Функционирование мезенхимных стромальных/стволовых клеток в условиях in vitro моделирования системы “регенерирующая кость/кроветворное микроокружение”

Материал и методы исследования
Материалом для исследования служила культура мультипотентных
мезенхимальных стромальных/стволовых клеток, полученных из жировой ткани
человека (ММСК-ЖТ), сокультивируемых с трёхмерным матриксом с
кальцийфосфатным покрытием (КФ), что позволяет моделировать границу раздела
кость/кроветворноемикроокружение.Работа с первичнымикультурами
мезенхимальных стволовых клеток, полученными из подкожной жировой клетчатки
человека, проводилась с соблюдением всех биоэтических норм и в соответствии с
одобрением комиссии по этике Балтийского федерального университета им. И. Канта
№1 от 22.03.2021г.
Все исследования были проведены в Центре иммунологии и клеточных
биотехнологий БФУ им. И. Канта (директор Центра – д-р мед. наук, Л.С. Литвинова).
Схема дизайна исследования представлена на рисунке 1.
Экспериментальные образцы имплантатов с микродуговым КФ покрытием,
используемых в настоящем эксперименте [Terleeva O.P. et al., 2010] были
изготовлены в электролите из наночастиц гидроксиапатита (ГАП) в институте физики
прочности и материаловедения СО РАН (Томск). Реакцию ММСК на минеральную
часть межклеточного вещества костной ткани имитировали посредством добавления
в культуру клеток подложек из коммерчески чистого титана (содержание составных
элементов в весовых процентах: 99.58 Ti, 0.12 O, 0.18 Fe, 0.07 C, 0.04 N, 0.01 H)
ВТ1.0, имеющих размер 10х10х1 мм3 и несущих рельефное (индекс шероховатости
Ra=2,0–3,0 мкм) микродуговое двустороннее КФ покрытие. Модельные образцы, при
общей толщине более 1 мм, закрывали более 50% площади поверхности в лунках
культурального планшета, что подразумевает морфофункциональные реакции клеток,
отличные от реакций в стандартной двумерной (2D) культуре клеток на пластике.
Культура ММСК-ЖТ была получена из липоаспирата жировой ткани условно
здорового человека методом механической и ферментативной дезагрегации тканей
[Zuk P.A. et al., 2001]. Липоаспират (объемом 50 мл) гомогенизировали в небольшом
объеме среды, затем ферментировали раствором коллагеназы 1 типа («Sigma», США)
в течение 60 минут при 37°C в орбитальном шейкере-инкубаторе (200 об/мин)
(«Biosan», Литва). Далее, полученную фракцию несколько раз отмывали в фосфатно-
солевом буфере. Полученную суспензию клеток стромально-сосудистой фракции
жировой ткани для дальнейшего культивирования засевали в культуральные флаконы
площадью 25 см2 и 75 см2 («Eppendorf», Германия) с плотностью посева 10-50×103
ЯСК/см2 в соответствующем объеме полной (ростовой) питательной среды на основе
αМЕМ («Sigma-Aldrich», США), содержащей: 10% эмбриональной телячьей
сыворотки («Sigma-Aldrich», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma-Aldrich», США),
пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) («Gibco Life Technologies»,
США). Определение принадлежности полученных клеток к популяции ММСК
проводилось в соответствии с морфологическими критериями International Society for
Cellular Therapy (ISCT) [Dominici M. et al., 2006].
Подсчет общего количества клеток (ОКК) в культурах ММСК осуществляли на
автоматическом счётчике клеток (Countess TM Automated Cell Counter, «Invitrogen»,
США) с использованием красителя трипанового синего 0.4% (Тrypan
blu) («Invitrogen», США). Результаты анализа выражали в 106кл/мл. Для регистрации
уровня живых и мертвых клеток в исследуемых клеточных культурах, использовали
метод проточной лазерной цитометрии с использованием проточного цитометра
«MACSQuantAnalyzer» («Miltenyi Biotec», Германия).
Для оценки дифференцировочной принадлежности первичной культуры клеток
к пулу ММСК, клетки (0,15х104 кл/мл) культивировались в течение 21 суток в 6-ти
луночных планшетах в 3 мл полной питательной среды (ППС) на основе базовой
среды αMEM («Sigma-Aldrich», США) (контрольные пробы) или на основе
специализированных дифференцировочных сред StemPro® Differentiation Kit
(«Thermo Fisher Scientific», США). Для выявления дифференцировочного потенциала
ММСК в хондрогенном, остеогенном или адипогенном направлениях, производилось
окрашивание клеток раствором альцианового синего («Sigma-Aldrich», США);
ализарина красного («Sigma-Aldrich», США) или масляного красного («Sigma-
Aldrich», США). Результаты окрашивания монослоя клеточной культуры ММСК
оценивали с использованием светового микроскопа. Интенсивность окраски
сравнивали с интактной культурой при культивировании с использованием ППС без
дифференцировочных добавок.
Для фенотипической идентификации культур ММСК до и после
культивирования в разных условиях (2D модель, 3D модель), проводили детекцию
основных маркеров ММСК (CD105, CD73, CD90) и гемопоэтических (CD45, CD14,
CD20, CD34) клеток. Иммунофенотипирование клеток осуществляли с
использованием набора MSC Phenotyping Kit human («Miltenyi Biotec», Германия).
