Активность ферментов в кишечнике и крови при разном уровне кальция в рационе кур-несушек

Эксперименты по изучению влияния разного уровня кальция на активность пищеварительных ферментов у кур-несушек в разных биологических средах были проведены в 2018-2020 годах в лаборатории физиологии ФНЦ «ВНИТИП» РАН. Исследования проводили в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS No123, Страсбург, 1986). Птицы находились в виварии ФНЦ «ВНИТИП» РАН при условиях кормления и содержания в соответствии с требованиями для определенных возрастных групп и кроссов птицы.
Хронические опыты проводились на курах-несушках коммерческого кросса Хайсекс белый начиная с 20-недельного возраста. Согласно методике 10 голов птицы, имели фистулу 12-типерстной кишки, для изучения ферментативной активности дуоденального химуса и определения уровня кальция, фосфора в нем. Для изучения ферментативной активности сока поджелудочной железы использовали птицу с фистулой панкреатического протока по Батоеву Ц.Ж. (1970) (5 гол.). Для изучения баланса и доступности кальция в кале и моче использовали птицу с фистулой подвздошной кишки (5 гол.). Для сравнения результатов использовали интактных кур в количестве 10 гол. В послеоперационный период птица находилась в индивидуальных клетках. К опытам приступали через 3-5 дней после операции, когда функционирование пищеварительных органов полностью восстанавливалось.
Для проведения хронических экспериментов использовали метод групп- периодов. Общая схема физиологического опыта представлена на рисунке 1.
В 20-28-недельном возрасте в первые 7 дней все группы птиц получали контрольный рацион с содержанием кальция 3,6%, а в 46-недельном и старше – с содержанием кальция 3,8%. После предварительного трехдневного адаптационного периода птицу переводили на опытный корм 1 с содержанием кальция в рационе 3,0%, затем аналогичным образом на опытный корм 2 с содержанием кальция 4,6% в рационе.
Опыт начинали утром в состоянии натощак, птицам давали по 30 г комбикорма, через один час после кормления у них брали пробы дуоденального химуса в количестве 2-3 мл, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 3 мин, разводили надосадочную жидкость в 10 раз раствором Рингера и определяли активность ферментов и содержание кальция и фосфора в данной жидкости.
Рисунок 1 – Схема опыта по изучению пищеварения в кишечнике и усвоению минеральных веществ рациона у кур-несушек
Динамику секреторной функции поджелудочной железы у кур-несушек исследовали с 30-минутным интервалом на протяжении трёх часов опыта. В первые 30 минут опыта у птицы натощак собирали панкреатический сок, после чего давали 30 г корма. В полученных порциях секрета определяли количество сока, активность амилазы, протеаз, липазы, щелочной фосфатазы, а также содержание кальция и фосфора.
Активность амилазы в дуоденальном химусе и поджелудочном соке устанавливали по гидролизу крахмала (Ц.Ж. Батоев, 2001) с использованием КФК-3, при длине волны 670 нм и выражали в мг расщепленного крахмала в 1 мл химуса или сока в течении 1 минуты. Протеолитическую активность химуса и сока определяли по гидролизу казеина при длине волны 450 нм на КФК-3 (Ц.Ж. Батоев, 2001). Активность липазы, щелочной фосфатазы, концентрацию кальция и фосфора в дуоденальном химусе и панкреатическом соке определяли с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Sinnowa BS- 3000P с соответствующим набором биохимических реактивов.
Показатели трипсина, щелочной фосфатазы, общего белка, глюкозы, кальция и фосфора в крови исследовали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Sinnowa BS-3000P с соответствующим набором биохимических реактивов. При этом кровь получали из подкрыльцовой вены в состоянии птицы натощак, в качестве антикоагулянта использовали 3,8 % раствор цитрата натрия, затем пробы центрифугировали при 5000 об/мин на протяжении 3 минут, для отделения форменных элементов от плазмы.
Изучение баланса минеральных веществ в организме кур-несушек выполняли двумя методами: классическим (Фисинин В.И. и др., 2013) в помете и илеальным (Вертипрахов В.Г. и др., 2019) в содержимом подвздошной кишки и моче.
