Роль гликопротеина муцина2 и его структурного компонента фукозы в регуляции барьерной функции кишечника

Животные, условия содержания, экспериментальные процедуры. Исследование было выполнено в Центре генетических ресурсов ИЦиГ СО РАН (уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0015). В исследовании использовали животных, свободных от специфических патогенов (расширенный список FELASA, Berard et al., 2014), а также животных, положительных на инфекцию Helicobacter spp. В процессе исследования у мышей Muc2-/- с инфекцией Helicobacter
spp. также был обнаружен микроорганизм, филогенетически близкий к видам, принадлежащим к роду Tritrichomonas. Tritrichomonas sp. детектировался у мышей с инфекцией, в список FELASA данные микроорганизмы не входят (Berard et al., 2014). Мышей содержали однополыми группами по 3-6 животных в индивидуально вентилируемых клетках (Optimice, США) при искусственном световом режиме 14С:10Т, при температуре 20-22°С, влажности 36%. В качестве подстилки использовали обеспыленную березовую стружку. Животные получали корм ssniff® R/M-H autoclavable V1534-3 (Ssniff, Германия) ad libitum. В качестве питьевой воды животным предоставляли стерильную деионизированную воду с добавлением минералов K+, Mg2+ («Северянка», Санкт-Петербург) ad libitum.
Были проведены семь экспериментов: эксперименты No1 и 2 проводили на мышах линий C57BL/6, свободных от патогенов, и Muc2-/- (с нокаутом гена Muc2), с инфекцией Helicobacter spp. В ходе выполнения эксперимента No2 у мышей Muc2-/- также был обнаружен микроорганизм Tritrichomonas sp. Дальнейшие эксперименты (No3, 4, 5, 6, 7) проводились на мышах Muc2-/- и Muc2+/+, рожденных с инфекциями Helicobacter spp. и Tritrichomonas sp., а также без инфекций. Мыши были получены от скрещивания мышей Muc2+/-. Мыши Muc2+/-, свободные от патогенов, были получены путем in vitro фертилизации с последующей подсадкой эмбрионов (Litvinova et al., 2017). Мыши Muc2+/- с инфекциями Helicobacter spp. и Tritrichomonas sp. были получены, путем трехкратного введения суспензии фекалий от зараженных животных мышам, свободным от инфекций (Схема заражения и скрещивания животных представлена на Рисунке 1).
Рисунок 1. А. Схема заражения мышей Tritrichomonas sp. (T.sp) и Helicobacter spp. (H.spp). Б. Схема скрещивания мышей.
8

В экспериментах мыши получали антибиотики согласно нескольким схемам: 1) ad libitum в течение двух недель с питьевой водой (смесь кларитромицина – 0,1875 мг/мл, метронидазола – 0,1875 мг/мл, амоксициллина – 0,5625 мг/мл); 2) раз в сутки путем внутрижелудочного введения в течение двух недель (суточная доза составляла 0,46 мг в день для кларитромицина и метронидазола, 1,38 мг для амоксициллина); 3) внутрижелудочно в течение 7 дней, а затем 7 дней с питьевой водой ad libitum. L- фукозу животные получали ad libitum с питьевой водой в концентрации 0,1% в сочетании с воздействием антибиотиками. Схемы предоставления антибиотиков были направлены на модуляцию кишечной микрофлоры: 1) обеднение симбиотической микрофлоры и элиминацию Helicobacter spp. (схема 1); 2) обеднение симбиотической микрофлоры и элиминацию инфекции Tritrichomonas sp. (схема 2); 3) обеднение симбиотической микрофлоры и недостаточное угнетение Tritrichomonas sp. (схема 3).
Оценка общего состояния животных и физиологических показателей. Для того чтобы оценить общее состояние в течение эксперимента, определялась масса тела мышей, а также оценивались внешние признаки, такие как состояние волосяных покровов, консистенция фекальных масс, наличие ректального кровотечения, подвижность животного. Клеточность крови и органов иммунной системы определялись путем подсчета клеток под микроскопом в камере Горяева, а также при помощи цитофлуориметра Guava easyCyte 8HT Flow Cytometer (Merck, Германия). Концентрацию внутриклеточных ферментов, концентрацию лактата в крови определяли при помощи коммерческих наборов (ОЛЬВЕКС Диагностикум, Россия) биохимическим методом.
Оценка иммунных показателей. Для оценки воспаления в кишечнике проводили гистологический анализ толстой кишки. Образцы фиксировали в 10% формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, последовательно проводили через бутанол и ксилол, а затем заключали в парафин. Готовили срезы толщиной 3мкм и окрашивали их с помощью двух окрашиваний: на ШИК-реакцию и азур-2-эозином (БиоВитрум, Россия). При помощи ШИК-реакции выявляли секрет бокаловидных клеток, а также количество ядер в крипте (анализ проводили на 15 криптах, выбранных случайным образом). При помощи окрашивания азур-2-эозином выявляли иммунные клетки и наличие признаков воспаления. Количество иммунных клеток считали в 15 полях зрения и выражали как N клеток/15 полей зрения.
