекарственную противовирусную терапию. После очередных введений СD45RA- деплетированных донорских лимфоцитов, спустя 2 – 4 недели, у всех шести пациентов произошла постепенная полная редукция ЦМВ-виремии без дальнейшей реактивации. АДВ-виремия диагностирована у n = 8 (6%) пациентов экспериментальной группы и у n = 4 (4%) больных контрольной группы. Среди пациентов экспериментальной группы АДВ-болезнь с поражением кишечника установлена у 4 пациентов, легких – одному пациенту, смешанное поражение кишечника и легких также выявлено у одного пациента, а из числа пациентов контрольной группы – n = 3 случая течения АДВ-болезни: с поражением печени (n = 1), легких (n = 1) и смешанного поражения ЦНС, печени и легких – у третьего пациента. Всем пациентам с АДВ-инфекцией проводилась терапия сидофовиром. ЭБВ-виремия обнаружена у одного пациента экспериментальной группы спустя 67 дней после ТГСК и 10 дней после ИДЛNo1 и у двоих пациентов экспериментальной группы. Ни в одной группе не было пациентов с ЭБВ- ассоциированным лимфопролиферативным заболеванием. В экспериментальной группе зарегистрировано два случая смерти от вирусных инфекций. Случаев смертельного исхода, непосредственной причиной которого являлась тяжелая вирусная инфекция, у пациентов, трансплантированных по поводу злокачественных заболеваний в экспериментальной группе не было. Вместе с тем, среди пациентов экспериментальной группы с незлокачественными заболеваниями, одна пациентка умерла от резистентной ЦМВ-пневмонии, а другая, длительно получавшая иммуносупрессивную терапию по поводу аутоиммунного гемолиза, умерла вследствие резистентного течения ЦМВ и АДВ-болезни с поражением легких и кишечника. Среди пациентов контрольной группы рефрактерная вирусная инфекция являлась непосредственной причиной смерти у 4 пациентов: резистентная ЦМВ-пневмония (n = 1), рефрактерная к терапии АДВ – болезнь (n = 3). 27 Основные исходы ТГСК Шесть пациентов экспериментальной группы и тринадцать пациентов контрольной группы умерли от причин, не связанных с прогрессией (рецидивом) основного заболевания и отторжением трансплантата. Кумулятивная вероятность трансплантационной смертности для больных экспериментальной группы составила 6% (95%-й ДИ: 2-14), а для пациентов контрольной группы - 14% (95%-й ДИ: 9-24), (тест Грея, p = 0,01), (рисунок 5). 100% 80% 60% 40% 20% Кум.вер. транспл. смертн. контр. группа 14%, n=91, 13 событий. Кум.вер. транспл. смертн. экспер. группа 6%, n=131, 6 событий. тест Грея, p = 0,01 0% 0123456 годы после ТГСК Контрольная группа Экспериментальная группа Рисунок 5. Кумулятивная вероятность трансплантационной смертности среди когорты пациентов экспериментальной и контрольной группы Два пациента экспериментальной группы, трансплантрованные по поводу апластической анемии и синдрома Вискотта-Олдрича, умерли вследствие течения прогрессирующей неконтролируемой вирусной болезни (ЦМВ, ЦМВ + АДВ) через 78 и 96 дней после ТГСК (9 и 13 дней после ИДЛ No 3), соответственно. У обоих пациентов вирус-специфические лимфоциты методом ELISPOT не были обнаружены ни в одной контрольной точке на протяжении всего периода наблюдения. Ретроспективный анализ аликвот обоих пациентов на предмет ЦМВ- и АДВ-специфичных лимфоцитов (ELISPOT) также показал отрицательный результат. Одна пациентка с врожденным дискератозом умерла через 3 года после ТГСК вследствие тяжелой дыхательной недостаточности на фоне прогрессирующего гепатопульмонального синдрома. Четверо пациентов с гемобластозами умерли по причинам, не связанным с прогрессией основного заболевания. Из тринадцати пациентов контрольной группы, умерших