Для статистической обработки результатов использовали компьютерную программу Excel и программное обеспечение JMP Trial 14.1.0, производитель SAS Institute, USA Carolina, с помощью которого выполняли расчет среднего значения (M), стандартные ошибки среднего (±SEM) и коэффициент корреляции. Достоверность различий устанавливали по t-критерию Стьюдента, различия считали статистически значимыми при p <0,05. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Активность пищеварительных ферментов, щелочной фосфатазы при различном уровне содержания кальция и фосфора в рационе кур-несушек Результаты исследования показывают, что при различном содержании кальция в рационе кур-несушек происходит изменение в активности пищеварительных ферментов в дуоденальном химусе (табл. 1). Таблица 1 – Активность пищеварительных ферментов в дуоденальном химусе кур-несушек разного возраста при разном уровне кальция в рационе (n=10, M±m) Период контрольный (содержание кальция в рационе 3,6%; 3,8 %) опытный 1 (содержание кальция в рационе 3,0%) опытный 2 (содержание кальция в рационе 4,6%) Показатель Амилаза, мг/мл.мин Протеазы, мг/мл.мин Липаза, ед/л Амилаза, мг/мл.мин Протеазы, мг/мл.мин Липаза, ед/л Возраст, 20-28 недель 932±47,4 43±2,5 944±97,0 Возраст, 46 недель и старше 916±48,3 36±2,5 1184±118,4 959±52,1 41±2,4 1310±91,1 981±56,4 46±2,0 1245±115,0 711±35,0* 45±1,6* 1531±133,1* 866±34,0 44±1,6 1619±116,2* Примечание -*- отличия достоверны по сравнению с контрольным периодом, при р≤0,05 Данные исследования показывают, что у кур-несушек в возрасте 20-28 недель, при увеличении количества кальция в корме до 4,6% активность амилазы дуоденального химуса снижается на 22,4% (р<0,05), активность протеаз, наоборот, повышается на 25,0% (р<0,05) и липазы - на 29,3% по сравнению с контрольным периодом. Снижение уровня общего кальция в корме приводит к уменьшению липолитической активности на 20,3%. В 46- недельном возрасте кур и старше достоверных изменений в активности амилазы и протеаз в дуоденальном химусе при использовании в рационе кур кальция в разных дозах не отмечено. При этом в опытный период 2 наблюдается достоверное повышение активности липазы на 23,6% (р<0,05). Анализ корреляции между показателями активности пищеварительных ферментов в дуоденальном содержимом и общим уровнем кальция в рационе показывает, что при оптимальном уровне кальция (3,6%) в корме у кур-несушек в 20-28-недельном возрасте наблюдается отрицательная корреляция между содержанием кальция в кишечнике и активностью амилазы (r=-0,54), липазы (r=-0,35) и протеаз (r=-0,36). В 46-недельном возрасте и старше у кур данные закономерности не наблюдались. Следовательно, можно считать, что активность пищеварительных ферментов связана с содержанием кальция в кишечнике птицы. Активность дуоденальных ферментов обусловлена секреторной функцией поджелудочной железы, протоки которой открываются в восходящее колено 12-перстной кишки и за сутки железа выделяет 28-32 мл панкреатического сока на 1 кг живой массы птицы (Батоев, 2001; Вертипрахов, 2014). Результаты исследования на курах с хронической фистулой панкреатического протока показали, что секреторная функция поджелудочной железы адаптируется к уровню кальция в рационе кур-несушек (табл. 2). Таблица 2 – Активность пищеварительных ферментов в панкреатическом соке у кур-несушек 46-недельного возраста (M±m, n=5) Период Показатель Амилаза, мг/мл.мин Протеазы, мг/мл.мин Липаза, ед/л 9342±729,6 320±30,4 18517±865,8 8683±720,9 262±26,8 15009±717,7* 8669±397,5 440±10,5* 19667±601,4 контрольный (содержание кальция в рационе 3,8 %) опытный 1 (содержание кальция в рационе 3,0%) опытный 2 (содержание кальция в рационе 4,6%) Количество панкреатического сока за опыт, мл 4,0±0,19 5,4±0,17* 4,7±0,16* Примечание - * - отличия достоверны по сравнению с контрольным периодом, при р<0,05 Результаты показали, что при снижении кальция в корме до 3,0% количество панкреатического сока увеличивалось на 35,0% (р<0,05) по сравнению с контрольным периодом. При увеличении уровня кальция в корме до 4,6% количество сока возрастало на 17,5 % (р<0,05). Анализируя активность панкреатических ферментов (табл. 2), можно заключить, что наблюдается адаптация ферментов к уровню содержания кальция в рационе. При снижении кальция до 3,0% в рационе достоверно снижается активность липазы – на 19% (p<0,05). При увеличении кальция до 4,6% в рационе происходит повышение активности протеаз на 37% (р<0,05) по сравнению с контрольным периодом. Содержание кальция (рис. 1) и активность щелочной фосфатазы (рис. 2) в панкреатическом соке находятся в прямой зависимости, коэффициенты корреляции в разные периоды имеют отличия: контрольный период (r= +0,35), опытный 1 (r= +0,62), опытный 2 (r= +0,67), а также в дуоденальном химусе при оптимальном (3,8%) содержании кальция в рационе (r= +0,42). На рисунке 1 видно, что содержание общего кальция в рационе не оказывает существенного влияния на его уровень в дуоденальном химусе (57- 60 ммоль/л), чего нельзя сказать о содержании кальция в панкреатическом соке, где его уровень достоверно изменяется (р<0,05) в опытный период 2 по сравнению с контролем. 