Субпопуляции лимфоцитов в крови, тимусе, селезенке, мезентериальных лимфатических узлах (ЛУ) оценивали при помощи проточной цитофлуориметрии на цитометре Guava easyCyte 8HT Flow Cytometer (Merck, Германия). Для получения суспензии лейкоцитов крови, эритроциты лизировали при помощи гипотонического буфера, содержащего NH4Cl, и промывали натрий-фосфатным буфером, содержащим
2% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Для получения суспензии спленоцитов селезенку гомогенизировали, клетки пропускали через клеточные сеточки (размер пор 70 мкм), лизировали эритроциты и промывали. Для получения суспензии лимфоцитов тимуса и мезентериальных ЛУ органы гомогенизировали, пропускали клетки через клеточные сеточки (размер пор 70 мкм) и промывали. Лимфоциты анализировали при помощи окрашивания поверхностных маркеров лимфоцитов антителами с флуоресцентными метками (BioLegend, США). Для внутриклеточного окрашивания белка Foxp3 клетки фиксировали и пермобилизировали при помощи коммерческих реактивов True-NuclearTM Transcription Factor Buffer Set (BioLegend, США).
Количество иммуноглобулинов в кишечнике и крови, а также количество цитокина IL-1β определяли методом ИФА.
Экспрессию генов иммунных факторов в ткани толстой кишки оценивали при помощи метода количественной ПЦР в реальном времени по уровню кДНК, синтезированной с мРНК целевого гена, нормированному на кДНК, синтезированной с мРНК гена бета-тубулина (Tubb5) по формуле 2^(CtTubb-Ctцелевого гена). РНК из ткани толстой кишки выделяли при помощи TRIzol reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя, затем образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Roche, Германия) и осаждали 96% этанолом. Образцы кДНК получали путем проведения реакции обратной транскрипции с матрицы РНК при помощи обратной транскриптазы MulV (СибЭнзим, Россия) согласно рекомендациям производителя.
Оценка качественного и количественного состава микрофлоры кишечника. Состав бактериальной микрофлоры кишечника мышей оценивали путем анализа ДНК бактерий в фекалиях. ДНК из фекалий выделяли на SiO2, с использованием растворов для выделения ДНК (Qiagen, Германия). Для качественной оценки бактериальной микрофлоры использовали анализ SSCP ДНК гена 16S рРНК бактерий (за основу брали метод Schwieger and Tebbe, 1998). Количественный анализ бактериального состава микрофлоры проводили при помощи метода ПЦР в реальном времени. Метагеномный анализ кишечной микрофлоры проводили путем секвенирования гена 16S рРНК (регионы V3-V4) в образцах ДНК, выделенных их фекалий. ДНК для метагеномного анализа выделяли при помощи набора QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Германия), дальнейшая подготовка образцов (синтез ампликонов и создание библиотек), секвенирование на платформе Illumina и обработка данных осуществлялись компанией Novogene (Китай).
Для определения обнаруженного микроорганизма Tritrichomonas sp. было проведено секвенирование ДНК гена 18S рРНК по Сэнгеру (секвенирование проводили в ЦКП «Молекулярная и клеточная биология» ИМКБ СО РАН). В
результате секвенирования была получена последовательность ДНК длиной 1355 нуклеотидов. Полученную последовательность исследовали при помощи алгоритма поиска BLAST. Для филогенетического анализа отобрали 11 наиболее близких последовательностей, которые выровняли при помощи алгоритма MUSCLE и на основе выравнивания построили филогенетическое дерево при помощи онлайн- сервиса IQ-tree, а затем дерево визуализировали при помощи программы FigTree. Количественную оценку присутствия обнаруженного микроорганизма в кишечнике мышей проводили при помощи специфичных к отсеквенированной последовательности праймеров методом ПЦР в реальном времени.
Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи программного обеспечения Statistica 6.0. Выборки данных проверяли на нормальность распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. Динамика изменения массы животных была исследована при помощи анализа ANOVA с повторными измерениями (repeated measures ANOVA). Для анализа выборок, не описывающихся нормальным распределением, использовали непараметрические методы статистической обработки. Факторный анализ проводили методом Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test), сравнение между группами проводили при помощи критерия Манна-Уитни (Mann- Whitney U-test) и точного теста Фишера (Fisher exact test).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Дефицит муцина2 приводил к развитию хронического воспаления в
кишечнике у мышей
Анализ срезов ткани восходящего отдела толстой кишки не выявил признаков острого воспаления в кишечнике (отек, эрозия эпителия, лейкоцитарные инфильтраты) у мышей Muc2-/-, однако была обнаружена гиперплазия крипт, а также большее количество лейкоцитов по сравнению с мышами C57BL/6 (Рисунок 2). То есть, в кишечнике у мутантных мышей, даже в присутствии инфекционного агента Helicobacter spp., не было обнаружено активного воспалительного процесса, но наблюдались признаки хронического воспаления.
