Анализ формирования и микроструктуры биопленок Azospirillum baldaniorum

Подвижность азоспирилл обеспечивается жгутиками – одиночным Fla и многочисленными Laf, образование которых индуцируется при повышенной плотности среды. Fla используется азоспириллами также для закрепления на поверхности корней растений. Известно, что свободноплавающие бактерии утрачивают зависящую от жгутиков подвижность при переходе к существованию в составе биопленки. В тоже время инактивация генов, отвечающих за подвижность, негативно влияет на формирование микробами биопленок (Sauer et al., 2002; Verstraeten et al., 2008; Guttenplan, Kearns, 2013). В связи с этим, на начальном этапе охарактеризовали основные стадии формирования биопленок и провели сравнительные исследования данного процесса у культур A.
, 2016); 2-ой Международной научной конференции
» (Саратов, 2020);
. Петрова Л.П.) и No 20-04-00006-а (д.б.н. Шелудько А.В.), стипендией
Правительства Российской Федерации (Телешева Е.М., приказ No 1130 от 13.10.2015 г.).
Автор владеет микробиологическими и биохимическими методами анализа и
творчески подходит к планированию и проведению экспериментов. Автором произведен анализ литературы по теме, проанализированы результаты и обобщены полученные данные.
Научные положения и выводы диссертации основываются на исследованиях,
. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю
д.б.н. А.В. Шелудько и д.б.н. проф. Е.И. Кацы за помощь в интерпретации результатов. Автор также признателен участвовавшим в проведении исследований коллегам из ИБФРМ РАН к.х.н. А.М. Бурову, к.б.н. Г.Л. Бурыгину, С.С. Евстигнеевой, к.б.н. Л.П. Петровой, к.б.н. Е.Г. Пономаревой и к.б.н. Ю.А. Филипьечевой, чей вклад отражен в совместных
baldaniorum Sp245T и его flhB1 мутанта (Sp245.1063), утратившего способность к синтезу Fla и Laf. При инкубировании Sp245T и Sp245.1063 в жидкой среде LB в течение 24 ч на поверхности пробирок формировались тонкие пленки, состоящие из разрозненных клеточных агрегатов (микроколоний), легко смываемые при аспирации. На 2 сутки численность бактерий, адсорбировавшихся на твердой поверхности, увеличивалась. Это сказывалось на приросте биомассы биопленок (рисунок 1). На 2-3 сутки культивирования в жидкой среде LB биомасса закрепившихся на поверхности пробирок азоспирилл стабилизировалась, существенных межштаммовых различий у Sp245 и Sp245.1063 не наблюдалось (рисунок 1). Очевидно, процесс адгезии бактерий на поверхности стекла завершался в данном временном промежутке. К 3 суткам инкубации отмечалось формирование пленки с более ровной поверхностью за счет соединения бактериальных микроколоний и начинался прирост биомассы. В случае Sp245.1063 количество биомассы в биопленке стабилизировалось к 4-5 суткам инкубации и не менялось на всем протяжении культивирования (рисунок 1). «Толщина» биопленок, сформированных штаммом Sp245T, становилась постоянной позже – после 6 дней инкубации (рисунок 1).
При культивировании Sp245T и Sp245.1063 в жидкой среде LB в течение 6 суток, результаты микроскопии показали, что высота их биопленок составляла 33.7±3.5 и 23.7±2.5 мкм, соответственно. Таким образом, толщина биопленок мутанта – (70.3±7.5)% от этого показателя у Sp245T. При окрашивании 6-суточных биопленок оптическая плотность красителя, десорбированного из биопленок Sp245.1063, составляла (58.6±4.4)% от данного показателя у штамма Sp245T (рисунок 1). Полученные данные толщины и относительного количества биомассы биопленок отлично согласовывались.
Итак, процесс формирования бактериальной биопленки на границе раздела жидкость – твердая поверхность в стационарных условиях протекает в несколько этапов: адсорбция, адгезия, прирост и стабилизация биомассы.
В условиях перемешивания
культуры Sp245T и Sp245.1063
росли практически с одинаковой
скоростью в жидких средах LB
или MSM. В стационарных
условиях планктонные культуры
Sp245.1063 отставали в росте от
Sp245T. Оказалось, что различия в
росте планктонных культур
Sp245T и Sp245.1063 в
стационарных условиях не влияли
на начало этапа прироста биомассы пленок этих штаммов (рисунок 1). Данный процесс начинался с 3 суток инкубации после стабилизации биомассы азоспирилл, закрепившихся на поверхности стекла. Стоит отметить, что на данном этапе существенные различия в толщине бактериальных пленок Sp245T и Sp245.1063 отсутствовали (рисунок 1). Вероятно, процесс прироста биомассы пленок у азоспирилл в значительной степени определяется плотностью популяции бактерий, закрепившихся на субстрате, независимо от скорости роста планктонных клеток. Дальнейшее развитие пленок во многом обусловливают поверхностные структуры бактериальных клеток, что нашло подтверждение при сравнении динамики формирования биопленок штаммом Sp245 и его мутантом без жгутиков (рисунок 1).
К 4-6 суткам инкубации внешний слой биопленки Sp245T состоял из кластеров бактерий, компактно примыкающих друг к другу. Каждый кластер в среднем состоял из 5±1
Рисунок 1 – Динамика накопления биомассы в биопленках, сформированных бактериями Sp245T (1) и Sp245.1063 (2) на поверхности стекла (а), и изменение плотности планктонных культур (б) этих штаммов при длительной инкубации в LB в стационарных условиях. А590 – оптическая плотность кристаллического фиолетового, десорбированного после окрашивания биопленок (а), или оптическая плотность планктонных культур (б).
клеток. У мутанта Sp245.1063 картина иная – биопленки образовывали бактерии с разреженным расположением клеток.
С помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) в биопленках Sp245 обнаружили клетки, на полюсе которых находился филамент, сходный с полярным жгутиком. В суспензиях, смытых с поверхности стекла биопленок, морфология жгутика и его расположение на бактериях были сходными у особей как из биопленок, так и из жидкой 18- часовой культуры Sp245T (просвечивающая электронная микроскопия). В фиксированных нативных биопленках Sp245T при АСМ клетки с полярным жгутиком находились в тесном контакте с бактериями, образующими пленку. Таким образом, данные клетки оказывались интегрированными в биопленку. Отбор материала для АСМ или электронной микроскопии нативных и смытых со стекла биопленок проводили как на этапе прироста их биомассы, так и из зрелых пленок. Клетки с филаментом жгутика обнаружены во всех препаратах Sp245T, что свидетельствует о сохранении его синтеза не только на этапе прироста биомассы, но и в зрелых биопленках. В биопленках Fla– Sp245.1063 жгутики у бактерий отсутствовали. Латеральные жгутики отсутствовали у клеток из биопленок Sp245T, как и у мутанта Sp245.1063.