7 6 5 4 3 2 1 0 2,2 5,8 2,5 панкреатический сок 5,7 2,1 химус КОНТРОЛЬНЫЙ ОПЫТНЫЙ 1 ПЕРИОД ОПЫТНЫЙ 2 Рисунок 1 - Концентрация кальция (ммоль/л) в панкреатическом соке и дуоденальном химусе *показатели концентрации кальция в химусе уменьшены в 10 раз Такую динамику кальция в панкреатическом соке относительно кишечника можно объяснить тем, что при увеличении содержания кальция в рационе он экстрагируется из крови с панкреатическим соком в кишечник и избыток выводится из организма с экскрементами. Активность щелочной фосфатазы в поджелудочной железе в 3-4 раза меньше, чем в дуоденальном содержимом (рис. 2). При использовании кальция в корме в количестве 3,0% активность щелочной фосфатазы увеличивается в панкреатическом соке на 36,7% (p<0,05) и при содержании кальция в корме выше нормы (4,6%) – на 12,8% по сравнению с контролем. В дуоденальном химусе наблюдаются снижение активности щелочной фосфатазы на 30,2% (p<0,05) и 27,7% (p<0,05) в опытный период 1 и 2 соответственно. 25000 20000 15000 10000 5000 0 20258 6680 14134 14647 ОПЫТНЫЙ 2 панкреатический сок химус КОНТРОЛЬНЫЙ ОПЫТНЫЙ 1 ПЕРИОД 9131 7539 Рисунок 2 – Активность щелочной фосфатазы (ед/л) в панкреатическом соке и дуоденальном химусе у кур-несушек Следовательно, уровень кальция в рационе может оказывать влияние на активность пищеварительных ферментов поджелудочной железы и щелочной фосфатазы, тем самым регулируя процесс пищеварения у птиц и усвоения минеральных веществ. Данные физиологического опыта по переваримости питательных веществ представлены в таблице 3. Таблица 3 - Переваримость основных питательных веществ и баланс азота при использовании в рационе кур-несушек разного количества кальция (n=10, M±m) контрольный (содержание кальция в рационе 3,6 %) опытный1 (содержание кальция в рационе 3,0%) опытный 2 (содержание кальция в рационе 4,6%) Показатель Сырой протеин, % Сырой жир, % Сырая клетчатка, % Баланс азота, % 91,0±0,41 91,8±0,52 22,3±4,40 39,1±6,00 Период 90,2±0,60 90,1±2,51 25±1,71 18,6±7,31 91,1±0,30 92,8±0,73 6,8±2,23* 23,6±5,20 *Примечание – различия достоверны по сравнению с контролем, при р<0,05 Результаты показали, что при использовании в рационе кур-несушек разного количества кальция переваримость питательных веществ корма была достаточно высокой и существенно не изменялась. Исключение составила сырая клетчатка, уровень которой значительно (15,5%, р<0,05) снижался при увеличении содержания кальция в корме до 4,6%. Этот период характеризуется значительным снижением активности амилазы в дуоденальном химусе (табл. 1). Хотя данный фермент не обладает специфичностью к целлюлозе, тем не менее этот факт указывает на снижение углеводного обмена и на наличие связи между перевариваем клетчатки и количеством кальция в рационе кур- несушек. Установлено, что переваримость сырого жира возрастает на 1,0 % при увеличении содержания кальция в рационе птицы до 4,6% и снижается на 1,7% при минимальном уровне кальция в рационе по сравнению с контрольным периодом. Возможно, что увеличение кальция, способствует лучшему гидролизу жиров в тонком отделе кишечника за счет повышения активности липазы в общем объеме панкреатического сока. Эти данные согласуются с положением о том, что усвоение кальция в организме птицы коррелирует с количеством жира в рационе (Бауман В.К.,1968). Анализ баланса азота показывает, что при оптимальном содержании кальция (3,6%) в рационе кур достигается максимальное использование азотистых веществ 39,1 %, по сравнению с показателями в остальных периодах, где использование азотистых веществ ниже на 20,5% в опытном периоде 1 (3,0% кальция в рационе) и на 15,5 % в опытном периоде 2 (4,6% кальция в рационе). Учитывая одинаковый уровень переваримости протеина, можно сделать вывод о том, что оптимальный уровень кальция (3,6%) в рационе кур- несушек оказывает влияние на белковый обмен, повышая усвоение протеина. 