Рисунок 2. Анализ гистологических срезов ткани толстой кишки мышей. А. Фотографии препаратов, окрашенных на ШИК-реакцию, увеличение х400. Розовым цветом окрашен ШИК-позитивный секрет бокаловидных клеток. Б. Количественная оценка гиперплазии крипт (количество ядер в крипте). В. Общее количество лейкоцитов и количество полиморфноядерных лейкоцитов на срезах ткани толстой кишки. Количество животных в группе: Б,В – n(C57BL/6)=4, n(Muc2-/-)=4; Г – n(C57BL/6)=3, n(Muc2-/-)=6. * – p<0,05; Mann- Whitney U-test Исследование экспрессии генов, вовлеченных в воспалительные реакции, показало повышение экспрессии провоспалительных цитокинов Tnf и Il1b у мутантных мышей по сравнению с C57BL/6. Также было обнаружено увеличение экспрессии генов транскрипционных факторов Т-клеток Rorc (Th17) и Foxp3 (Treg), при этом экспрессия гена транскрипционного фактора Tbx21, характерного для Th1, не повышалась (Рисунок 3). Также было обнаружено, что в кишечнике мышей Muc2-/- была повышена экспрессия аргиназы1 – фермента макрофагов. Продукция этого фермента свойственна макрофагам 2-го типа (М2), которые характеризуются противовоспалительными свойствами, стимулируют восстановление поврежденных тканей, а также играют роль в процессах образования опухолей (Shapouri-Moghaddam et al., 2018). Также об усиленном восстановлении ткани кишки у Muc2-/- мышей свидетельствует увеличение экспрессии фактора trefoil factor 3 (Tff3), выделяемого бокаловидными клетками (Kim and Ho, 2010). Помимо этого, у Muc2-/- мышей было обнаружено повышение экспрессии гена Pstg2 (циклооксигеназы2). Фермент циклооксигеназа2 нарабатывается макрофагами и участвует в синтезе медиаторов воспаления, что стимулирует провоспалительные реакции иммунной системы. Таким образом, воспаление в кишечнике у мышей Muc2-/- можно охарактеризовать как хроническое воспаление c активацией как про-, так и противовоспалительных реакций, а также механизмов усиленного восстановления ткани. Рисунок 3. Экспрессия генов в ткани толстой кишки мышей Muc2-/- и C57BL/6 (относительное количество мРНК, изменение относительно C57BL/6, принятого за единицу). Количество мРНК целевого гена нормировано на количество мРНК бета-тубулина. Количество животных в группе: n(C57BL/6)=4, n(Muc2-/-)=8. * - p<0,05; ** - p<0,01; Mann- Whitney U-test В условиях нарушенной барьерной функции в кишечнике микроорганизмы могут вступать в более тесное взаимодействие с клетками хозяина, что может приводить к активации различных компонентов иммунной системы. Иммуноглобулины играют важную роль в иммунном ответе и выведении микроорганизмов из организма хозяина (Chen et al., 2020). Анализ иммуноглобулинов показал, что у Muc2-/- мышей было больше IgG в толстой кишке по сравнению с C57BL/6, при этом количество IgA не отличалось. Помимо этого, в крови у 13 мутантных мышей было обнаружено больше IgG против собственной кишечной микрофлоры, чем у C57BL/6 (Рисунок 4). Рисунок 4. Количество иммуноглобулинов в толстой кишке и крови мышей. А. Количество IgA и IgG в толстой кишке мышей. Б. Количество IgG против собственной кишечной микрофлоры, обнаруженного в крови мышей. Количество мышей в группе: для IgA – n(C57BL/6) =6, n(Muc2-/-) =8; для IgG – n(C57BL/6) =4, n(Muc2-/-) =8. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test Полученные результаты могут говорить о том, что из-за дефицита муцина2 в кишечнике Muc2-/- мышей, вследствие тесного контакта иммунной системы с микрофлорой, могут быть активированы различные иммунные механизмы, способствующие усиленному восстановлению ткани и поддержанию хронического воспаления в кишечнике. Обеднение бактериальной микрофлоры Muc2-/- мышей, рожденных с инфекцией, приводило к истощению и гибели Воздействие на микрофлору мышей антибиотиками широкого спектра действия (смесь кларитромицина, метронидазола, амоксициллина) приводило к сильному снижению массы тела мутантных мышей, около 37% мышей погибали (5 из 14 мышей). Мыши C57BL/6 к концу эксперимента восстанавливались, 100% из них выживали (8 из 8 мышей) (Рисунок 5). При этом прием антибиотиков вызывал значительное обеднение кишечной микрофлоры у мышей обеих линий. Стоит отметить, что инфекционный агент Helicobacter spp., который присутствовал у мутантных мышей, также угнетался антибиотиками (Рисунок 6). Рисунок 5. А. Динамика изменения массы тела мышей относительно первоначальной массы. *, *** - p <0,05; p <0,001; различия между «C57BL/6+АБ» и «Muc2-/-+АБ», Fisher LSD. Б. Процент выживших мышей. # – p<0,05; Fisher exact test Рисунок 6. Количество бактериальной 16S rRNA ДНК в фекалиях мышей C57BL/6 и Muc2-/-, нормированное на 28S rRNA ДНК мыши. А. Количество общей бактериальной ДНК 16S rRNA. Б. Количество ДНК 16S rRNA Bacteroides spp. В. Количество ДНК 16S rRNA Lactobacillus spp. Г. Количество ДНК 16S rRNA Helicobacter spp. ND – количество ДНК ниже уровня детекции. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test; #, ##, ### – p <0,05; p <0,01; p<0,001; Fisher exact test Помимо этого, в содержимом кишечника мышей Muc2-/- был обнаружен микроорганизм, который по морфологическим признакам был похож на представителя рода Tritrichomonas (Рисунок 7A). Для того чтобы точно определить принадлежность микроорганизма к Tritrichomonas spp. было проведено секвенирование ДНК гена 18S rRNA простейшего. Для полученной последовательности Tritrichomonas sp. clone Tsp1019 (загружена в базу данных GenBank, Accession Number MT804340) был проведен филогенетический анализ, который подтвердил близкое родство обнаруженного микроорганизма, к видам Tritrichomonas. Самыми филогенетически близкими оказались Tritrichomonas sp. strain L55, Tritrichomonas muris и Tritrichomonas musculis (Tritrichomonas sp. MEG- 2016a) (Рисунок 7Б). Таким образом, в кишечнике мышей Muc2-/- была не только инфекция Helicobacter spp., но и микроорганизм Tritrichomonas sp., который обнаруживался и у мышей, принимавших антибиотики. Присутствие этого микроорганизма при обеднении микрофлоры в условиях нарушенного барьера в кишечнике могло быть причиной истощения и гибели мутантных мышей. А. Б. 16 Рисунок 7. А. Микрофотография простейшего, Tritrichomonas sp. обнаруженного в содержимом кишечника мышей Muc2-/-. Ядро визуализировано при помощи красителя Hoechst 33258. Б. Филогенетическое дерево построено на основе анализа последовательности ДНК 18S rRNA Tritrichomonas sp. (clone Tsp1019) при помощи алгоритма BLAST. Воздействие антибиотиков на микрофлору свободных от инфекции Muc2-/- мышей не оказывало влияния на их жизнеспособность Для того чтобы выявить роль присутствия инфекций в наблюдаемой гибели мышей при обеднении бактериальной микрофлоры, мышей Muc2-/- освободили от инфекций путем редеривации. Оказалось, что обеднение бактериальной микрофлоры не приводит к гибели мутантных мышей, свободных от инфекций (выжили 10 из 10 мышей). Бактерии играют важную роль в поддержании гомеостаза в кишечнике за счет регуляции обновления эпителиальных клеток и репарации ткани (Park et al., 2016, Rakoff-Nahoum et al., 2004), а также за счет регуляции колонизации патогенами (Kamada et al., 2013). Мы предположили, что кишечные бактерии играют роль в регуляции протозойной инфекции Tritrichomonas sp. у мышей Muc2-/-. Примечательно, что антибиотики влияли на микрофлору мышей после редеривации несколько иным образом, нежели в предыдущем эксперименте. У мышей после антибиотиков Bacteroides spp. снижались, но оставались на детектируемом уровне (Рисунок 8). Вероятно, унаследованная от суррогатной матери микрофлора отличалась от микрофлоры мышей с инфекциями. Также реакция микрофлоры мышей Muc2-/- и Muc2+/+ на антибиотики была очень похожей. В связи с этим, в последующих экспериментах использовались мыши Muc2-/-, а также их однопометники Muc2+/+ в качестве контроля. Рисунок 8. Количество бактериальной ДНК в фекалиях Muc2-/- и Muc2+/+ мышей свободных от инфекции (относительно ДНК мыши 28S rRNA). А. Количество общей бактериальной ДНК 16S rRNA. Б. Количество ДНК 16S rRNA Bacteroides spp. В. Количество ДНК 16S rRNA Lactobacillus spp. ** - p<0,01; Mann-Whitney U-test Наличие муцина2 способствовало устойчивости к колонизации кишечника Tritrichomonas sp. Для того чтобы минимизировать материнские эффекты на микрофлору и иммунную систему, животных для дальнейших экспериментов получали путем гетерозиготного скрещивания. А поскольку редеривация привела к изменению микрофлоры, то мышей Muc2-/- с инфекциями получали от гетерозиготных животных без инфекций, зараженных путем внутрижелудочного введения суспензии фекалий от зараженных животных (схема получения животных представлена выше, на рисунке 1). Для того чтобы оценить выравнивание микрофлоры при такой схеме скрещивания, был проведен качественный анализ бактериального состава кишечника методом одноцепочечного конформационного полиморфизма ДНК гена 16S rRNA. Из результатов