Характеристика роли полярного жгутика в биопленках A. baldaniorum
В данном разделе предприняли попытку доказать гипотезу о том, что присутствие жгутиков положительно влияет на накопление биомассы и поддержание стабильности биопленки A. baldaniorum. Именно поэтому свойства биопленок изучили не только у Sp245T и его мутанта flhB1 Sp245.1063, но также у комплементарного мутанта Sp245.1063 (pRK415– 150177), содержащего вектор pRK415 с CDS Sp245 AZOBR_150177 белка FlhB аппарата жгутикового экспорта (Filip’echeva et al., 2018b). Имеющиеся данные позволяют предположить, что соседний нисходящий CDS AZOBR_150176 предполагаемого мультисенсорного гибридного сенсорного регулятора ответа гистидинкиназы (HSHK-RR) вместе с FlhB1 играет важную роль в морфологическом ответе азоспириллы на изменения плотности среды (клетки штаммов Sp245 (pRK415–150176) и Sp245.1063 (pRK415–150176) перестали удлиняться на плотных средах (Filip’echeva et al., 2018b)). Пытаясь получить больше данных о биологической роли HSHK-RR, кодируемой AZOBR_150176, подробно изучили некоторые свойства биопленок Sp245 (pRK415–150176) и Sp245.1063 (pRK415– 150176). Чтобы исключить влияние вектора pRK415 на свойства биопленок A. baldaniorum, использовали контрольные штаммы Sp245 (pRK415) и Sp245.1063 (pRK415).
На начальном этапе исследования сравнили биомассу в пленках, сформированых в статических условиях на границе раздела между стеклом или полистиролом и жидкими средами MSM или LB (рисунок 2; таблица 1). Встраивание вектора pRK415 или плазмиды pRK415– 150176 не влияло на способность к формированию биопленок штаммом Sp245T (рисунок 2; таблица 1). Встраивание pRK415– 150176 в мутант Sp245.1063
в
Таблица 1 – Формирование биопленок A. baldaniorum в лунках полистирольных планшетов под жидкими средами после 6 дней культивирования при 28°C
Штаммы
Sp245T
Sp245 (pRK415)
Sp245.1063
Sp245.1063 (pRK415) Sp245.1063 (pRK415–150177) Sp245.1063 (pRK415–150176) Sp245 (pRK415–150176) Sp245.1063 (pRK415)
Относительное количество биомассы в биопленках, образованных в жидкой среде
небольшим количества 6-дневных выращенных в жидкой среде LB на полистироле,
MSM 1.27 ± 0.10 (а) 1.09 ± 0.11 (а) 0.27 ± 0.02 (е) 0.29 ± 0.03 (е) 0.64 ± 0.04 (в) 0.30 ± 0.02 (е) 1.14 ± 0.17 (а) 0.29 ± 0.03 (е)
LB
0.67 ± 0.06 (б) 0.68 ± 0.06 (б) 0.39 ± 0.06 (д) 0.36 ± 0.02 (д) 0.69 ± 0.07 (б) 0.44 ± 0.05 (г) 0.70 ± 0.08 (б) 0.36 ± 0.02 (д)
сопровождалось увеличением
Биопленки окрашивали кристаллическим фиолетовым, связанный краситель экстрагировали этанолом и измеряли A590. Данные были обработаны ANOVA. Разные буквы обозначали значимые различия между образцами (p≤0.05).
биомассы биопленках,
и не влияло на накопление биомассы биопленок в других условиях культивирования. Однако статистически значимых различий между относительным количеством биомассы в биопленках штамма Sp245.1063 (pRK415–150176) и Sp245.1063 (pRK415) не наблюдали (рисунок 2; таблица 1).
У комплементарного мутанта Sp245.1063 (pRK415–150177) с восстановленным жгутиком и подвижностью как у Sp245T (Filip’echeva et al., 2018b) восстановление способности накопления
биомассы в 6-дневных пленках
штамма Sp245.1063 (pRK415–
150177) было частичным или
полным на границах раздела
между твердой поверхностью и
жидкими средами MSM или LB,
соответственно (рисунок 2;
таблица 1).
Laf не встречались на клетках в составе биопленок ни одного из исследуемых штаммов. Fla присутствовал у большого количества клеток из биопленок штаммов Sp245T, Sp245 (pRK415), Sp245 (pRK415–150176) и Sp245.1063 (pRK415–150177), образованных на разделе жидкость – твердая поверхность. Соответственно, эти штаммы накапливали больше биомассы в биопленках, чем штаммы без жгутиков Sp245.1063, Sp245.1063 (pRK415) и Sp245.1063 (pRK415– 150176).
Рисунок 2 – Относительное количество биомассы в 6-дневных биопленках, образованных на поверхности стеклянных пробирок штаммами A. baldaniorum, выращенными в жидких MSM (А) и LB (Б) в стационарных условиях (1) и при встряхивании при 140 об/мин (2). Биопленки окрашивали, связанный кристаллический фиолетовый экстрагировали этанолом и измеряли значения A590 растворов красителя. Данные были обработаны ANOVA. Буквы над столбцами обозначают значимые различия между образцами (p≤0.05).
сравнении биопленок поверхности стекла при культивировании в стационарных условиях или при
перемешивании (140 об/мин). Оказалось, что в случае использования MSM или богатой LB биопленки комплементарного мутанта Sp245.1063 (pRK415–150177), образованные на границе раздела жидкость – твердая поверхность, при встряхивании (140 об/мин) содержали такое же относительное количество биомассы, как и их аналоги, выращенные в статических условиях (рисунок 2). Таким образом, в сходных экспериментальных условиях комплементарный мутант вел себя аналогично штамму Sp245T дикого типа и производным Sp245T, несущим pRK415 или pRK415–150176. Напротив, биопленки штаммов без жгутиков Sp245.1063, Sp245.1063 (pRK415) и Sp245.1063 (pRK415-15076), зависели от условий культивирования. Пленки этих штаммов при встряхивании накапливали меньше биомассы по сравнению с их же пленками, выращенными на границе жидкость – стекло в статических условиях (рисунок 2).
Полученные данные доказали, что полярный жгутик необходим A. baldaniorum Sp245T для накопления биомассы биопленок и их стабилизации (в условиях гидродинамического сдвига).
При формирования
азоспирилл
на
Изменение свойств клеточной поверхности и эффективности формирования биопленок у мутантов бактерий A. baldaniorum Sp245T по предполагаемым генам липидного метаболизма mmsB1 и fabG1
Дефекты в жгутиковании и подвижности были ранее выявлены у инсерционных мутантов Sp245T по предполагаемым генам липидного метаболизма – 3- гидроксиизобутиратдегидрогеназы MmsB1 (SK039) и 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок (АПБ)]-редуктазы FabG1
(Sp245.1610) (Ковтунов с
соавт., 2013). Не исключено,
что мутации в локусах mmsB1 и
fabG1 привели к изменениям в
структуре клеточной оболочки
азоспирилл,
существенное
сборку
межклеточные взаимодействия и социальное поведение бактерий.