3.2 Использование илеального метода при оценке доступности кальция и фосфора в организме кур-несушек Вопросы определения усвоения кальция в организме кур-несушек актуальны, поскольку в имеющихся рекомендациях по питанию птицы (Фисинин В.И. и др., 2014) нет четких значений о доступности кальция в организме кур-несушек в отличие от общего фосфора. Нами впервые были выполнены сравнительные исследования по оценке доступности кальция классическим и илеальным методом в организме кур-несушек (табл. 4). Таблица 4 — Результаты балансовых опытов на интактных и оперированных курах-несушках Показатель Группа Контрольная (интактные куры) Опытная1 (илеальная фистула) Опытная 2 (дуоденальная фистула) кальций фосфор кальций фосфор кальций фосфор Потреблено с кормом, г 2,23 0,40 2,47 0,46 2,27 0,60 В дуоденальном химусе, г - - - - 2,28 0,14 Выделено с пометом, калом,г 1,29 0,30 1,10 0,22 1,70 0,40 Экстрагировано с мочой, г Усвоено организмом, г - - 0,02 0,01 - - 0,94 0,1 1,35 0,24 0,60 0,20 Выделено с яйцом, г 0,90 - 1,00 - 0,90 - Баланс, г 0,04 0,10 0,35 0,23 -0,30 0,20 % усвоения 42,1 25,0 54,6 51,1 26,4 33,3 Куры-несушки были подобраны по принципу аналогов и в период 12 эксперимента находились в одинаковых условиях содержания и кормления. Самый высокий уровень потребления кальция с кормом наблюдался в опытной 1 группе и составлял 2,47 г/сутки, в контрольной и опытной 2 группах показатели были ниже на 9,7% и 8,1%, соответственно. С учетом выделения кальция с экскрементами и яйцами баланс в илеальном методе был выше, чем при классическом определении и составлял 0,35 г/сутки с процентом усвоения 54,6%. Что касается фосфора, то следует отметить, что в 12-перстной кишке происходило интенсивное (по сравнению с кальцием) всасывание фосфора, где его содержание в сухом веществе химуса уменьшалось по сравнению с кормом в 4,3 раза и составляло 23,3% от исходной величины в 1 г корма. В итоге баланс общего фосфора имел наибольшее значение по результатам илеального метода и процент его усвоения организмом кур достигал 51,1%. Итак, у кур-несушек, имеющих фистулу подвздошной кишки процент усвоения кальция и фосфора, находился на самом высоком уровне, что свидетельствует о наиболее полной оценке физиологических процессов, происходящих в организме кур при использовании илеального метода. Данный метод позволяет изучать метаболизм кальция раздельно в кишечнике и моче, что дает возможность более точно определить доступный общий кальций корма, способный всасываться из кишечника в кровь. 3.3 Особенности использования кальция и фосфора у кур-несушек в разном возрасте при разном уровне кальция в рационе Сравнительный анализ показал, что с возрастом птицы происходило изменение в усвоении кальция (табл. 5). Если судить по усвоению кальция организмом кур, то в возрасте 20-28 недель показатель выше на 33,2%, чем в 46-недельном возрасте. Возможно, это связано с активными ростовыми процессами в организме молодой птицы, формированием репродуктивной системы, скелета и началом яйцекладки. Результаты показывают, что баланс кальция в организме кур-несушек зависит от уровня кальция в рационе. Так, при содержании кальция в корме 3,6% отмечается положительный баланс кальция и фосфора, при этом усвоение кальция в организме кур составляет 56,4%. При снижении кальция в рационе до 3,0% наблюдается отрицательный баланс кальция (-0,36) и снижение усвоения кальция до 24,7%, что может привести к нарушению минерального обмена в организме кур. Следовательно, для кур-несушек более критичным является недостаток в корме кальция, чем его избыток. Приведенные данные свидетельствуют о том, что в возрасте 46 недель и старше у несушек кальциевый обмен существенно изменяется по сравнению с более ранним возрастом. Результаты показали, что с возрастом увеличивается потребление кальция с кормом и одновременно выделение из организма. Так, в возрасте 20-28 недель усвоение составляет 56,4%, в возрасте 46 недель этот показатель снижается до 21,4%, что при одинаковой яйценоскости в старшем возрасте кур вызывает отрицательный кальциевый баланс. При снижении уровня кальция в рационе до 3,0% наблюдается его интенсивное выделение с экскрементами (75-67%), что значительно превышает контрольный уровень в возрасте 20-28 недель (42,8%). Таблица 5 - Баланс кальция и фосфора в организме кур-несушек разного возраста в рационах с разным количеством кальция контрольный (содержание кальция в рационе 3,6%) опытный 1 (содержание кальция в рационе 3,0%) опытный 2 (содержание кальция в рационе 4,6%) Показатель Период кальций фосфор кальций Возраст, 20-28 недель кальций