Оптимизация микробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных нетуберкулезными микобактериями, у пациентов с муковисцидозом

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Нетуберкулезные микобактерии (НТМ) представляют собой распространенную в окружающей среде группу микроорганизмов (МО), которая зачастую может стать причиной хронического инфицирования у пациентов с сопутствующими структурными изменениями дыхательных путей, такими как, например, при муковисцидозе (МВ). Поражение легких, вызванное НТМ, может представлять серьезную проблему, определяющую течение и исход основного заболевания у пациентов с МВ, с точки зрения развития инфекционных осложнений [52, 72, 115].
В настоящее время в мире во многих профильных центрах, занимающихся диагностикой и лечением пациентов с МВ, специалисты сталкиваются с самой распространенной группой быстрорастущих НТМ, встречающейся у пациентов с МВ, – представителями Mycobacterium abscessus complex (MABSc). В связи с морфологическими особенностями MABSc, обеспечивающими их устойчивость ко многим дезинфектантам, существует определенный риск распространения данной группы МО среди госпитализированных и амбулаторных пациентов, а экологические особенности этой группы микроорганизмов играют особую роль в проведении эпидемиологических исследований [77, 157].
Инфицирование МО часто связано с возрастом пациентов с МВ: по данным литературы, чем старше пациент, тем больше вероятность выделения у него НТМ из клинического материала. У 10-летних детей НТМ встречаются в 10% случаев, а у взрослых пациентов старше 40 лет – в более чем 30% случаев. У более 50% пациентов, у которых МВ был диагностирован во взрослом возрасте, НТМ колонизируют дыхательные пути. Наблюдается тенденция преобладания того или иного вида НТМ в зависимости от возраста пациента с МВ: Mycobacterium avium complex чаще выделяется от пациентов старше 25 лет, в то время как инфицирование бактериями MABSc характерно почти для всех возрастных групп
[8, 41, 100].
Также стоит отметить, что согласно данным некоторых исследований,
весомое количество случаев инфицирования микобактериями приходится на пациентов, которые находятся в возрасте 11-15 лет. У таких пациентов заболевание протекает тяжелее, а смертность выше, чем у инфицированных представителей более старшей возрастной группы, что связано с прогрессирующими темпами снижения функциональности легких [8].
За последние 40 лет было зафиксировано увеличение частоты распространения MABSc, выделенных из мокроты пациентов с МВ. Кроме того, относительная частота обнаружения бактерий MABSc в клиническом материале, собранном от пациентов с МВ, за последнее время значительно возросла как в США, так и в Европе, что скорее говорит о реальном изменении уровня инфицированности НТМ [85, 106].
НТМ могут вызвать прогрессирующее воспалительное поражение легких – заболевание, которое называется микобактериозом и характеризуется наличием специфических микробиологических, клинических и рентгенологических признаков. В свою очередь, в последнее время было доказано, что НТМ могут присутствовать в легких пациента с МВ временно, нерегулярно или постоянно, не вызывая при этом развитие микобактериоза и представляя собой бессимптомную инфекцию, обнаружение и диагностика которой в этом случае сопряжена со значительными трудностями. В связи с этим совершенствование и оптимизация микробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных НТМ у пациентов с МВ, играет важную роль в постановке диагноза микобактериоза, что ведет к определенной тактике антимикробной химиотерапии этой инфекции, а также к возможному уменьшению вероятности ее распространения [45, 57]. Цель исследования
Оптимизация методов выделения и идентификации быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий для улучшения микробиологической диагностики инфекционных осложнений у пациентов с муковисцидозом.
Задачи исследования
1. Проанализировать распространенность нетуберкулезных микобактерий в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом.
2. Выявить особенности культуральных свойств Mycobacterium abscessus complex, определить оптимальные сроки культивирования и возможность использования искусственной питательной среды с ростовой добавкой.
3. Оценить возможность идентификации с использованием MALDI-ToF масс- спектрометрии Mycobacterium abscessus complex, выращенных на различных питательных средах.