Динамика формирования
биопленок Sp245.1610 не
отличалась от таковой у Sp245T,
а в случае SK039 увеличивалась
продолжительность стадии
прикрепления бактерий к
твердой поверхности. Различия
в относительном количестве
биомассы (рисунок 3) в
биопленках штамма Sp245T и его мутантов проявлялась к 6 суткам инкубирования (зрелые пленки). На гидрофильной поверхности стекла под жидкой средой LB количество биомассы в биопленках Sp245T и Sp245.1610 было примерно одинаковым, а в биопленках SK039 существенно меньше. Под жидкой MSM количество биомассы было снижено в пленках обоих мутантов (рисунок 3). На гидрофобном полистироле под жидкой LB и MSM оба мутанта формировали менее выраженные биопленки, по сравнению со штаммом дикого типа (рисунок 3).
На всех этапах формирования биопленок в случае Sp245T выявлялись многочисленные клетки с длинными жгутиками, переплетающимися и образующими сеть. В биопленках SK039 (leakyFla–Mot–Swa–) имелась очень небольшая доля клеток с длинным Fla, а на некоторых клетках Sp245.1610 (leakyFla–/Mot–Laf–) присутствовал сильно укороченный Fla (рисунок 4). Латеральные жгутики в биопленках ни у одного из исследуемых штаммов обнаружены не были. Зрелые биопленки Sp245T, Sp245.1610, SK039 и Sp245.1063 содержали везикулы разного размера (рисунок 4), выявлявшиеся чаще при атомно-силовой микроскопии в образцах с границы жидкость – воздух, чем с твердой поверхности.
При культивировании в жидкой среде LB на 2 сутки степень агрегации планктонных культур Sp245.1610 и SK039 превышала таковую у Sp245T. На 6 сутки степень агрегации планктонных клеток у мутантов не изменялась, а у Sp245T возрастала примерно в 2 раза (рисунок 5). Вероятно, активная агрегация бактерий уже в планктонной культуре способствовала их прикреплению к твердой поверхности, особенно в случае мутантов без полноценного Fla.
При культивировании в жидкой MSM клетки всех исследуемых штаммов агрегировали примерно в равной степени независимо от времени инкубации и сильнее, чем при культивировании в LB (рисунок 5). Вероятно, это способствовало накоплению большего количества биомассы в биопленках к 6 суткам инкубации на гидрофобной поверхности под
оказавшим влияние на жгутиков,
Рисунок 3 – Относительное количество биомассы в биопленках штамма Sp245T и его мутантов leaky Fla–/Mot–Laf–Swa–Sp245.1610 (fabG1::Omegon-Km) и leaky Fla–Mot–Swa–SK039 (mmsB1::Omegon- Km), сформированных за 6 суток на стекле (а) или полистироле (б) под жидкой средой LB (1) или MSM (2).
А590 – оптическая плотность кристаллического фиолетового, экстрагированного из окрашенных биопленок.
MSM, по сравнению с таковым под LB (рисунок 3). Тем не менее, и в MSM, и в LB, сохранялись различия в толщине биопленок мутантов и родительского штамма. Штаммы Sp245T, Sp245.1610 и SK039 отличались также по такому показателю, характеризующему свойства бактериальной поверхности, как относительная гидрофобность планктонных клеток (рисунок 5).
Толщина/биомасса пленок азоспирилл изменялась в ответ на изменение физико- химических параметров
среды, окружающей
биопленки. Так, через 2 ч
после замены культуральной жидкости с планктонной культурой, окружающей 6- суточные биопленки, на 50 мМ фосфатный буфер (ФБ;
рН 7.0)
образующих
переходила
Биомасса биопленок всех
исследуемых штаммов
снижалась в основном на 40-
60%. Стоит отметить, что
после 6 суток
культивирования рН сред LB
или MSM, окружающих
биопленки, возрастала до
величины (8.3 ± 0.1) или (9.3 ±
0.1), соответственно. При
использовании вместо ФБ (рН
7.0) культуральной жидкости после удаления 6-суточных планктонных клеток диссоциации биопленок не происходило. Так, после такой инкубации с LB (рН 8.3) спустя 2.5 ч в биопленках штаммов Sp245T,
Sp245.1610, и SK039 сохранялось (93.3 ± 6.6), (95.8 ± 14.8) и (88.0 ± 12.2)% биомассы, соответственно.
Можно предположить,
что прикрепление некоторого
количества бактерий
(клетка/клетка/поверхность) в
биопленках обуславливают
взаимодействия,
чувствительные к изменению
таких условий, как рН и/или,
вероятно, ионная сила (состав
сред LB/MSM отличается по
данному показателю от 50 мМ
ФБ). Необходимо отметить, что
способность к диссоциации в
одинаковой степени выражена
как у подвижных клеток Sp245T, так и у неподвижных мутантов.
Для анализа биопленок азоспирилл, сформированных на поверхности полистирола, также использовали ИФА с поликлональными Ат на ЛПС штамма Sp245T. Отношение
часть в
клеток, пленку, буфер.
Рисунок 4 – Просвечивающая электронная микроскопия материала из биопленок штаммов Sp245T (а-в), Sp245.1610 (г, д) и SK039 (е, ж), смытых с поверхности стекла после 6 суток культивирования под жидкой средой LB (а, б, г, е) или MSM (в, д, ж). Стрелки указывают на везикулы. Масштаб 1 мкм.
Рисунок 5 – Свойства планктонных клеток штамма Sp245T и его fabG1 (Sp245.1610) и mmsB1 (SK039) мутантов, выращенных в среде LB (1) или MSM (2): относительная гидрофобность клеток из ~20-ч культур, определенная методом высаливания (а); степень агрегации планктонных клеток после 2-х (б) и 6-ти (в) суток культивирования без перемешивания.

показателя, характеризующего содержание ЛПС антигенов в биопленках, образованных под жидкой LB/MSM (таблица 2), к показателю, характеризующему их биомассу (рисунок 3), в случае штаммов Sp245T, SK039 или Sp245.1610 составляло соответственно 0.5/0.3, 1.0/0.8 или 0.8/0.6. Очевидно, что в зрелых биопленках дефектных по жгутикованию мутантов Sp245.1610 и SK039 относительное содержание ЛПС антигенов было выше, чем у Sp245T.
Формированию контактов между клетками наряду с другими структурами способствуют продуцируемые азоспириллами гемагглютинины (Никитина с соавт., 2001). Различия в структуре поверхности клеток из зрелых биопленок трех штаммов азоспирилл анализировали по измеенению их гемагглютинирующей активности.