анализа, представленных на рисунке 9, видно, что микрофлора животных всех групп была очень похожа (большинство сигналов ДНК совпадали). При этом следует отметить, что такой подход выявляет наиболее представленные виды бактерий, но не исключает различий в количественной представленности отдельных видов. Рисунок 9. Качественный анализ бактериального состава микрофлоры (SSCP ДНК 16S rRNA) в фекалиях мышей Muc2-/- и Muc2+/+, рожденных с инфекциями и без. Помимо исследования бактериальной микрофлоры, был также проведен количественный анализ Tritrichomonas sp. в фекалиях. Оказалось, что у мышей Muc2+/+ с нормальной барьерной функцией колонизация кишечника микроорганизмом была значительно снижена по сравнению с мутантными однопометниками (Рисунок 10). Таким образом, муцин2 участвует в регуляции кишечной микрофлоры и защищает кишечник от колонизации простейшим. Рисунок 10. Количество ДНК Tritrichomonas sp. (относительно ДНК 28S rRNA мыши) в фекалиях однопометников Muc2+/+ и Muc2-/-. ND – количество ДНК ниже уровня детекции. # - p <0,05; Fisher Exact Test Элиминация инфекции Tritrichomonas sp. на фоне обеднения бактериальной микрофлоры кишечника способствовала выживанию Muc2-/- мышей Для того чтобы проверить предположение о роли кишечных бактерий в регуляции протозойной инфекции, была использована другая схема предоставления антибиотиков. Muc2-/- мыши, рожденные с инфекциями, получали смесь антибиотиков (кларитромицин, амоксициллин, метронидазол) ежедневно в течение двух недель путем внутрижелудочного введения. При этом используемая суточная доза антибиотиков соответствовала дозе из предыдущих экспериментов. Используемая концентрация метронидазола соответствовала той, которую применяют для подавления инфекций Tritrichomonas spp. у мышей (Cobo et al., 2011). Предоставление антибиотиков вызывало снижение массы тела мышей со 2-го по 5-й день эксперимента, а на 7-й день масса мышей восстановилась и не отличалась от контрольной группы. После двухнедельного приема антибиотиков мыши не демонстрировали истощения и гибели. Такой эффект сочетался со снижением количества ДНК Tritrichomonas sp. в фекалиях, а также обеднением бактериальной микрофлоры кишечника (Рисунок 11). Таким образом, обеднение бактериальной микрофлоры в сочетании с подавлением инфекции Tritrichomonas sp. не приводило к истощению и гибели Muc2-/- мышей. Такой результат подтвердил наше предположение о защитной функции бактериальной микрофлоры при нарушенном барьере кишечника. При инфицировании простейшие Tritrichomonas spp. прикрепляются к эпителиальным клеткам хозяина, что приводит к гибели клеток и, как следствие, к нарушению барьерной функции (Tolbert et al., 2016). Мы предположили, что нарушение бактериальной микрофлоры может приводить к усилению цитотоксического воздействия Tritrichomonas spp. в условиях отсутствия муцина2. Рисунок 11. Масса тела и микрофлора мышей Muc2-/-, рожденных с инфекциями, после внутрижелудочного введения антибиотиков. А. Изменение массы тела мышей. Количество мышей в группе: n(Muc2-/-инф/конт) =7; n(Muc2-/-инф/АБ-ВЖ) =6 *, *** - p <0,05; p <0,001; Fisher LSD test В. Количество 18S rRNA ДНК Tritrichomonas sp. и 16S rRNA ДНК бактерий в фекалиях мышей (относительно 28S rRNA ДНК мыши) ND – количество ДНК ниже уровня детекции. # - p<0,05; Fisher exact test; ** - p<0,01 Mann-Whitney U-test L-фукоза регулировала колонизацию кишечника Tritrichomonas sp. и предотвращала гибель Muc2-/- мышей с инфекцией при обеднении микрофлоры В следующем эксперименте была сделана попытка восстановить бактериальную микрофлору мышей путем добавления L-фукозы к антибиотикам. Мышам вводили антибиотики внутрижелудочно в течение 7 дней, а затем антибиотики добавляли в питьевую воду в течение следующих 7 дней. L-фукозу добавляли в питьевую воду на протяжении всего эксперимента (Рисунок 12А). При такой схеме обеспечивалось достаточное угнетение бактериальной микрофлоры, и недостаточное угнетение Tritrichomonas sp. Рисунок 12. Масса тела Muc2-/- мышей после приема антибиотиков и L-фукозы. А. Схема эксперимента. АБ – антибиотики. Б. Процент от первоначальной массы тела Muc2-/- мышей с инфекциями. *, **, *** - p <0,05; p <0,01; p <0,001 различия между группами «Muc2-/- инф+АБ» и «Muc2-/-инф/конт»; ##, ### - p <0,01; p <0,001 различия между группами «Muc2-/-инф+АБ/Ф» и «Muc2-/-инф/конт». Количество мышей в группе: n(Muc2-/-инф) =7; n(Muc2-/-инф+АБ) =8; n(Muc2-/-инф+АБ/Ф) =7; В. Процент