4. Провести анализ масс-спектров штаммов Mycobacterium abscessus complex, выделенных от пациентов с хроническим инфицированием, и определить дополнительный микробиологический критерий в оценке риска развития клинической картины микобактериоза у пациентов с муковисцидозом.
Методология и методы диссертационного исследования
Исследования, направленные на оценку культуральных свойств МО, их идентификация методом MALDI-ToF масс-спектрометрией, анализ полученных масс-спектров проводились на базе кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (зав. каф. – з.д.н. РФ, д.м.н., проф. А.В. Жестков). Методологический принцип исследовательской работы заключался в комплексном подходе оценки распространенности, особенностей культивирования и идентификации, анализа масс-спектров представителей
MABSc, выделенных из клинического материала от пациентов с МВ.
Первичный посев клинического материала от пациентов с МВ проводился на базе микробиологического отдела КДЛ Клиник ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав.лаб. – д.м.н., доцент О.А. Гусякова). Первичный посев клинического материала от пациентов, обследованных при подозрении на туберкулез, отбор культур, в которых были выявлены представители MABSc, и их идентификация с использованием метода ДНК-гибридизации проводились на базе бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер им. Н.В. Постникова» (зав. – врач-бактериолог высшей категории Т.П. Персиянцева). Подготовка к секвенированию и анализ хроматограмм проводились в отделе НТР ООО “ТестГен” (директор по науке – к.б.н., Д.А. Викторов). Секвенирование проводилось в ООО “Синтол” (г. Москва), куда направлялись подготовленные для секвенирования образцы (генеральный
директор – А.В. Кузубов).
В период с 2017 по 2020 год нами было проведено исследование 5547
образцов клинического материала, полученного от 1148 пациентов с МВ из различных регионов России. Всего от 21 пациента с МВ были выделены 56 штаммов представителей MABSc. В тот же период был исследован материал от 1707 пациентов при подозрении на туберкулез, в 515 образцах от 404 пациентов был выявлен рост микрофлоры с культуральными свойствами, характерными для НТМ. В 15 образцах от 13 пациентов были выделены НТМ по культуральным свойствам схожим с представителями MABSc.
Для выделенных штаммов было проведено определение оптимальных сроков культивирования, необходимых для выделения представителей MABSc из клинического материала от пациентов с МВ. Проведена оценка культуральных свойств представителей MABSc, выращенных на плотных питательных средах; дополнительно проведен анализ масс-спетктров с расчетом составного индекса корреляци. Установлены возможности идентификации MABSc и их оценка при культивировании штаммов MABSc на различных питательных средах путем сравнения масс-спектров, полученных при идентификации методом MALDI-ToF масс-спектрометрии. Дополнительно проведен анализ масс-спектров штаммов
MABSc, выделенных от пациентов с МВ, при хроническом инфицировании.
Все культуры выделенных микроорганизмов были идентифицированы с использованием метода MALDI-ToF масс-спектрометрии. У всех штаммов НТМ был проведен анализ масс-спектров, полученных при MALDI-ToF масс- спектрометрии с использованием программ flexAnalysis 3.0 и MALDI Biotyper 3.0
Offline Classification (Bruker Daltonik GmbH, Германия).
Проведена статистическая обработка результатов с учетом
распространенности МО в зависимости от вида клинического материала, количества представителей MABSc в зависимости от региона, видового разнообразия МО, выделенных совместно с MABSc, возраста и пола пациентов, сроков культивирования, R или S формы колоний, продуктивности и уровня коэффициента совпадения Score в зависимости от среды, а также количества пиков в зависимости от среды. Группировку данных и вычисления проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel® 2013. Статистический анализ проводили с использованием программы StatTech v. 2.1.0 (ООО “Статтех”, Россия).
Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых более 50). Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1 – Q3). Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, при условии равенства дисперсий выполнялось с помощью t-
критерия Стьюдента.