Суспензии бактериальных
клеток из 6-суточных биопленок под
LB/MSM, смытых с поверхности
стекла, вызывали агглютинацию трипсинизированных эритроцитов с титром реакции (1:16)/(1:16), (1:4)/(1:4) и (1:1)/(1:4) для штаммов Sp245T, Sp245.1610 и SK039, соответственно. Белок-гемагглютинин ранее был выделен с поверхности клеток (Шелудько с соавт., 2009). Он взаимодействует с О-полисахаридом штамма A. baldaniorum Sp245T, что, вероятно, способствует установлению межклеточных контактов.
В связи со снижением гемагглютинирующей активности у клеток мутантов в 4-16 раз предположили, что межклеточные взаимодействия в культурах соответствующих штаммов, опосредуемые гемагглютининами, ослаблены. Причиной более низкой гемагглютинирующей активности клеток мутантов могли стать и изменения в строении или аранжировке на клеточной поверхности не только гемагглютининов, но и других биомолекул, не участвующих в реакции, но влияющих на активность агглютининов.
Содержание ЛПС биопленок мутантов Sp245.1610 и SK039 выше, чем у родительского штамма, что, вероятно, сказывалось на титре гемагглютинирующей активности их клеток. Обработанные трипсином клетки штамма Sp245T утрачивали способность агглютинировать трипсинизированные эритроциты. Биопленки Sp245T, Sp245.1610 и SK039, сформированные на стекле под LB, после обработки трипсином в концентрации 100 мкг/мл, как и в случае проназы, сохраняли лишь (78.6 ± 7.4)%, (71.0 ± 13.3)% и (76.0 ± 8.3)% биомассы. По-видимому, снижение биомассы пленок происходит вследствие разрушения протеазами поверхностных биополимеров, обуславливающих гемагглютинацию и участвующих в образовании межклеточных контактов.
Жирнокислотный профиль ЛПС штамма A. baldaniorum Sp245T и его fabG1 и mmsB1 мутантов
Мутанты SK039 и Sp245.1610 сохранили способность к синтезу ПССК, а их ЛПС в иммунохимических реакциях взаимодействовали с поликлональными антителами на ЛПС штамма Sp245T. Ферменты MmsB имеют широкую субстратную специфичность и могут катализировать обратимое окисление 3-гидроксиизобутирата, других 3-гидроксикислот, ряда аминокислот (Chowdhury et al., 1996), а FabG ферменты катализируют восстановление 3- оксоацил-[АПБ] до 3-гидрокси-[АПБ] на первом этапе de novo синтеза жирных кислот (ЖК). Одним из основных компонентов бактериальных ЛПС, помимо углеводной части, представленной ОПС и олигосахаридом кора, является липид А. Для проверки предположения о возможном изменении ЖК состава ЛПС после инактивации генов mmsB1 и fabG1 провели анализ ЖК профилей липида А штамма Sp245T и этих мутантов.
Таблица 2 – Результаты ИФА содержания ЛПС антигенов в биопленках штамма Sp245T и его fabG1 (Sp245.1610) и mmsB1 (SK039) мутантов, сформированных на полистироле за 6 суток
Штамм
антителами биопленок, образованных под жидкой средой
Результаты ИФА (A ) с анти-ЛПС 490
T LB MSM
Sp245 Sp245.1610 SK039
0.38±0.03 0.24±0.02 0.27±0.04
0.50±0.09 0.40±0.08 0.38±0.08

При культивировании в жидкой среде LB или MSM гидрофобность клеток Sp245 оставалась практически одинаковой, а различия в количестве биомассы биопленок Sp245T и его мутантов были наиболее заметны при использовании MSM (рисунки 3 и 5). Поэтому для получения препаратов ЛПС с целью последующего химического анализа
использовали бактерии, выращенные в MSM.
Анализ ЖК профилей ЛПС с помощью ГЖХ метиловых эфиров ЖК (МЭЖК) показал, что по сравнению с ЛПС штамма Sp245T в ЛПС Sp245.1610 и SK039 снижалось содержание 3-OH-C16:0 и C16:0. Незначительное уменьшение содержания 3-ОН-С14:0 и увеличение значений для С16:1 наблюдали в ЛПС SK039. Содержание C18:1 и С19:0 в ЛПС обоих мутантов возростало.
Изменение соотношения ЖК в ЛПС могло послужить причиной описанных выше различий в физико-химических свойствах клеточной поверхности и эффективности формирования биопленок азоспирилл (например, вследствие изменения в степени экспонирования биомолекул, важных для взаимодействия азоспирилл между собой и с инертными поверхностями).
Перенос pRK415-mmsB1 в A. baldaniorum SK039 увеличивает накопление биомассы в зрелых биопленках комплементарного мутанта
У SK039 вставка Omegon-Km из 3.8 т.п.н. располагается после 479-го п.н. CDS mmsB1 (Ковтунов с соавт., 2013). В культурах SK039 примерно 20% бактерий продуцировали длинный или короткий Fla (Shelud’ko et al., 2019b). Клетки мутанта оказались не способны к движению в жидких или в полужидких средах (Shelud’ko et al., 2019b). По сравнению с Sp245T у мутанта наблюдались изменения в физико-химических свойствах клеточной поверхности, также он накапливал меньше биомассы в зрелых биопленках. Чтобы подтвердить данные о биологической роли mmsB1, были проанализированы фенотипические последствия комплементации мутанта SK039 (Shelud’ko et al., 2019b) CDS mmsB1 штамма Sp245T, клонированного в векторе экспрессии pRK415 (pRK415-mmsB1).
На границе раздела между жидкой MSM или LB и гидрофильными или гидрофобными поверхностями штамм Sp245T накапливает больше биомассы в биопленках, чем мутант mmsB1::Omegon-Km SK039. У обоих штаммов первоначальное прикрепление и адгезия клеток к твердой поверхности происходит за 2-3 дня, а пики накопления биомассы приходятся на 5-6 день. Таким образом, стадия созревания биопленки у мутанта, по- видимому, нарушена.
Для того чтобы показать, что снижение накопления биомассы SK039 в биопленке вызвано инактивацией вставки mmsB1, проанализировали соответствующий фенотип штамма SK039 (pRK415-mmsB1). Оказалось, что введение плазмиды pRK415 с CDS mmsB1 штамма Sp245, оказало положительно влияло на накопление биомассы в биопленках, образованных комплементарным мутантом как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхностях. По сравнению со штаммом Sp245T, в зависимости от условий роста, восстановление способности к формированию биопленки у SK039 (pRK415-mmsB1) было частичным (под MSM) или полным (под LB) (таблица 3).