по причинам, ассоциированным с ТГСК, у деcяти больных ведущей причиной смерти являлась полиорганная недостаточность в исходе сепсиса. У 3-х больных из данной группы, в качестве сопутствующего осложнения, выявлена ЦМВ- пневмония. Трое пациентов контрольной группы умерли вследствие фульминантной рефрактерной АДВ-болезни с поражением печени (n = 1), легких (n=1) и смешанного поражения легких, печени и ЦНС. Общая 3-х летняя выживаемость для пациентов экспериментальной группы составила 80% (95%-й ДИ: 72-87), а для пациентов контрольной группы – 69% (95%-й ДИ: 60-79), (оценка Каплана-Мейера, p = 0,06), (рисунок 6). 100% 80% 60% 40% 20% 0% Рисунок 6. Анализ общей выживаемости среди пациентов Общая выживаемость экспер.гр. – 80%, n = 131, 106 живы. Общая выживаемость контр.гр. – 69%, n = 91, 62 живы, p = 0,06 0123456 годы после ТГСК Контрольная группа Экспериментальная группа экспериментальной и контрольной группы Кумулятивная вероятность развития рецидива основного заболевания среди пациентов экспериментальной группы, трансплантированных по поводу заболеваний злокачественной природы составила 25% (95%-й ДИ: 17-36), а у пациентов контрольной группы - 18% (95%-й ДИ: 10-34), (тест Грея, p = 0,37). Кумулятивная вероятность развития отторжения трансплантата среди пациентов экспериментальной группы, трансплантированных по поводу заболеваний незлокачественной природы составила 16% (95%-й ДИ: 8-30), а у пациентов контрольной группы - 15% (95%-й ДИ: 8-30), (тест Грея, p = 0,99). Общая иммунологическая реконституция В данной работе мы исследовали данные количественного восстановления основных субпопуляций T-лимфоцитов у пациентов экспериментальной (n=131) и контрольной группы в контрольных точках: с +30 cуток (t0) до +1 года после ТГСК (t4). В ходе анализа не продемонстрировано значимого отличия в темпе восстановления показателей линий CD3+, СD3+CD4+(T- хелперов) и СD3+СD45RA+СD197+(Т-наивных)–лимфоцитов среди пациентов экспериментальной и контрольной групп. Но, вместе с тем, в отдельных контрольных точках статистически достоверно подтверждено более быстрое восстановление CD3+CD8+T-лимфоцитов у пациентов, получавших инфузии СD45RA-деплетированных лимфоцитов, (рисунок 7). 1.4 1.2 0.8 0.6 Рисунок 7а t1 (+ 60 cутки) p = 0,02 Экспериментальная группа, n = 88 Контрольная 0.4 группа, n = 49 0.2 1.4 1.2 Рисунок 7б t2 (+ 90 cутки) 1.4 1.2 Рисунок 7в t3 (+ 120 cутки) p <0,0001 Экспериментальная группа, n = 82 0.8 0.6 0.4 0.2 p <0,0001 Экспериментальная группа, n = 90 0.8 0.6 Контрольная группа, n = 51 0.4 0.2 Контрольная группа, n = 38 Рисунок 7. Динамика восстановления T-цитотоксических лимфоцитов в контрольные точки: t1 (рисунок 7а), t2 (рисунок 7б), t3 (рисунок 7в) Вирус-специфическая иммунологическая реконституция У 35 (28%) пациентов экспериментальной группы, ЦМВ-специфические T-лимфоциты по данным ELISPOT-исследования были обнаружены еще до ИДЛ No1 (в контрольной точке t0). Среди 90 пациентов, у которых не были выявлены ЦМВ-специфические T-лимфоциты в контрольной точке t0, впоследствии, ЦМВ-специфические T-клетки появились впоследствии у 49 пациентов после одной из проведенных ИДЛ. АДВ-специфичные T-клетки были обнаружены у 68 (52%) больных, ЭБВ-специфичные T-лимфоциты - у 35 (27%) больных эскпериментальной группы. Анализ показал, что у 39 (80%) из 49 пациентов экспериментальной группы с детектируемым иммунным ответом к ЦМВ, была ЦМВ-виремия, в то время как из числа больных без ЦМВ-реактивности – у 8 (20%). Таким образом, согласно полученным данным, обнаружение ДНК ЦМВ в крови достоверно связано с восстановлением вирус-специфического иммунитета к