Для оценки статистической значимости влияния хромогенной среды на
показатели Score в зависимости от используемой библиотеки масс-спектров проводили расчет p-value для U-критерия Манна-Уитни, для которого были установлены статистически значимые различия (p<0,05). Сравнение трех и более групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью критерия Краскела-Уоллиса, связь между признаками статистически расценивали как значимую при уровне значимости (p<0,05). При оценке типа колоний в зависимости от показателя формы инфекционного процесса, анализе продуктивности в зависимости от среды, анализе показателя «продуктивность» в зависимости от показателя «среда/концентрация железа» использовали метод Хи-квадрат Пирсона, для которого были установлены статистически значимые различия (p<0,05). Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью точного критерия Фишера (при значениях явления менее 10). Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода, применялся метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определялось по наивысшему значению индекса Юдена. В работе проводился биоинформационный анализ масс-спектров выделенных культур с использованием программных пакетов flexAnalysis 3.0 и MALDI Biotyper 3.0 Offline Classification на базе MALDI-ToF масс-спектрометра Microflex LT (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Достоверность полученных результатов достигнута за счет применения в качестве методологической и теоретической базы фундаментальных трудов в области микробиологии; соответствия результатов современному уровню методик проведения исследований. Основные положения диссертации обсуждены на XIX Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии и клинической микробиологии (Москва, 2017), Российско-Китайском конгрессе по медицинской микробиологии, эпидемиологии и клинической микологии (XX Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2017), 38-м Ежегодном конгрессе Европейского общества микобактериологии (Шибенки, 2017), III Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2017), 24-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2017), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы пульмонологии детского возраста и взрослых пациентов с муковисцидозом» (Севастополь, 2017), Межрегиональной научно- практической конференции «Актуальные вопросы пульмонологии детского возраста и взрослых пациентов с муковисцидозом» (Сыктывкар, 2018), 29-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Амстердам, 2019), Научно-практической конференции «Муковисцидоз сегодня: от ребенка к взрослому» (Чебоксары, 2019), Всероссийском Конгрессе по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXIII Кашкинские чтения) (Санкт- Петербург, 2020), IV всероссийской молодёжной научной школе-конференции с международным участием «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2021), Всероссийской научно- практической конференции с международным участием «Новые технологии в развитии фтизиатрии и инфекционных заболеваний» (Москва, 2021). Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку научной гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования, формулировка цели и задач, разработка дизайна исследования проводились совместно с научным руководителем: д.м.н., доцентом А.В. Ляминым. Экспериментальные исследования, анализ полученных данных, их интерпретация, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях и конгрессах проводились совместно с сотрудниками кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (зав. каф. – з.д.н. РФ, д.м.н., профессор А.В. Жестков), бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер им. Н.В. Постникова» (зав. – врач- бактериолог высшей категории Т.П. Персиянцева), отдела НТР ООО "ТестГен" (директор по науке – к.б.н., Д.А. Викторов). Секвенирование проводилось в ООО "Синтол" (г. Москва), куда направлялись подготовленные для секвенирования образцы (генеральный директор – А.В. Кузубов). Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, статистическая обработка первичных данных, написание и оформление рукописи диссертации проведены лично диссертантом. Положения, выносимые на защиту 1. Распространенность представителей Mycobacterium abscessus complex среди пациентов с муковисцидозом включенных в исследование составила 1,8%, при этом доля пациентов, от которых были выделены Mycobacterium abscessus complex по Федеральным округам варьировала от 2,0% до 4,1%. В большинстве случаев Mycobacterium abscessus complex были выделены с другими клинически значимыми микроорганизмами. 2. При регулярном исследовании клинического материала от пациентов с муковисцидозом необходима продленная инкубация первичных посевов до 28 суток. Добавление железа (III) гидроксида полимальтозата повышает продуктивность среды для выделения Burkholderia cepacia complex в отношении штаммов Mycobacterium abscessus complex. 