Введение в клетки плазмиды pRK415-mmsB1 приводило к значительному увеличению относительного числа бактерий с Fla у штамма SK039. Процент клеток SK039 (pRK415- mmsB1), обладающих Fla, приблизился к 46-53% от значений, характерных для Sp245T. Соотношение клеток с Fla было практически одинаковым в популяциях A. baldaniorum, выращенных в жидкой LB или MSM. Скорость плавания подвижных клеток комплементарного мутанта в жидких и в полужидких агаризованных средах равна таковой у Sp245T. Характер движения бактерий у SK039 (pRK415-mmsB1) и Sp245T был сходным (Shelud’ko et al., 2019b).
Критическим фактором, влияющим на формирование биопленки, является состояние питательной среды. Например, дефицит углерода может активировать производство матрикса биопленки (Zhang et al., 2014), а состав питательных веществ может
способствовать переходу поверхностной биопленки в опускающуюся на дно форму (Paytubi et al., 2017). Обнаружено, что бактерии A. baldaniorum Sp245T накапливали больше биомассы в биопленках, образованных на границах раздела фаз между гидрофобной твердой поверхностью и бедной средой MSM, нежели в биопленках, сформированных на богатой среде LB.
Эти различия можно объяснить наличием у штамма Sp245T положительного транскрипционного регулятора развития биопленки в условиях роста на бедной питательной
среде. Пока
неясно, почему
процесс
накопления
биомассы
биопленки в
комплементарно
м штамме SK039
(pRK415-
mmsB1),
выращенном на
MSM, был
восстановлен
только частично.
Возможно,
причиной этому
послужило
отсутствие
родного
промотора и предполагаемых регуляторных последовательностей выше mmsB1 в конструкции pRK415-mmsB1. Однако, когда азоспириллы выращивали на LB, в штамме SK039 (pRK415-mmsB1) наблюдали полное восстановление накопления биомассы биопленки. Таким образом, несмотря на более низкий (чем у штамма Sp245T) процент клеток с полярным жгутиком в популяции комплементарного мутанта, его способность создавать и поддерживать биопленки не была подавлена. Интересен тот факт, что гетерогенность подвижности клеток в прикрепленных биопленках E. coli, вызванная спонтанными мутациями в опероне flhDC, способствовала поддержанию биомассы биопленки в течение длительного времени (Horne et al., 2016). Помимо увеличения числа клеток с полярным жгутиком в популяциях комплементарного штамма SK039 (pRK415-mmsB1), восстановленные свойства поверхности его клеток также могут положительно повлиять на коллективную прикрепленную жизнь мутанта. Так клетки SK039 из 20 ч культуральных бульонных культур, выращенных на MSM или LB, имели более высокую относительную гидрофобность, чем клетки Sp245T (рисунок 6). После введения pRK415-mmsB1 относительная гидрофобность клеточной поверхности у комплементарного мутанта (но не у контрольного штамма SK039 (pRK415)) снижалась до уровня дикого типа независимо от используемой питательной среды (рисунок 6).
Таким образом, использование комплементированного мутанта (мутант с pRK415- mmsB1), удалось продемонстрировать, что именно мутация вставки в mmsB1 провоцирует изменения на уровне популяции относительной гидрофобности клеточной поверхности SK039.
У грамотрицательных бактерий, в том числе азоспирилл, за закрепление ЛПС на наружной мембране, а также за поддержание основных свойств поверхности клетки отвечают ЖК липида А. Липидные носители используются для синтеза O-полисахаридных цепей ЛПС на цитоплазматической стороне внутренней мембраны (Sperandeo et al., 2011). Различия между диким типом и мутантом признака (поддержание основных свойств
Таблица 3 – Формирование биопленок A. baldaniorum в стеклянных пробирках или в лунках полистирольных планшетов под жидкими средами после 6 дней культивирования при 28°C
Относительное количество биомассы
в биопленках, образованных в жидкой среде:
Штаммы
MSM Полистирол
1.3±0.10 (а) 1.0±0.10 (б) 0.4±0.07 (г) 0.4±0.04 (г) 0.6±0.07 (в)
LB Полистирол
0.7±0.05 (а) 0.7±0.08 (а) 0.3±0.05 (б) 0.4±0.04 (б) 0.8±0.08 (а)
Стекло 0.9±0.03 (а) 0.8±0.05 (а) 0.4±0.05 (в) 0.4±0.03 (в) SK039 (pRK415-mmsB1) 0.5±0.03 (б)
На поверхности: Стекло
Sp245T
Sp245 (pRK415) SK039
SK039 (pRK415)
0.8±0.05 (а) 0.9±0.02 (а) 0.5±0.04 (б) 0.5±0.02 (б) 0.8±0.03 (а)
Биопленки окрашивали кристаллическим фиолетовым, связанный краситель экстрагировали этанолом и измеряли поглощение растворов при 590 нм (A590). Данные были обработаны ANOVA. Разные буквы обозначают значимые различия между образцами (p≤0.05).
поверхности клетки), который может быть определен изменениями в составе мембранных ЖК (гидрофобность клеточной
поверхности), исчезли после того,
как SK039 был дополнен CDS
mmsB1, перенесенным из штамма
Sp245T в плазмиде Гипотетически, белок
штамма Sp245T может различную локализацию в бактериальных клетках и может выполнять сложные биологические функции.
Таким образом, данное
исследование показало, что CDS
mmsB1 важен для полярного
жгутикования и поведения
отдельных клеток и популяции
штамма A. baldaniorum Sp245T.
Однако молекулярные механизмы,
лежащие в основе плейотропного воздействия mmsB1 на бактериальный фенотип, неясны.
Характеристика углеводсодержащих компонентов биопленок A. baldaniorum
Для многих микроорганизмов основными компонентами формирующихся и функционирующих биопленок являются экзополисахариды (Bogino et al., 2013). Компоненты матрикса, в том числе и гликополимеры, обеспечивающие прикрепление биопленок к поверхности и стабилизирующие структурную целостность зрелых биопленок азоспирилл, не охарактеризованы. Биопленки мутантов, лишенных жгутиков, являются удобной моделью для изучения роли прочих структур клеточной поверхности и экзополимеров в организации биопленочного матрикса.
Влияние периодата натрия на биопленки штамма A. baldaniorum Sp245T и его flhB1(Sp245.1063), fabG1(Sp245.1610) и mmsB1(SK039) мутантов
После инкубации с периодатом натрия (окисляет полисахариды) биомасса зрелых биопленок Sp245T, сформированных на стекле под LB, убывает примерно на 40% (рисунок 7). В случае лишенных жгутиков мутантов Sp245.1063, Sp245.1610 и SK039 эта величина составляет 60-75%. На стекле под MSM или на полистироле под LB/MSM устойчивость биопленок всех штаммов к периодатному окислению возрастает, а величина биомассы биопленок снижается примерно на 20% (рисунок 7).