ЦМВ (тест Фишера, p <0,0001). У пациентов с ЦМВ-T-реактивностью медиана 60 CD3+CD8+ х 106/мл 90 CD3+CD8+х 106/мл 120 CD3+CD8+х 106/мл дозы ЦМВ-специфичных T-лимфоцитов в ИДЛ составляла 44 клеток/кг (от 0 до 501 клеток) против 24 клеток/кг (от 0 до 3133 клеток) у пациентов, в крови которых ЦМВ-специфические лимфоциты не обнаружены (критерий Манна– Уитни, p = 0,69). Графическая визуализация темпов восстановления вирус– специфических лимфоцитов демонстрирует, что ЦМВ-специфичные T-клетки появляются у пациентов быстрее и их удельное количество больше чем АДВ и ЭБВ - специфичные (рисунок 8а, 8б, 8в). 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 8a p=1,0 p=0,003* p=0,004* p=0,9 p=0,9 p=0,9 0 ЦМВ0 ЦМВ1 ЦМВ2 ЦМВ3ЦМВ4 2000 1800 1600 1400 1200 1000 600 200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 p=0,9 600 400 200 0 p=0,4 p=0,5 8б 8в p=0,8 p=0,7 p=1,0 p=0,8 p=0,9 p=0,9 p=0,77 p=0,8 p=0,7 p=1,0 0 АДВ0 АДВ1 АДВ2 АДВ3 АДВ4 ЭБВ0 ЭБВ1 ЭБВ2 ЭБВ3 ЭБВ4 Рисунок 8а. Графическое отображение темпов восстановления ЦМВ - специфических лимфоцитов среди всех пациентов исследования (n=131) в контрольные точки t0 (перед ИДЛ No1) – t4 (+1 год) Рисунок 8б. Графическое отображение темпов восстановления АДВ - специфических лимфоцитов среди всех пациентов исследования (n=131) в контрольные точки t0 (перед ИДЛ No1) – t4 (+1 год) Рисунок 8в Графическое отображение темпов восстановления ЭБВ, - специфических лимфоцитов среди всех пациентов исследования (n=131) в контрольные точки t0 (перед ИДЛ No1) – t4 (+1 год) ELISPOT кл3*105 MNC В работе были исследованы факторы, гипотетически способные содействовать появлению ЦМВ-специфичных лимфоцитов у реципиентов алло-ТГСК с αβ Т-деплецией. Итоговый сравнительный однофакторный анализ среди 49 пациентов с ЦМВ-реактивностью и 40 пациентов без ЦМВ- реактивности показал, что только факт выявления ЦМВ-виремии, статистически достоверно ассоциирован с последующим появлением ЦМВ- специфичных T-лимфоцитов. Динамический анализ разнообразия репертуара T-клеточных рецепторов отдельной группы больных, получивших T-лимфоциты памяти Используя секвенирование последовательностей нуклеотидов TCRβ для идентификации T-клеточных клонов, мы проследили от 56 до 267 клонотипов TCR из ИДЛ в периферической крови реципиентов в контрольные точки t3 (30 дней после ИДЛ No3) и t4 (1 год после ТГСК). Для уточнения роли ИДЛ в становлении репертуара T-клеточных рецепторов реципиента, мы сравнили совпадения по клонам TCR в ИДЛ и периферической крови реципиентов ТГСК из настоящего исследования с группой исторического контроля. В репертуаре более 30.000 T-клеток каждого образца, мы обнаружили достоверно большее число клонов TCRβ, cовпавших в образцах крови реципиента и соответствующих ИДЛ, чем в образцах крови реципиентов и первичного T-деплетированного трансплантата из группы исторического контроля в аналогичных контрольных точках. В контрольной точке t3 медиана составила 103 (n = 9) и 21,5 (n = 10) клонов соответственно, критерий Манна- Уитни, p <0,01, а в точке t4: 70,5 (n = 12) и 23 (n = 9) клонов соответственно, критерий Манна-Уитни, p <0,01. Выявленное большее клональное сходство оставалось заметным и в последующем, после нормализации клонального разнообразия в каждом образце (рисунок 9). Рисунок 9. Выявленные в крови реципиентов клонотипы TCR из ИДЛ («ИДЛ+» n = 12, синий) («ИДЛ-», n=10, фиолетовый) (группа исторического контроля (Zvyagin и соавт., 2017). Нормализованное cовпадение между случайными парами образцов крови и ИДЛ пациента или первичных трансплантатов (серый цвет) показывает исходный уровень совпадения репертуара TCR для