3. Использование универсальной хромогенной среды, содержащей триптофан и хромогены для выявления глюкуронидаз и галактозидаз, позволяет выявлять диссоциацию Mycobacterium abscessus complex по культуральным свойствам и повышает качество видовой идентификации с использованием MALDI-ToF масс- спектрометрии методом расширенного прямого нанесения. 4. Анализ масс-спектров штаммов Mycobacterium abscessus complex, выделенных от пациентов с муковисцидозом, может быть использован при прогнозировании развития микобактериоза в случае повторных высевов нетуберкулезных микобактерий. Научная новизна Впервые проведен анализ распространенности представителей MABSc, выделенных из клинического материала у пациентов с МВ в Российской Федерации, с использованием агаризованных питательных сред. Установлен материал, из которого наиболее часто были выделены представители MABSc. Проведено исследование распространенности MABSc отдельно по субъектам РФ, выявлены максимальные и минимальные показатели распространенности среди них. Проведена оценка видового состава МО, выделенных совместно с MABSc, а также доля пациентов, у которых были выделены MABSc, среди пациентов, обследованных на туберкулез. Впервые проведено исследование по установлению оптимальных сроков культивирования необходимых для выделения представителей MABSc, изолированных от пациентов с МВ. Проведена оценка культуральных свойств MABSc, выделенных на плотных питательных средах, и зависимости формы колонии от формы инфекционного процесса у пациентов с МВ. Впервые проведено исследование, направленное на установление влияния органической соли железа на продуктивность питательных сред, для выделения MABSc из клинического материала от пациентов с МВ. Установлено, что среда для выделения BCC с добавкой, содержащей железа (III) гидроксид полимальтозат, обладает высокой продуктивностью и может быть использована для выделения MABSc у пациентов с МВ. Впервые проведена оценка возможности идентификации с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии представителей MABSc, выделенных от пациентов с МВ, выращенных на различных питательных средах. Проведены оценка возможности использования MALDI-ToF масс- спектрометрии для проведения типирования представителей MABSc, выделенных на различных питательных средах, и сравнение полученных результатов с результатами секвенирования. Впервые проведен анализ масс-спектров штаммов представителей MABSc, выделенных от пациентов с МВ, при хроническом инфицировании. Значение коэффициента корреляции при сравнении масс-спектров двух последовательно выделенных штаммов MABSc может быть использовано при прогнозировании развития микобактериоза в случае повторных высевов нетуберкулезных микобактерий. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость исследования заключается в оптимизации методов выделения и идентификации быстрорастущих НТМ для улучшения микробиологической диагностики инфекционных осложнений у пациентов с МВ на примере MABSc. Определены оптимальные сроки культивирования, необходимые для выделения представителей MABSc из клинического материала от пациентов с МВ. Предложенные комбинации использования среды для выделения BCC и универсальной хромогенной среды при регулярном микробиологическом исследовании материала от пациентов с МВ позволяют выявлять диссоциацию MABSc по культуральным свойствам при развитии микобактериозов у пациентов с МВ. Введение добавки, содержащей органическую соль железа, позволяет повысить продуктивность среды для выделения BCC в отношении MABSc. Анализ масс-спектров штаммов MABSc, выделенных от пациентов с МВ, может быть использован при прогнозировании развития микобактериоза в случае повторных высевов нетуберкулезных микобактерий. Практическое значение состоит в том, что для выделения MABSc необходимо проведение пролонгированного культивирования первичных посевов клинического материала от пациентов с МВ (Патенты РФ No 2668406, Патенты РФ No 2711957). Для проведения длительной инкубации в течение 28 суток необходимо использование специальной лабораторной посуды (Патент РФ No 173302, Патент РФ No 175134, Патент РФ No 175863). Для повышения качества идентификации представителей MABSc необходимо использовать дополнительные инструменты, которые позволяют получать необходимое количество колоний для идентификации методом MALDI-ToF масс- спектрометрии (Патент РФ No 187404, Патент РФ No 187421). Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской деятельности кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии; детских инфекций; фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Результаты диссертационной работы используются в практической деятельности микробиологического отдела клинико-диагностической лаборатории КДЛ Клиник ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самарского областного центра по лечению муковисцидоза, расположенного на базе инфекционного отделения государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Самарская областная детская клиническая больница им. Н.Н. Ивановой» Министерства здравоохранения Самарской области, бактериологической лаборатории государственного бюджетного учреждения здравоохранения Самарской области «Тольяттинская городская клиническая больница No 5».