Стоит отметить, что после инкубации с периодатом нарушается единство клеток, образующих пленку. Часть бактерий из биопленок становятся либо свободными, либо находятся в составе агрегатов. При окрашивании кристаллическим фиолетовым эти и более крупные фрагменты биопленок могут отслаиваться от поверхности даже при осторожном промывании водой. Биомасса в биопленках лишенных жгутиков Sp245.1063 и SK039 существенно уступает этому показателю Sp245T (рисунок 7). Биопленки мутанта с аналогичным фенотипом Sp245.1610 и Sp245T на гидрофильной поверхности существенно не отличаются. Тем не менее, в случае всех мутантов после инкубации с окислителем гликополимеров их пленки теряют на 20-35% больше биомассы, чем у штамма Sp245T. Таким образом, углеводсодержащие составляющие биомассы являются частью многокомпонентной системы механизмов, опосредующих как сродство биопленок к поверхностям с разными физико-химическими свойствами, так и их структурную целостность.
pRK415. MmsB1 иметь
Рисунок 6 – Относительная гидрофобность клеток штаммов A. baldaniorum из 20-ч культур, выращенных в жидкой среде MSM или LB с соответствующими антибиотиками, определена с помощью метода высаливания. Данные были обработаны ANOVA. Разные буквы над столбцами обозначают значимые различия между образцами (p≤0.05).
Оценка соотношения углеводсодержащих и белковых компонентов в матриксе, полученном из смытой с поверхности стекла биомассы биопленок, показала доминирование углеводных составляющих
над белковыми в случае
всех исследованных
штаммов (рисунок 8).
Анализировали легко
смываемые компоненты,
перешедшие в супернатант
при центрифугировании
биомассы после ее
промывания ФБ (pH 7.0)
(ФБ-«экстракты»), и более
прочно связанные, которые
экстрагировали ЭДТА
(ЭДТА-«экстракты»).
Отношение углеводы/белок
меняется в зависимости от
состава среды
культивирования. В
экстрактах биопленок из LB
этот показатель (среднее
значение для всех
исследованных штаммов и
способов экстракции)
составляет 4.3±0.6, а в
случае пленок из MSM
снижается до 2.8±0.7.
Вполне вероятно,
снижение показателя
соотношения
углеводы/белок в матриксе
сказывается на повышении
устойчивости к
периодатному окислению
бактериальных пленок, сформированных под MSM. Белковые составляющие матрикса так же, как и углеводсодержащие компоненты, выполняют, в том числе, каркасную функцию. Так, после инкубации с проназой биомасса биопленок Sp245T, Sp245.1063 или SK039, сформированных под LB на стекле, убывала примерно на 30%, а у Sp245.1610 – на 46% (рисунок 7). В случае пленок на полистироле уменьшение составило 65, 33, 28 и 69%, соответственно (рисунок 7). Проназа одинаково действовала на пленки, сформированные под MSM на стекле или полистироле (рисунок 7). У всех исследованных штаммов биомасса биопленок уменьшалась примерно на 20-30% под действием протеазы. Необходимо отметить, что биомасса биопленок снижалась также после обработки трипсином.
Исследование значения ЛПС для стабилизации биомассы биопленок
Легко смываемые компоненты (ФБ-«экстракты») и более прочно связанные составляющие (ЭДТА-«экстракты») матрикса (рисунок 8) биопленок Sp245T и его мутантов Sp245.1063, Sp245.1610 или SK039 в иммунохимических реакциях (двойная иммунодифузия и ИФА) взаимодействовали с поликлональными антителами, специфичными к мембранным ЛПС родительского штамма. Повторяющееся звено О-полисахарида ЛПС (ОПС) штамма Sp245T является пента-D-рамнаном (Fedonenko et al., 2002). Итогом окисления ЛПС
Рисунок 7 – Влияние периодата натрия и проназы на биомассу биопленок
A. baldaniorum, сформированных
на стекле (а, в, д) и полистироле (б, г, е) под жидкой LB (1) или MSM (2). Обозначения:
(а, б) – А590 (оптическая плотность) кристаллического фиолетового, десорбированного после окрашивания биопленок до обработки периодатом натрия
и проназой;
(в, г) – процентное отношение оптической плотности красителя, десорбированного с окрашенных пленок после их инкубации в растворе периодата натрия или проназы (д, е), к аналогичному показателю без обработки.

периодатом натрия будет модификация О-полисахарида штамма Sp245T (периодат натрия окисляет полисахариды с образованием диальдегидполисахаридов). В модельном эксперименте после обработки периодатом препаратов ЛПС (5 мкг/мл) штаммов Sp245T, Sp245.1610 и SK039 снижается уровень взаимодействия Ат с ЛПС (таблица 4).
Очевидно, окисление периодатом оказывает влияние на антигенные характеристики ЛПС. При увеличении
количества окисляемого
субстрата на порядок (50 мкг/мл)
антигенные свойства ЛПС изменяются меньше (таблица 4). В биопленках возможная модификация периодатом натрия гликополимеров, в том числе ОПС, снижает уровень взаимодействия Ат с ними у Sp245T и Sp245.1610 на 30%, а у Sp245.1063 и SK039 на 20% (таблица 4).
Устойчивость части
липополисахаридного антигена к
окислению, вероятно,
обусловлена высоким
содержанием гликополимеров в
матриксе (рисунок 8), его
высоким содержанием в
биомассе, особенно в случае
«тонких», по сравнению с
показателями родительского
штамма, пленках мутантов
(рисунок 7). Так, отношение
показателя, характеризующего
содержание ЛПС антигенов в биопленках, сформированных под LB (таблица 4), к показателю, характеризующему их биомассу (рисунок 7), в случае штаммов Sp245T, Sp245.1063, Sp245.1610 или SK039 составило соответственно 0.5, 0.9, 0.8 или 1.0. Толщина пленок, вероятно, также может влиять на доступность ЛПС для окисления периодатом (таблица 4; рисунок 7).
Таблица 4 – Выявление иммуноферментным анализом (ИФА) липополисахаридных (ЛПС) антигенов (3) с различным содержанием углеводов (1) в биопленках A. baldaniorum (2 и 4), сформированных на полистироле за 6 сут под жидкой средой LB, после периодатного окисления (3 и 4).
Рисунок 8 – Содержание углеводов и белка
в матриксе
зрелых биопленок A. baldaniorum, сформированных на стекле под LB (а)
и MSM (б). Обозначения:
1 – ФБ-«экстракты» (легко смываемые компоненты, переходящие
в супернатант при центрифугировании биомассы после
ее промывания ФБ при pH 7.0);
2 – ЭДТА-«экстракты» (более прочно связанные составляющие);
серые столбцы – углеводы;
белые столбцы – белок.