фосфор 2,80 0,46 1,20 0,22 1,60 0,24 0,02 0,005 1,58 0,235 0,90 - +0,68 +0,23 56,4 51,1 фосфор Потреблено кальция, г/сут Выделено с калом, г Абсорбировано, г Экстрагировано мочой, г Усвоено организмом, г Выделено с яйцом, г Баланс, г % усвоения Потреблено кальция, г Выделено с калом, г 2,18 0,37 3,10 0,43 1,64 0,22 2,17 0,24 0,54 0,15 0,93 0,19 с 0,02 0,02 0,03 0,54 0,15 0,90 0,90 - 0,90 - 0,005 0,185 -0,36 +0,15 0 +0,18 24,7 40,0 29,0 43,0 Возраст 46 недель и более Абсорбировано, г Экстрагировано мочой, г Усвоено организмом, г Выделено с яйцом, г Баланс, г % усвоения 3,03 0,61 2,55 2,36 0,27 1,72 0,67 0,34 0,83 0,02 0,005 0,02 0,65 0,335 0,81 0,90 - 0,90 -0,25 +0,33 -0,09 21,4 54,9 31,8 0,41 3,90 0,60 0,18 2,60 0,28 0,23 1,30 0,32 с 0,005 0,02 0,225 1,28 - 0,90 - 0,005 0,315 +0,22 +0,38 +0,31 54,9 32,8 52,5 При увеличении кальция в рационе до 4,6% возрастает потребление кальция с кормом, выделение с калом остается на высоком уровне (70-67%), что значительно снижает показатель усвоения кальция в возрасте 20-28 недель и повышает усвоение кальция в более старшем возрасте (46 недель). Результаты опытов показали, что баланс фосфора у 20-28-недельных кур- несушек при уменьшении кальция в рационе до 3,0% снижается с 0,23 до 0,15 единиц, а при увеличении кальция в рационе до 4,6% в корме баланс фосфора повышается до 0,18. В 46-недельном возрасте и старше тенденция снижения и повышения уровня баланса фосфора в организме у кур-несушек сохраняется, разница состоит в том, что при уменьшении кальция в рационе показатель снижается с 0,33 до 0,22, а при увеличении - повышается до 0,31. Таким образом, баланс кальция в организме кур-несушек изменяется с возрастом, при этом: - усвоение организмом кальция уменьшается с 56,4% в 20-28-недельном возрасте до 21,4% в 46-недельном возрасте; - при снижении потребления кальция (3,0% от корма) у кур старшего возраста (46 недель) отмечается более быстрая адаптация, которая характеризуется повышением усвоения кальция на 7,1% по сравнению с курами 20-28-недельного возраста; - при увеличении потребления кальция (4,6% от корма) куры старшего возраста реагируют повышением кальциевого обмена при положительном балансе, в то время как куры 20-28-недельного возраста отстают, имея нулевой баланс. 3.4 Взаимосвязь активности пищеварительных ферментов в кишечнике кур с процессом яйцекладки Мощным регулятором обмена кальция в организме кур является яйцекладка, поэтому одной из задач исследования явилось изучение активности пищеварительных ферментов и щелочной фосфатазы в период снесения яйца. Единство механизмов регуляции вегетативных и других функций в организме животных достигается за счет контроля со стороны центральной нервной системы, которая функционирует согласованно с гуморальными центрами. Примером такой взаимосвязи служит гипоталамо-гипофизарная система, которая регулирует процесс формирования и выведения яйца в организме кур. Трудно себе представить, чтобы такой сложный процесс яйцеобразования происходил в отрыве от пищеварительной деятельности. Поскольку опытные куры были сложнооперированными, то интенсивность яйценоскости у них была очень низкая (<30%). Изучение вопросов взаимосвязи активности пищеварительных ферментов с содержанием кальция в биологических жидкостях кур-несушек поставило перед нами задачу — выполнить анализ динамики активности пищеварительных ферментов в момент яйцекладки. Исследования выполняли на курах с хронической фистулой 12-перстной кишки по определению активности пищеварительных ферментов в двенадцатиперстной кишке во время яйцекладки до и после снесения яйца. Дуоденальный химус от кур получали ежедневно утром через час после кормления. Для анализа брали дуоденальный химус, когда куры несли яйца в утренние часы. Результаты исследований показывают, что в период снесения яйца активность пищеварительных ферментов у кур-несушек значительно снижалась по сравнению с периодом за сутки до снесения яйца (табл.6). Из таблицы 6 видно, что активность амилазы в период снесения яйца снижается на 32,7% по сравнению с фоновым уровнем, на следующие сутки без яйцекладки амилолитическая активность в дуоденальном содержимом возвращается к исходному уровню. Протеолитическая активность также в момент снесения курицей яйца уменьшается на 33,3%, а на следующий день возвращается к исходной активности. В изменениях липазы, связанных с яйцекладкой, наблюдается более резкий спад по сравнению с предыдущими ферментами: здесь снижение достигает 65,0% по сравнению с фоновой активностью. Подъем после яйцекладки на следующие сутки оказывается существенно ниже фонового значения (на 45,0%, р<0,05). Следовательно, в момент откладывания яйца у несушек активность дуоденальных ферментов значительно уступает фоновому периоду, что согласуется с показателями секреторной функции поджелудочной железы кур-несушек (Вертипрахов В.