восстановившихся мышей с инфекциями. Межгрупповые сравнения проведены при помощи Fisher exact test. Г. Процент от первоначальной массы тела Muc2-/- мышей без инфекций. *, ** - p <0,05; p <0,01 различия между группами «Muc2-/-+АБ» и «Muc2-/-конт» #, ## - p <0,05; p <0,01 различия между группами «Muc2-/-+АБ/Ф» и «Muc2-/-конт» Количество мышей в группе: n(Muc2-/-) =6; n(Muc2-/-+АБ) =7; n(Muc2-/-+АБ/Ф) =7. Д. Процент восстановившихся мышей без инфекций. Масса мутантных мышей с инфекцией во время внутрижелудочного введения антибиотиков сначала снижалась, а после семи дней приема антибиотиков мыши восстанавливались (аналогично предыдущему эксперименту). После смены метода предоставления антибиотиков (на 8-й день) мутантные мыши демонстрировали резкое снижение массы тела. При этом 50% мышей Muc2-/- с инфекцией, получавших антибиотики, на 13-й день эксперимента теряли до 35% массы тела относительно первоначальной массы (7 из 14 мышей). Интересно, что мутантные мыши с инфекцией, получавшие антибиотики в сочетании с L-фукозой (12 из 12 мышей), а также мыши дикого типа (10 из 10 мышей), не демонстрировали такого сильного ухудшения состояния и восстанавливались к концу эксперимента (Рисунки 12Б и 12В). Мыши Muc2-/- без инфекций также демонстрировали снижение массы тела во время приема антибиотиков, но полностью восстанавливались к концу эксперимента (13 из 13 мышей, Рисунки 12Д и 12Г). Антибиотики вызывали разнонаправленное изменение бактериальной микрофлоры Muc2-/- мышей с инфекцией и без нее, а L-фукоза не влияла на состав бактериальной микрофлоры Далее был исследован состав бактериальной микрофлоры мышей Muc2-/- при ее обеднении антибиотиками. Метагеномный анализ микрофлоры показал, что реакция бактериальной микрофлоры на предоставление антибиотиков различалась у мышей с инфекцией и без нее. У мышей Muc2-/-, свободных от инфекции, под действием антибиотиков разнообразие микрофлоры снижалось, при этом начинали преобладать Proteobacteria. У Muc2-/- мышей с инфекцией, разнообразие микрофлоры, наоборот, увеличивалось. Начинали детектироваться различные минорные таксоны (Рисунок 13). 22 Рисунок 13. Результат метагеномного исследования микрофлоры мышей Muc2-/- с инфекцией и без нее, до и после приема антибиотиков. Относительная представленность операционных таксономических единиц (ОТЕ – Phylum). Однако микрофлора мутантных мышей с инфекцией, получавших L-фукозу с антибиотиками, не отличалась по разнообразию от группы, получавшей лишь антибиотики. Таким образом, восстановление мутантных мышей при добавлении к антибиотикам L-фукозы не было связано с восстановлением бактериальной микрофлоры. L-фукоза регулировала колонизацию Tritrichomonas sp. на фоне обеднения бактериальной микрофлоры кишечника у Muc2-/- мышей Поскольку в предыдущих экспериментах истощение мышей было ассоциировано с Tritrichomonas sp., было проанализировано присутствие этого микроорганизма при воздействии антибиотиков и L-фукозы. На 8й день эксперимента, после введения антибиотиков внутрижелудочно, наблюдалось снижение количества Tritrichomonas sp. При этом изменение способа предоставления антибиотиков способствовало разрастанию этого микроорганизма. Интересно, что добавление L-фукозы отменяло данный эффект (Рисунок 14А). Рисунок 14. Количество ДНК 18S rRNA Tritrichomonas sp. в фекалиях и ткани толстой кишки мышей Muc2-/- после приема антибиотиков и L-фукозы. АБ(ВЖ) – антибиотики вводили внутрижелудочно; АБ – антибиотики добавляли в питьевую воду. А. Количество ДНК Tritrichomonas sp. в фекалиях на 8й и 15й дни эксперимента (относительно ДНК 28S rRNA мыши). *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test Б. Количество ДНК 18S rRNA Tritrichomonas spp в ткани толстой кишки на 15й день эксперимента (относительно ДНК 28S rRNA мыши). * - p<0,05 Mann-Whitney U-test; # - p,0,05 Fisher exact test Более того, было обнаружено, что у мышей, получавших антибиотики, увеличивалось количество ДНК Tritrichomonas sp. и в ткани толстой кишки по сравнению с мышами контрольной группы, а добавление L-фукозы нивелировало этот эффект (Рисунок 14Б). Таким образом, истощение Muc2-/- мышей, рожденный с инфекцией, было ассоциировано с разрастанием микроорганизмов Tritrichomonas sp. в кишечнике, которое сдерживалось добавлением к антибиотикам L-фукозы. L-фукоза корригировала эффекты антибиотиков на биохимические и иммунные показатели мышей Muc2-/- с