Штамм
углеводов в препарате ЛПС, весовые %
ИФА (А590) анти-ЛПС антител с биопленками
0.38±0.03 0.24±0.02 0.24±0.02 0.27±0.04
(1) (2) Содержание Результаты
Отношение результатов взаимодействия в ИФА анти-ЛПС антител с антигеном после инкубации с периодатом натрия к аналогичному показателю в контроле (2), %
(3) (4)
препарат ЛПС, мкг/мл* 50 5
биопленки
Sp245T 65.8±2.1 Sp245.1063 н.о. Sp245.1610 75.9.±5.5 SK039 44.1±2.5
84.3±3.7 49.8±8.0 64.1±7.4 н.о. н.о. 76.8±5.3 86.4±7.2 77.4±5.7 67.5±7.7 84.1±7.0 34.3±6.2 87.1±7.7
* – концентрация растворенного препарата внесенного в лунки планшета для ИФА.
Очевидно, в «толстых» биопленках (Sp245T) или пленках с высоким содержанием ЛПС и/или других гликополимеров после периодатного окисления остается значительная доля липополисахарида, сохраняющего антигенные свойства. Тем не менее, даже в этом случае последствиями инкубации с окислителем является снижение биомассы биопленок, наиболее заметное на гидрофильной поверхности (рисунок 7).
Исследование значения структур, связывающих калькофлуор и/или конго красный, для стабилизации биомассы биопленок
Биомасса нативных биопленок всех исследованных штаммов связывает флуоресцирующий краситель калькофлуор и взаимодействует с конго красным. Окрашивание этими анионными красителями позволяет обнаружить β-глюканы, присутствующие в составе сложного комплекса бактериальных полисахаридов (Skvortsov, Ignatov, 1998; Wood, 1980).
Максимум флуоресценции люминофора, накопленного биомассой, смытой с поверхности стекла ФБ рН 7.0, всех исследованных штаммов смещен в сторону более длинных волн по сравнению с аналогичным показателем его раствора в сходном буфере (для всех штаммов сдвиг был примерно одинаковым и составил 8.0±1.0 нм). Похожее смещение максимума интенсивности флуоресценции типично для растворов комплексов калькофлуора с полимерами полисахаридной природы (Wood, 1980; Plasek, Hoskova, 2010). Флуоресценция окрашенных калькофлуором биопленок после инкубации с окислителем гликополимеров периодатом натрия (нарушается единство клеток, образующих пленку, и снижается количество ее биомассы), менее интенсивна в сравнении с необработанными пленками. Очевидно, модифицированные после окисления периодатом компоненты биомассы связывают меньше красителя. Обработка проназой не влияет на связывание красителя с биопленками (флуоресценция окрашенных пленок сохраняется).
Спектроскопия смытой с поверхности стекла биомассы биопленок из среды с калькофлуором или конго красным показала сходные изменения спектра поглощения каждой из красок, накопленной в биопленках Sp245T, Sp245.1063, Sp245.1610 и SK039. Красители, связанные с биомассой штамма Sp245T, поглощали с максимумами при (362.0±3.0) или (515.0±2.0) нм, соответственно, тогда как эти величины для их растворов в фосфатном буфере составляли 349.0 или 495.0 нм (характерные максимумы поглощения красителей при рН 7.0 (Wood, 1980; Plasek, Hoskova, 2010)). Смещение спектров флуоресценции калькофлуора и максимумов поглощения этого красителя (≥10 нм) или конго красного (≥20 нм) свидетельствует о возможном образовании красителями комплекса с β-глюканами (Wood, 1980). Красители сохраняются в составе биомассы биопленок после промывания и удаления легкосмываемых компонентов матрикса.
Необходимо отметить, что конго красный взаимодействует, помимо глюканов, с белковыми структурами – амилоидами (Fowler et al., 2007). Амилоидные структуры, присутствующие в биопленках грамотрицательных бактерий, опосредуют прикрепление микроорганизмов к множеству субстратов, включая поверхность корней растений (Fowler et al., 2007; Плакунов с соавт., 2017; Jeter, Matthysse, 2005). Определенный вклад в изменение спектра поглощения конго красного, накопленного азоспириллами в биопленках, помимо полисахаридов, могут вносить подобные структуры. Биопленки азоспирилл, окрашенные красителем (краситель прокрашивает всю биомассу), исследованы с помощью поляризованной световой микроскопии. При скрещенных поляризаторах в них обнаруживаются яркие пятна желтого/зеленого двулучепреломления, характерные для комплекса красителя с амилоидными структурами (Nilsson, 2004). Не вся окрашенная конго красным биомасса биопленок азоспирилл демонстрирует подобный эффект. Локализация желтого/зеленого двулучепреломления соответствует окрашенным конго бактериальным агрегатам. В неокрашенных биопленках или в растворе красителя такое двулучепреломление при микроскопии отсутствует.
Анализ микроструктуры биопленок азоспирилл
С помощью просвечивающей электронной микроскопии исследовали биопленки родительского штамма, которые по сравнению с пленками мутантов более устойчивы к таким воздействиям, как гидродинамический сдвиг, что существенно упрощает подготовку препаратов для микроскопии. Напыление тонкого слоя золота на высушенные препараты биопленок позволило повысить контраст матрикса, в который погружены клетки (рисунок 9а). Для анализа распределения в матриксе внеклеточных гликанов использовали в качестве зонда конъюгат коллоидного золота с АЗП (АЗП-КЗ15), специфичный к N-ацетил-D- глюкозамину (Lotan, Sharon, 1973; Kamnev, 2013). Возможность использования АЗП в качестве эффективного зонда для выявления внеклеточных полисахаридов азоспирилл обусловлена отсутствием взаимодействия данного лектина с отмытыми от экзополисахаридов и капсулы клетками азоспирилл (Skvortsov, Ignatov, 1998).
Электронная микроскопия биопленок, меченных АЗП-КЗ15, показала, что зонд распределяется по всей поверхности препарата, образуя неоформленные скопления и/или короткие полосы (рисунок
9). Частицы АЗП-КЗ15
также взаимодействуют с
«мостиками» соединяющими (рисунок 9б).
Стоит
что АЗП-КЗ15 метит не
все подобные структуры
(рис. 9б, в). В
контрольных образцах с
заблокированным
хитотриозой активным
центром АЗП частицы
КЗ15 не связываются с
биопленками, как и с
поверхностью
планктонных клеток
(рисунок 9г, е).
Полученные результаты
электронной микроскопии
свидетельствуют о
присутствии в составе
матрикса зрелых биопленок компонентов, имеющих в составе углеводный гаптен, обладающий сродством к АЗП. Сродство к данному лектину проявляют содержащие глюкозамин липополисахарид-белковый (ЛПБК) и полисахарид-липидный (ПСЛК) комплексы капсулы, экзополисахариды азоспирилл из жидких планктонных культур (Skvortsov, Ignatov, 1998). Перечисленные комплексы капсульных гликополимеров клеток Sp245T и ЛПС их внешней мембраны содержат идентичные антигенные детерминанты (Матора, Щеголев, 2002). После сравнения матрикса зрелых биопленок и мембранных липополисахаридов этого штамма (в случае мутантов Sp245.1063, Sp245.1610 и SK039 получены аналогичные данные) нами выявлен общий антиген.