Г., 2021). Таблица 6 - Активность пищеварительных ферментов в дуоденальном химусе у кур-несушек в период до, в момент и после снесения яйца Номера кур 11 12 13 17 Среднее 11 12 13 17 Среднее 11 12 13 17 Среднее до снесения яйца Период в момент снесения яйца после снесения яйца 1020±83,5 1130±105,6 763±46,0 1095±51,5 1002±59,8* 41±3,2 46±4,6 40±2,5 39±3,7 42±1,1* 1,0±0,01 1,3±0,16 1,2±0,07 1,0±0,12 1,1±0,07* 1462±104,2 930±95,8 759±81,9 1503±73,1 1164± 159,5* 834±59,6 779±77,7 624±94,2 894±61,8 783±40,6 активность амилазы, мг/ мл.мин активность протеаз, мг/ мл.мин 46±5,5 33±3,5 50±8,5 36±8,0 32±3,5 23±2,9 53±6,4 29±5,5 45±3,3* 30±2,1 активность липазы, мкмоль/мл.мин 1,9±0,36 2,5±0,39 0,8±0,09 2,8±0,31 2,0±0,31* 0,6±0,08 0,7±0,11 0,6±0,13 0,8±0,16 0,7±0,03 Примечание - различия с показателем в момент снесения яйца достоверны, при * - р<0,05 Данные по изменению активности щелочной фосфатазы в процессе яйцекладки представлены в таблице 7. Результаты показали, что в момент снесения яйца у кур-несушек активность щелочной фосфатазы в кишечнике значительно возрастает. В день яйцекладки активность щелочной фосфатазы увеличивалась на 59,4% по сравнению с фоновой активностью. На следующие сутки в период без яйцекладки активность фермента снижается до исходного уровня. Содержание общего кальция и фосфора в дуоденальном химусе в период яйцекладки существенно не изменяется, что можно объяснить постоянной величиной указанных макроэлементов в рационе. Следовательно, повышение активности щелочной фосфатазы в кишечном содержимом несушки является признаком момента снесения яйца. В предыдущих работах мы установили обратную зависимость между активностью пищеварительных ферментов и активностью щелочной фосфатазы в панкреатическом соке (Вертипрахов В.Г., Кислова И.В., 2019). Таблица 7 - Активность щелочной фосфатазы и содержание кальция и фосфора в дуоденальном химусе у кур-несушек в период до, в момент и после снесения яйца No курицы 11 12 13 17 Среднее 11 12 13 17 Среднее 11 12 13 17 Среднее до снесения яйца Период в момент снесения яйца после снесения яйца 15161±2595,4 11892±2828,4 7635±711,9 14123±7124,0 12202±1219,6* 58±4,9 45±5,7 52±3,5 39±3,5 49±3,3 7,0±0,66 4,7±0,03 3,4±0,55 5,5±0,27 5,2±0,55 26577±3790,4 13294±4564,0 13039±1200,3 13027±2289,6 16484±2523,2* 32831±3287,0 14427±8498,9 29778±1881,0 28060±4446,4 26274±2961,7 активность щелочной фосфатазы, ед/л содержание кальция, ммоль/л 55±0,7 58±7,7 54±2,3 61±0,4 50±3,1 58±2,8 36±4,1 43±5,8 49±3,2 55±3,0 содержание фосфора, ммоль/л 4,7±0,92 4,7±0,86 5,3±0,63 4,3±0,43 3,5±0,84 4,5±0,74 4,4±0,38 4,5±0,86 4,5±0,26 4,5±0,05 Примечание - * различия с показателем в момент снесения яйца достоверны, при *- р<0,05 Таким образом, установлена взаимосвязь процессов яйцекладки и активности пищеварительных ферментов у кур-несушек. Результаты исследования позволяют заключить, что для кур-несушек доминантой является процесс яйцекладки, который тормозит активность пищеварительных ферментов в кишечнике в момент снесения яйца. Однако это временное снижение активности ферментов компенсируется увеличением их активности при следующем приеме корма, что обеспечивает интенсивный гидролиз питательных веществ в организме птицы. Установлена обратная зависимость активности пищеварительных ферментов и щелочной фосфатазы в кишечнике в момент снесения яйца (протеазы (r=-0,57), липаза (r=-0,35)). Результаты имеют практическое значение и должны учитываться при выполнении физиологических опытов по изучению физиологии пищеварения на курах- несушках, в производственных условиях полученные данные являются физиологической основой для оптимизации режима кормления птицы. 