инфекцией Разрастание Tritrichomonas sp. на фоне обеднения бактериальной микрофлоры и нарушенной барьерной функции в кишечнике могло приводить к повышению токсического воздействия на организм. У Muc2-/- мышей были исследованы внутриклеточные ферменты аланинаминотрансфераза (АЛТ) и аспартатаминотрансфераза (АСТ), а также количество лактата в крови. Повышение АСТ и АЛТ может говорить об обширной гибели клеток внутренних органов, в том числе, печени (Evans et al., 2009), а повышение уровня лактата является маркером сепсиса (Faix et al., 2013). Обеднение микрофлоры способствовало повышению концентрации АЛТ крови у Muc2-/- мышей независимо от присутствия инфекции (Рисунок 15А и 15В). Однако, концентрация АСТ увеличивалась только у мутантных мышей с инфекцией. Интересно, что добавление к антибиотикам L-фукозы нивелировало повышение АСТ (Рисунок 15А). Таким образом, изменение уровня АСТ в крови у мышей сочеталось с разрастанием Tritrichomonas sp. на фоне нарушения бактериальной микрофлоры. На количество лактата в крови обеднение микрофлоры не оказывало эффект ни в одной группе (Рисунок 15Б и 15Г). Рисунок 15. Количество АЛТ, АСТ и лактата в крови у мышей Muc2-/- с инфекцией и без нее, после воздействия антибиотиков и L-фукозы. А. Количество АЛТ и АСТ у мышей с инфекциями. Б Количество лактата у мышей с инфекциями. В. Количество АЛТ и АСТ у мышей без инфекций. Г. Количество лактата у мышей без инфекций. Количество мышей в группе для АЛТ и АСТ: n(Muc2-/-инф) =8; n(Muc2-/-инф+АБ) =6; n(Muc2-/-инф+АБ/Ф) =6; n(Muc2-/-) =8; n(Muc2-/-+АБ) =6; n(Muc2-/-АБ/Ф) =5; для лактата: n(Muc2-/-инф) =7; n(Muc2-/-инф+АБ) =8; n(Muc2-/-инф+АБ/Ф) =5; n(Muc2-/-) =6; n(Muc2-/-+АБ) =7; n(Muc2-/- АБ/Ф) =7. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test Нарушение микрофлоры и разрастание Tritrichomonas sp. может приводить к провоспалительным реакциям, поэтому мы оценили количество провоспалительного цитокина IL-1β в ткани толстой кишки у мышей, а также состояние мезентериальных лимфатических узлов (ЛУ). Обеднение микрофлоры приводило к увеличению количества IL-1β в ткани толстой кишки мышей Muc2-/- независимо от присутствия инфекций. L-фукоза нивелировала увеличение данного цитокина только у мышей с инфекцией Tritrichomonas sp. (Рисунок 16). Рисунок 16. Количество IL-1β в ткани толстой кишки у мышей Muc2-/- после воздействия антибиотиков и L-фукозы. Количество мышей в группе: n(Muc2-/-инф) =7; n(Muc2-/- инф+АБ) =6; n(Muc2-/-инф+АБ/Ф) =6; n(Muc2-/-) =7; n(Muc2-/-+АБ) =6; n(Muc2-/-АБ/Ф) =5. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test При исследовании иммунного статуса Muc2-/- мышей мы обнаружили увеличение процента регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+Foxp3+) в мезентериальных ЛУ у мышей с инфекциями по сравнению с мышами без инфекций. Регуляторные Т- клетки могут играть важную роль в регуляции воспаления в кишечнике мышей с нарушенной барьерной функцией, особенно при наличии инфекций. Нарушение кишечной микрофлоры антибиотиками приводило к снижению процентного состава данной субпопуляции у Muc2-/- мышей независимо от присутствия инфекции. Эти изменения, по-видимому, происходили за счет снижения экспрессии белка Foxp3 (Рисунок 17А и 17Б). При этом добавление L-фукозы не влияло на этот эффект, вероятно, угнетение регуляторной функции происходило из-за обеднения бактериальной микрофлоры, и протозойная инфекция не влияла на этот процесс. Обеднение микрофлоры приводило к снижению клеточности мезентериальных ЛУ (Рисунок 17В и 17Г). Аналогичное влияние было выявлено и на количество регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ (Рисунок 17Д и 17Е). При этом добавление L-фукозы отменяло снижение клеточности и регуляторных Т-клеток у Muc2-/- мышей с инфекциями (Рисунок 17В и 17Е). Вероятно, нарушение микрофлоры приводило к угнетению иммунной системы, а протозойная инфекция усугубляла этот эффект. Рисунок 17. Регуляторные Т-клетки мезентериальных ЛУ мышей Muc2-/- после воздействия антибиотиков и L-фукозы. А. Процентный состав субпопуляций лимфоцитов у мышей с инфекциями. Б. Процентный состав субпопуляций лимфоцитов у мышей свободных от инфекций. B. Количество клеток в ЛУ у мышей с инфекциями. Г. Количество клеток в ЛУ у мышей без инфекций. Д. Количество регуляторных Т-клеток в ЛУ мышей с инфекциями. Е. Количество регуляторных Т-клеток в ЛУ мышей без инфекций. Количество мышей в группе: n(Muc2-/-инф) =7; n(Muc2-/-инф+АБ) =8; n(Muc2-/-инф+АБ/Ф) =5; n(Muc2-/-) =6; n(Muc2-/- +АБ) =7; n(Muc2-/-+АБ/Ф) =6. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test Обеднение бактериальной микрофлоры приводило к изменению иммунного статуса мышей Обеднение микрофлоры антибиотиками может приводить к лейкопении, обусловленной снижением дифференцировки лейкоцитов в красном костном мозге вследствие недостатка сигналов от кишечной микрофлоры (Josefsdottir et al., 2017). Мы исследовали влияние нарушения бактериальной микрофлоры кишечника на иммунный статус мышей с дефицитом муцина2. Обеднение микрофлоры антибиотиками приводило к снижению клеточности тимуса (Рисунок 18) и селезенки (Рисунок 19А), уменьшению общего количества лейкоцитов, а также различных субпопуляций лимфоцитов в крови у мышей Muc2-/- (Рисунок 20А). Помимо этого, нарушение микрофлоры вызывало увеличение процента Т-клеток в селезенке (CD3+) и CD8+ Т-клеток в селезенке и крови (Рисунки 19Б и 20Б). При этом данный эффект наблюдался у Muc2-/- мышей независимо от присутствия инфекций. Таким образом, при нарушении микрофлоры антибиотиками наблюдалось угнетение иммунной системы, затрагивающее различные органы. Полученные результаты согласуются с полученными ранее данными об угнетении красного костного мозга (Josefsdottir et al., 2017) и указывают на важную роль бактериальной микрофлоры в функционировании иммунной системы. Рисунок 18. Влияние антибиотиков на количество тимоцитов у Muc2-/- мышей. Количество мышей в группе: n(Muc2-/-инф) =7; n(Muc2-/-инф+АБ) =6; n(Muc2-/-) =5; n(Muc2-/-+АБ) =7. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test Рисунок 19. Влияние антибиотиков на спленоциты у Muc2-/- мышей. А. Условное количество спленоцитов. Б. Процентное содержание субпопуляций спленоцитов. Количество животных в группе для «спленоциты» на рисунке А: n(Muc2-/-инф) =9; n(Muc2-/-инф+АБ) =7; n(Muc2-/-) =7; n(Muc2-/-+АБ) =7. Количество мышей в группе для «CD19+ - CD3+CD8+» на рисунке А и рисунка Б: n(Muc2-/-инф) =5; n(Muc2-/-инф+АБ) =7; n(Muc2-/-) =5; n(Muc2-/-АБ) =7. * - p <0,05; ** - p <0,01; Mann-Whitney U-test Рисунок 20. Лимфоциты в крови у Muc2-/- мышей после воздействия антибиотиков. А. Количество лимфоцитов в крови у мышей. Б. Процентное содержание лимфоцитов в крови у мышей. Количество мышей в группе: n(Muc2-/-инф) =7; n(Muc2-/-инф+АБ) =7; n(Muc2-/-) =5; n(Muc2-/-+АБ) =6. *, ** - p <0,05; p <0,01; Mann-Whitney U-test ВЫВОДЫ 1. Гликопротеин муцин2 способствует поддержанию барьерной функции кишечника и защищает от развития воспаления. У мышей с генетически обусловленным дефицитом муцина2 (Muc2-/-) в кишечнике развивается хроническое воспаление, активируются механизмы восстановления ткани (увеличение экспрессии Tff3, Nos2). 2. Муцин2 влияет на видовой состав микрофлоры кишечника, снижая колонизацию простейшим Tritrichomonas sp. 3. Симбиотическая бактериальная микрофлора кишечника играет важную роль в защите от цитотоксического воздействия протозойной инфекции Tritrichomonas sp. в условиях нарушенной барьерной функции. 4. Симбиотическая бактериальная микрофлора кишечника влияет на иммунную систему на местном и системном уровнях. Обеднение бактериальной микрофлоры приводит к снижению общего количества лимфоцитов и регуляторных Т-клеток в мезентериальных лимфатических узлах и активации провоспалительного ответа в кишечнике (повышение IL-1b). Помимо этого, при обеднении микрофлоры наблюдается лейкопения, снижение клеточности тимуса и сезеленки, а также перераспределение баланса CD4/CD8 в сторону CD8+ Т-клеток. 5. Компонент муцина2 моносахарид L-фукоза угнетает простейшее Tritrichomonas sp. в кишечнике у Muc2-/- мышей на фоне обеднения бактериальной микрофлоры. Механизмы влияния фукозы на колонизацию кишечника Tritrichomonas sp. не были установлены, но дальнейшие исследования в данной области могут способствовать разработке новых методов элиминации инфекции Tritrichomonas sp. 6. Прямое влияние L-фукозы на иммунную систему выявлено не было. L-фукоза корригировала изменение физиологических показателей (повышение IL-1β в кишечнике и АСТ в крови, снижение клеточности мезентериальных лимфоузлов), вызванное обеднением бактериальной микрофлоры у мышей с инфекцией Tritrichomonas sp. Однако, моносахарид не оказывал эффекта на исследованные показатели у мышей без инфекции. Таким образом, действие L-фукозы, вероятно, было обусловлено угнетением простейшего.