несвязанных образцов. Для когорты исторического контроля «ИДЛ-» контрольные точки - дни после ТГСК (ось X) По результатам секвенирования репертуара TCRβ было установлено, что клонотипы как СD3+CD4+ (T-хелперов), так и CD3+CD8+ (T- цитотоксических)-лимфоцитов из ИДЛ участвовали в формировании разнообразия репертуара TCR реципиентов ТГСК в обеих исследуемых временных точках (t3 и t4) (рисунок 10 a, b). Рисунок 10. Клонотипы субпопуляций T-цитотоксических лимфоцитов и T-хелперов из ИДЛ, впоследствии обнаруженные в периферической крови пациента. (a) Доля клонотипов с соответствующим фенотипом, обнаруженных в крови пациентов в контрольной точке t3. (b) Доля «константных», полученных с ИДЛ клонотипов, обнаруженных у пациентов в контрольных точках t3 и t4 Для глубокого изучения влияния клонов Т-клеток, трансфузированных в составе СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов, на восстановление противовирусного иммунитета реципиентов ТГСК, использовали «библиотеку», включающую 26000 последовательностей TCR, ассоциированных со специфичностью к различным вирусным антигенам. У 5 (45%) из числа пациентов, которым удалось провести данный анализ, некоторые из выявленных в ИДЛ клонотипов впоследствии прослеживались у реципиентов в точках t3 и t4, таким образом участвуя в формировании разнообразия репертуара TCR (рисунок 11). Рисунок 11. Динамика клонов вирус-специфичных Т-клеток в периферической крови пациента, полученных из ИДЛ Каждый клонотип представлен точкой, а клонотипы из ИДЛ, обнаруженные либо в t3 и (или) в t4 соединены линией. Вирус-специфические клонотипы TCRβ (к ЦМВ, ЭБВ, гриппу, ВПГ) из ИДЛ, обнаруженные в крови у реципиента отмечены синим цветом. Пунктирная горизонтальная линия показывает предел обнаружения. Показаны данные для трех репрезентативных пациентов Заключение Резюмируя изложенные выше результаты анализа, инфузии T-клеток памяти, выполненные после приживления трансплантата в дозах (расчет на CD3+) от 25×103 /кг до 100х103 /кг (для реципиентов гаплоидентичных трансплантаций), а также от 100×103 /кг до 100×103 /кг (для реципиентов полностью совместимых неродственных алло-ТГСК) являются безопасными. Ни у одного пациента исследуемой группы (n=131) не возникло каких-либо немедленных осложнений на введение клеточного продукта. Введение в терапевтический план посттрансплантационных профилактических инфузий Т-клеток памяти не привело к повышению риска активации оРТПХ и хРТПХ. Течение РТПХ в обеих исследуемых группах было преимущественно нетяжелым. Однако, наши результаты также свидетельствуют, что фракция T- клеток памяти (СD45RA-деплетированные лимфоциты) не лишена аллореактивного потенциала и может вызывать активацию РТПХ. Кумулятивная вероятность ЦМВ-виремии за 3-х летний период наблюдения в обеих группах была схожей и превышала 50% (тест Грея, p = 0,4). Данные продолжительности ЦМВ-виремии и количества реактиваций в обеих группах не имели достоверных отличий и коррелировали с ранее опубликованными данными анализа распространения герпес-вирусных инфекций у реципиентов ТГСК с депелецией  Т-лимфоцитов [Laberko и соавт., 2017]. Относительно высокая частота активации ЦМВ-виремии сравнима с результатами других трансплантационных центров, применяющих технологию T-деплеции, [Bhat и соавт., 2017, Bertaina и соавт., 2014]. Также установлено, что у 77% из числа пациентов экспериментальной группы с ЦМВ-виремией, инфекция была обнаружена до или в течении 1-й недели после первой ИДЛ. В этой связи для улучшения профилактического эффекта, необходимо исследовать возможность более ранних введений T-лимфоцитов памяти, в частности, как