3.5 Биохимический состав крови у кур-несушек, содержащихся на кормах с разным количеством кальция Метаболизм кальция и фосфора в организме невозможно представить без показателей крови, которая выполняет транспортную функцию и переносит макроэлементы от пищеварительной системы к органам и тканям. Данные по биохимическим показателям крови кур-несушек представлены в таблице 8. Результаты исследований показывают, что содержание кальция в крови возрастает на 55,0% при увеличении уровня кальция в корме. Такая закономерность отмечается у кур-несушек в 20-28-недельном возрасте. В возрасте 46 недель и старше, изменений содержания кальция в крови кур на фоне разных по уровню кальция рационов не установлено. Что касается других биохимических показателей крови, то в наших опытах наблюдалось усиление метаболизма при уменьшении в корме кальция до 3,0%. В этом случае в 20-28-недельном возрасте у кур увеличивалось количество общего белка на 18,7%, глюкозы – на 28,6%, снижается количество фосфора в крови более, чем в 2 раза. В 46-недельном возрасте кур-несушек реакция биохимических показателей на уменьшение в рационе кальция несколько отличается: наблюдается снижение активности трипсина в крови на 44,1%, значительно увеличивается активность щелочной фосфатазы (на 172,7%), при этом снижается уровень глюкозы (на 21,3%) и повышается количество общего фосфора на 50,0% по сравнению с контрольным периодом. При снижении уровня кальция в кормах 46-недельных кур-несушек отмечается высокая активность щелочной фосфатазы, что указывает на нарушение метаболизма в костной ткани, поскольку уровень фермента в кишечнике, наоборот, снижается. Таблица 8 - Биохимические показатели крови кур-несушек разного возраста и содержащихся на кормах с разным количеством кальция Период Возраст кур 20-28 недель 150±34,0 2343±348,1 38±1,4* 9±0,7* 1,9±0,30 0,3±0,04* Возраст кур 46 недель и старше 89±14,1* Щелочная фосфатаза, ед/л Общий белок, г/л Глюкоза, ммоль/л Кальций, ммоль/л Фосфор, ммоль/л Примечание - * разность с контролем достоверна, при p<0,05 контрольный (содержание кальция в рационе 3,6%; 3,8 %) опытный 1 (содержание кальция в рационе 3,0 %) опытный 2 (содержание кальция в рационе 4,6 %) Показатель Трипсин, ед/л Щелочная фосфатаза, ед/л Общий белок, г/л Глюкоза, ммоль/л Кальций, ммоль/л Фосфор, ммоль/л Трипсин, ед/л 165±16,4 1816±279,3 32±1,8 7±0,2 2,0±0,10 0,7±0,05 159±20,1 250±53,1 2364±683,2 36±1,9 8±0,5 3,1±0,20* 0,6±0,07 117±15,2 2254±214,1 32±0,6* 6,7±0,30* 2,5±0,20 0,8±0,04* 2299±278,2 37±0,8 9,4±0,20 3,0±0,20 0,6±0,03 6270±1577,0* 38±1,2 7,4±0,10* 2,9±0,30 0,9±0,07* В исследованиях, проводимых нами на курах-несушках, также установлена корреляция между протеазами, щелочной фосфатазой в дуоденальном химусе (r=-0,61), панкреатическом соке (r=-0,63), а также между трипсином в крови (r=-0,28). На основании корреляции между активностью трипсина и щелочной фосфатазы был предложен фосфатазно-протеазный индекс (ИФП) (патент на изобретение РФ No2742175 от 02.02.2021), который рассчитывается как отношение активности щелочной фосфатазы (АЩФ) к активности протеаз (АП) – трипсина по формуле: АЩП ИФП АП где АЩФ – активность щелочной фосфатазы, ед/л, АП – активность протеаз, трипсина, ед/л Определение фосфатазно-протеазного индекса позволило нам анализировать процессы метаболизма кальция в крови и пищеварения в кишечнике у птицы при содержании разного количества кальция в рационе. 80 60 40 20 0 70,4 14,5 15,6 опытный 1 Период 19,3 опытный 2 46 недель и старше контрольный 20-28 недель 9,5 Рисунок 3 – Фосфатазно-протеазный индекс в крови у кур- несушек разного возраста, содержащихся на кормах с разным уровнем кальция в рационе Анализируя данные рисунок 3 по значению фосфатазно-протеазного индекса в крови, можно говорить о негативном воздействии 3,0% содержания кальция в рационе на метаболизм, при котором наблюдается самое высокое значение ИФП у кур-несушек в возрасте 20-28 недель – 15,6, и в 46 недель и старше – 70,4. Таким образом, результаты исследования позволили впервые установить критерии оценки кальций-фосфорного обмена в организме кур-несушек посредством биохимических показателей крови, которые согласуются с ферментативными процессами в кишечнике птицы. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты выполненных исследований на курах-несушках позволяют сделать следующие выводы: 1. При изменении уровня кальция в рационе кур-несушек 46-недельного возраста экзокринная функция поджелудочной железы адаптируется к составу принимаемого корма, увеличивая объем выделяемого панкреатического сока, а также изменяя в его составе протеолитическую и липолитическую активность. Это отражается на активности пищеварительных ферментов в дуоденальном химусе: при повышении уровня общего кальция в корме кур выше нормы активность липазы повышается на 23,6% (p<0,05), что согласуется с изменениями в панкреатическом соке. Увеличение уровня кальция рационе кур 20-недельного возраста до 4,6% сопровождается снижением активности амилазы на 22,4% (p<0,05), уменьшением переваримости сырой клетчатки на 15,5% (p<0,05), наблюдается повышение активности протеаз на 25,0%, (p<0,05), липазы - на 29,3%, (p<0,05). 