Таким образом, результаты электронной микроскопии и иммунохимических исследований согласуются и свидетельствуют о наличии компонентов сложных комплексов гликополимеров капсулы в составе матрикса зрелых биопленок.
Присутствие в составе матрикса углеводного гаптена, обладающего специфическим сродством к АЗП, может указывать на то, что лектин-углеводные взаимодействия являются неотъемлемой частью механизмов, опосредующих фиксацию зрелых бактериальных пленок
матрикса, клетки
отметить,
Рисунок 9 – Просвечивающая электронная микроскопия фрагментов биопленок Sp245T 5 (а-г) и клеток из планктонных 18-ч культур (д, е) после инкубации с АЗП-КЗ15 (б, в, д), АЗП-КЗ15 + хитотриоза (г, e) или напыления золота (а). Бактерии и биопленки культивировали в жидкой LB. АЗП-КЗ15 – конъюгат коллоидного золота (размер частиц 15 нм) с агглютинином зародышей пшеницы (АЗП). Масштаб 1 мкм.
на поверхности корня пшеницы. Это может играть важную роль при колонизации азоспириллами корневой системы растений (Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями, 2005).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе выполнено исследование микроструктуры биопленок и процесса их формирования культурами штамма A. baldaniorum Sp245T. В качестве объекта изучения помимо штамма Sp245T использованы его производные с нарушениями в образовании и функционировании жгутиков. Сравнительный анализ образования пленок штаммом Sp245T и его мутантами позволил получить первичную информацию о характерных для этих бактерий и универсальных механизмах, обеспечивающих формирование сложной архитектуры биопленочных сообществ.
(flhB1::Omegon-Km (Fla– Laf–)
Важным наблюдением за динамикой образования биопленок культурами штамма Sp245T является выявленная закономерность –
планктонных культур.
Полученны данные доказывающие, что присутствие полярного жгутика на клетках из биопленок Sp245T необходимо для эффективного накопления биомассы пленки на границах раздела между твердыми и жидкими средами и для стабилизации биопленок на этих границах в условиях гидродинамического сдвига. Эти результаты представляют фундаментальный интерес, поскольку они расширяют существующие представления о роли жгутикования (в основном
это органелла, обеспечивающая подвижность) в прикрепленной жизни бактерий.
В работе исследованы структура и функции биополимеров матрикса биопленок Sp245T, образующихся на границе раздела фаз жидкая среда – твердая
поверхность. Для анализа использованы также
Белковые компоненты биомассы, чувствительные к действию протеаз, обеспечивают прочное соединение азоспирилл в биопленках и способствуют их фиксации на гидрофобной поверхности. В составе матрикса зрелых биопленок присутствует углеводный гаптен, обладающий специфическим сродством к АЗП.
На примере дикого и мутантного штаммов (Sp245T и Sp245.1063
) проанализирован процесс формирования бактериальной
биопленки и продемонстрированы все его этапы: адсорбция, адгезия, прирост и
стабилизация биомассы.
и его flhB1 мутанта
плотность популяции бактерий, закрепившихся на субстрате, в значительной степени определяет начало этапа прироста биомассы пленок, вне зависимости от скорости роста
Оказалось, что клетки штамма Sp245T, использующие полярный
жгутик для движения и адгезии, продолжают синтезировать эту флагеллу, оказавшись
интегрированными в состав зрелой пленки.
работе показано, что инактивация предполагаемых генов липидного метаболизма fabG1 и mmsB1 у бактерий A. baldaniorum Sp245T помимо дефектов в жгутиковании и подвижности клеток, приводит к изменению соотношение ряда жирных кислот в ЛПС, а также относительной гидрофобности, гемагглютинирующей активности, динамики агрегации клеток и эффективности формирования биопленок на абиотических поверхностях у
В данной
соответствующих мутантов.
которые являются удобной моделью для изучения вклада других структур клеточной поверхности и экзополимеров в процесс формирования и организации матрикса биопленок. Оказалось, что полисахариды, связывающие калькофлуор, и комплексы, содержащие ЛПС и белковые структуры, фиксируют зрелые биопленки на твердой поверхности и выполняют функцию каркаса. У всех исследованных в работе штаммов углеводсодержащие компоненты опосредуют прикрепление биопленок преимущественно к поверхностям с гидрофильными
биопленки мутантов, лишенных жгутиков,
свойствами.
работе задач открылись новые перспективы для дальнейших исследований. Так, впервые полученные первичные косвенные данные о присутствии в биомассе биопленок азоспирилл структур амилоидной природы дают возможность для развития исследований, направленных на выяснение универсальных механизмов, обеспечивающих формирование сложной архитектуры биопленочных сообществ. Амилоиды широко распространены среди микробов и участвуют в самых различных процессах, в частности, необходимы для образования
При реализации поставленных в
биопленок (Плакунов с соавт., 2017
).

1.
Адсорбция и адгезия клеток, прирост и стабилизация биомассы являются
основными этапами образования биопленок бактериями
биопленок и их стабилизации. Биопленки лишенного жгутиков мутанта Sp245T с
типа, содержащие меньшее количество биомассы, гидродинамического сдвига.
3. Инактивация у бактерии A. baldaniorum
ВЫВОДЫ
Azospirillum baldaniorum Sp245T на интерфазе жидкость – твердая поверхность. Начало этапа прироста биомассы биопленок азоспирилл определяется плотностью популяции бактерий, закрепившихся на субстрате, и не
зависит от скорости прироста клеток планктонных культур.
2. Полярный жгутик необходим A. baldaniorum Sp245T для
накопления биомассы
инактивированной хромосомной копией гена белка FlhB1
жгутиковой системы секреции III
более чувствительны к действию сил
к гемагглютинации и агрегации, уменьшению количества биомассы биопленок. Введение векторной плазмиды с CDS mmsB1 в клетки соответствующего мутанта, оказывает значительное положительное влияние на накопление
им биомассы в биопленках. 4.
Белковые компоненты биомассы, чувствительные к действию протеаз, обеспечивают прочное соединение бактерий в
биопленках и способствуют их фиксации на гидрофобной поверхности.
5. Полисахариды, связывающие калькофлуор, и комплексы, содержащие
липополисахариды и белковые структуры, фиксируют зрелые биопленки
.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
разработке аграрных биотехнологий, методов мониторинга окружающей среды (создание биосенсоров)
и фиторемедиации загрязненных почв.