ко-инфузии с первичным трансплантатом. Терапевтический потенциал инфузий низких доз CD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов продемонстрирован на когорте из шести пациентов экспериментальной группы, у которых на разных этапах посттрансплантационного периода произошла постепенная полная редукция ЦМВ-виремии после очередных введений СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов. Случаи выявления АДВ-виремии были редки как у пациентов экспериментальной, так и контрольной группы (6% и 8% соответственно). В обеих группах случаи выявления ЭБВ-виремии у пациентов носили единичный характер, и ни в одной группе не было пациентов с ЭБВ-ассоциированным лимфопролиферативным заболеванием. Резюмируя основные клинические исходы, кумулятивная вероятность трансплантационной смертности была достоверно ниже в группе больных, получавших T-лимфоциты памяти, в сравнении с результатами, полученными в группе пациентов контрольной группы: 6% и 14% (тест Грея, p = 0,01). Общая 3-х летняя выживаемость для пациентов экспериментальной группы по результатам данной работы была достоверно выше, чем у пациентов контрольной группы. Как среди пациентов экспериментальной группы, так и контрольной группы, были выявлены случаи смерти от резистентных вирусных инфекций. Риск развития рецидива основного заболевания среди пациентов, получившим аллогенную ТГСК по поводу злокачественных заболеваний, существенно не различался между группами. Кумулятивный риск отторжения трансплантата у пациентов, трансплантированных по поводу незлокачественных заболеваний крови и патологии иммунитета, получавших T-лимфоциты памяти и у больных контрольной группы, оказался также схожим. В результате диссертационной работы получены данные относительно более быстрого восстановления субпопуляций T-цитотоксических лимфоцитов в контрольных точках с t1 (+60 после ТГСК) по t3 (+120 день после ТГСК) в сравнении с данными иммунологической реконституции пациентов, не получавшими ИДЛ памяти. Резюмируя данные динамики появления ЦМВ-специфических лимфоцитов, показано, что лишь ранняя экспозиция к вирусным антигенам может приводить к выраженной длительной экспансии T-клеток памяти. Согласно полученным данным, восстановление вирус-специфичного иммунного ответа к аденовирусной инфекции и вирусу Эпштейна-Барр, в сравнении с ЦМВ, оказалось значительно отсрочено. В данной работе мы напрямую смогли визуализировать и оценить клональную динамику донорских Т-лимфоцитов памяти в репертуаре реципиента после ТГСК и доказать их последующую успешную персистенцию в течение нескольких месяцев после заключительной ИДЛ. Таким образом, результаты настоящей диссертационной работы подтверждают эффективный потенциал инфузий низких доз T-лимфоцитов памяти в обеспечении трансфера донорского функционального Т-клеточного иммунитета реципиентам алло-ТГСК. Выводы 1. Применение инфузий СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов в дозах от 25 до 100х103/кг реципиентам гаплоидентичных и от 100 до 300х103/кг реципиентам неродственных совместимых аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с αβ Т и CD19- деплецией после приживления трансплантата безопасно и сопряжено с минимальным риском РТПХ, а также иных иммунных и токсических осложнений. 2. Инфузии донорских Т лимфоцитов памяти обеспечивают эффективный перенос вирус-специфичного иммунного ответа и обеспечивают становление иммунной защиты против ключевых вирусных патогенов. In vivo экспансия и персистенция вирус-специфичных лимфоцитов критически зависят от экспозиции к релевантному антигену. Инфузии донорских Т-лимфоцитов памяти способствуют более быстрому восстановлению абсолютного содержания CD8+ Т-лимфоцитов на ранних сроках после ТГСК (до дня +100) и существенно не влияют на восстановление других субпопуляций лимфоцитов. 