2. При содержании кальция в корме ниже нормы активность щелочной фосфатазы увеличивается в панкреатическом соке на 36,7% (p<0,05) и при избыточном уровне кальция в корме – на 12,8% по сравнению с контролем. В дуоденальном химусе наблюдаются понижение в активности щелочной фосфатазы, в опытные периоды 1 и 2 соответственно, на 30,2% (p<0,05) и 27,7% (p<0,05). 3. Между активностью пищеварительных ферментов в 12-перстной кишке и содержанием кальция установлена обратная корреляция, которая в 20-28- недельном возрасте кур-несушек при содержании кальция в рационе 3,6% составляет: для амилазы (r=-0,54), липазы (r=-0,35) и протеаз (r=-0,36). В 46- недельном возрасте и старше у кур данные закономерности не установлены. Между содержанием кальция и активностью щелочной фосфатазы наблюдается прямая корреляция в панкреатическом соке (в контрольный период r= +0,35; в опытный 1, при снижении кальция в рационе до 3,0%, r= +0,62; в опытный 2 период при содержании кальция выше нормы (4,6%) - r= +0,67), а также в дуоденальном химусе при нормативном содержании кальция 3,8% в рационе (r= +0,42). 4. Использование илеального метода для оценки доступности кальция у кур-несушек позволяет изучить метаболизм кальция раздельно в кишечнике и моче, что дает возможность более точной оценки доступности общего кальция, который всасывается из кишечника в кровь. 5. Оптимальной дозой кальция в рационе 20-28-недельных кур-несушек является 3,6% от массы корма, в этом случае усваивается 56,4% от потребленного количества. С возрастом усвояемость кальция в организме кур снижается и в 46-недельном возрасте составляет 21,4%. Увеличение кальция в рационе кур в этом возрасте до 4,6% позволяет поднять усвояемость кальция до 32,8% от потребленного с кормом. Снижение кальция в рационе кур-несушек ниже нормативного уровня более критично, чем повышение до 4,6%, поскольку приводит к снижению активности пищеварительных ферментов и доступности кальция для организма птицы. 6. Результаты исследования показали, что процесс яйцекладки является для кур-несушек доминантой, которая тормозит такие важные процессы, как выделение панкреатических ферментов и пищеварение в кишечнике. Однако это временное снижение активности ферментов компенсируется увеличением их активности при следующем приеме корма, что обеспечивает интенсивный гидролиз питательных веществ в организме птицы. 7. Результаты биохимических исследований крови показывают, что содержание кальция у 20-28 недельных кур-несушек возрастает на 55,0% при увеличении уровня кальция в корме. В возрасте 46 недель и старше, изменений содержания кальция в крови кур на фоне разных по содержанию кальция рационов не установлено. При уменьшении содержания кальция в корме до 3,0% в 20-28-недельном возрасте кур увеличивается количество общего белка на 18,7%, глюкозы – на 28,6%, снижается количество фосфора в крови более, чем в 2 раза. В 46-недельном возрасте кур-несушек реакция биохимических показателей крови на уменьшение в рационе кальция несколько отличается: наблюдается снижение активности трипсина в крови на 44,1%, значительно увеличивается активность щелочной фосфатазы (на 172,7%), при этом снижается уровень глюкозы (на 21,3%) и повышается количество общего фосфора на 50,0%. Практические рекомендации 1. Оптимальной дозой кальция для кур-несушек следует считать 3,6 % в 20-28-недельном возрасте и 3,8% в 46-недельном и старше возрасте от массы корма. В связи с возрастными изменениями кальциевого метаболизма рекомендуем повышать уровень кальция у кур-несушек старше 46-недельного возраста до 4,6%. 2. При выполнении физиологических исследований баланса минеральных веществ целесообразно применять метод илеальной доступности. 3. Учитывать при выполнении физиологических опытов по изучению физиологии пищеварения у кур-несушек, а также в производственных условиях, что в момент снесения яйца курицей активность пищеварительных ферментов тормозится центральной нервной системой. 4. При биохимическом исследовании крови для оценки адаптации птицы к уровню минерального питания использовать фосфатазно-протеазный индекс, как объективный метод физиолого-биохимической оценки состояния здоровья и полноценности питания птицы. Перспективы дальнейшей разработки темы Результаты проведенных исследований открывают возможность для дальнейшего изучения влияния разного уровня кальция на активность пищеварительных ферментов и щелочной фосфатазы у других видов сельскохозяйственной птицы в хронических опытах.