3. Инфузии низких доз СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов реципиентам аллогенных ТГСК с αβ Т- и CD19-деплецией после приживления трансплантата не обеспечивают профилактику ЦМВ- виремии вследствие специфической кинетики реактивации ЦМВ. Монотерапия донорскими T-лимфоцитами памяти способна обеспечить постоянный контроль виремии в селектированной подгруппе пациентов. Применение инфузий донорских лимфоцитов памяти ассоциировано со снижением риска тяжелого течения и смертности от вирусных инфекций после ТГСК. 4. Применение инфузий низких доз СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов коррелирует со снижением кумулятивной вероятности трансплантационной смертности и повышением общей выживаемости реципиентов аллогенных ТГСК с αβ Т- и CD19-деплецией трансплантата. Вместе с тем, достоверных данных, подтверждающих уменьшение риска рецидивов онкогематологических заболеваний и событий отторжения трансплантата не получено. 5. Результаты исследования клональной динамики инфузируемых низких доз CD45RA–деплетированных донорских лимфоцитов подтверждают факт адоптивного трансфера донорской иммунологической памяти, в том числе - патоген-специфической, и верифицируют длительную (не менее 1 года) персистенцию перенесенных клонов реципиентам аллогенных ТГСК с αβ-Т-деплецией трансплантата. Практические рекомендации 1. Инфузии СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов могут применяться для переноса вирус-специфической иммунологической донорской памяти реципиентам αβ Т-деплетированных ТГСК от гаплоидентичных и неродственных совместимых доноров с целью обеспечения патоген-специфической иммунологической реконституции. 2. Дозы СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов, рекомендуемые для дальнейшего исследования и клинического применения при гаплоидентичной и неродственной cовместимой алло- ТГСК составляют от 25 до 100х103/кг реципиентам гаплоидентичных и от 100 до 300х103/кг реципиентам неродственных совместимых ТГСК. 3. Перед заготовкой донорских Т лимфоцитов памяти необходима оценка частоты вирус-специфичных лимфоцитов методом IFN- ELISPOT с целью предсказания технической возможности заготовки клеточного материала и терапевтической эффективности интервенции. 4. Метод оценки вирус-специфичного иммунного ответа (IFN- ELISPOT) рекомендуется к применению в клинической практике для определения кинетики становления вирус-специфического иммунитета у реципиентов алло-ТГСК, для оценки прогноза и эффективности терапии ключевых вирусных инфекций. 5. Для более глубокого изучения потенциала инфузий CD45RA- деплетированных донорских лимфоцитов в отношении профилактики ЦМВ-виремии у реципиентов αβ T-деплетированных алло-ТГСК, необходимо систематическое проспективное исследование применения ко-инфузий Т-лимфоцитов памяти совместно с первичным трансплантатом. 6. При использовании инфузий у реципиентов алло-ТГСК, ранее имевших проявления РТПХ, рекомендовано обеспечить период без иммуносупрессивной терапии не менее 2-х недель и использовать стартовую дозу 25х103/кг при гаплоидентичной ТГСК и 100х103/кг при неродственной ТГСК. 7. Применение инфузий низких доз СD45RA-деплетированных донорских лимфоцитов у реципиентов аллогенных трансплантаций в качестве монотерапии (без применения стандартного фармакологического лечения) ЦМВ-инфекции принципиально возможно, однако требует изучения в рамках проспективного исследования.