Анализ и обработку изображений с проточного цитометра проводили с
использованием автоматического программного обеспечения «KALUZA Analysis
Software» («Beckman Coulter», США).
Определение уровней относительной экспрессии гена ALPL проводили методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя реагенты qPCRmixHS («Евроген»,
Россия), специфические зонды TaqMan и праймеры (10пМ) («Beagle», Россия).
Референсным геном служил RPLPO. Специфичность праймеров и зондов была
проведена путём выравнивания на таргетные гены, с использованием программы
Primer BLAST.
Последовательность олигонуклеотидных праймеров: используемых в
эксперименте:
F: 5′-GGGAAATCTGTGGGCATTGT-3′
ALPLR: 5′-GAGTACCAGTCCCGGTCAGC-3′
Probe: 5’- FAM-ACCACGAGAGTGAACCATGCCA-BHQ1-3′
F: 5’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3’
RPLPOR: 5′-GAGTACCAGTCCCGGTCAGC-3′
Probe: 5’- FAM-ACCACGAGAGTGAACCATGCCA-BHQ1-3′
Оптимизацию условий ПЦР проводили амплификацией пяти последовательных
10-ти кратных разведений кДНК и двумя повторами. Подбор оптимальной
температуры для каждой пары праймеров проводили, используя градиентную ПЦР
(CFX96 «BioRad», США). Для каждого образца делали три повтора на амплификаторе
(CFX96 «Bio-Rad», США). Результат ПЦР анализа был рассчитан методом максимума
второй производной (Second Derivative Maximum method), с помощью
модифицированной формулы Пфаффла.
Количественный уровень биологически активных молекул (IFNa, IFNg, IL-6,
IP-10, TNFa, RANTES, TRAIL, LIF, SCF и G-CSF) оценивали методом проточной
флуориметрии, на двухлучевом лазерном автоматическом анализаторе (Bio-Plex® 200
Systems, «Bio-Rad», США), используя коммерческие тест-системы (Bio-Plex Pro
Human Cytokine 27-plex Assay, «Bio-Rad», США). По стандартной кривой
(динамический диапазон составлял 2-32 000 пг/мл) определяли концентрацию
исследуемых молекул. Результаты выражали в пг/мл.
Количественное определение содержания остеокальцина проводили методом
иммуноферментного анализа, согласно протоколу, рекомендуемому производителем
тест-системы (N-MIDOsteocalcin ELISA, «IDS», Великобритания) на автоматическом
иммуноферментном анализаторе открытого типа «Лазурит» («DynexTechnologies»,
США). Оценка оптической плотности осуществлялась при длине волны 450 нм с
референсной длиной волны – 650 нм. Результаты выражали в нг/мл.
Длявыявлениянаправленнойостеогеннойдифференцировкив
экспериментальных культурах (2D модель, 2D_остео модель, 3D модель),
выделенные ММСК человека (0,05х106 кл/лун для 12 лун. планшетов, 0,1х106 кл/лун
для 6 лун. планшетов), культивировали при 37 °С, 100 % влажности и 5% СO2, 21
день, при смене полной питательной среды каждые 3-4 дня (1,5 мл для 12 лун.
планшетов; 2 мл для 6 лун. планшетов), состоящей из αМЕМ («Sigma-Aldrich»,
США), содержащей: 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma-Aldrich»,
США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma-Aldrich», США), пенициллина (100 МЕ/мл) и
стрептомицина (100 мкг/мл) («Gibco Life Technologies», США), каждые 3-4 дня. В
качестве среды для положительного контроля остеодифференцировки использовали
готовую остеоиндуктивную среду StemPro Osteogenesis Differentiation Kit («Thermo
Fisher Scientific», США) (2D-остео); для исследования остеоинтеграции объекта
исследования и отрицательного контроля дифференцировки (культура ММСК без
добавления образцов для испытаний – 2D модель) использовали ППС с описанным
выше составом.
Идентификацию участков минерализации в культурах ММСК с образцами
проводили через 21 сутки методом окрашивания с использованием красителя – 2%
водного раствора ализарина красного («Sigma-Aldrich», США), по стандартной
методике. Для получения микрофотографий окрашенных культур использовался
микроскоп лабораторный биологический для фазового контраста, флуоресценции и
документирования IX 51 S8F в комплекте с программным обеспечением («Olympus
Corporation», Филлипины), в режиме фазового контраста. Светочувствительность
камеры на микроскопе была одинакова на протяжении всего эксперимента.
Морфометрическое исследование площади окрашенных клеток проводили с
использованием инструментов компьютерной программы Adobe Photoshop CS6
(AdobeInc., США), согласно алгоритму, представленному в руководствах [Новицкий
В.В. и соавт., 2004; Автандилов Г.Г., 2006]. Очаги минерализации были выделены с
использованием инструмента «Волшебная палочка», для каждого центра
минерализации индивидуально подбирался допуск инструмента на основании
цветовой характеристики минерализата). После проведения измерений, площадь
каждого трехмерного очага/узелка минерализата заносилась в таблицу, а его границы
окрашивались в зеленый/лиловый цвет, для визуализации обведённых участков. Так
как съемка производилась на объективах с различным увеличением, нами были
введены поправочные коэффициенты для пересчета площади из пикселей в
квадратные микрометры. Результаты общей площади минерализации трёхмерных
очагов/узелков выражали в мм2 / см2 поверхности лунки планшета (площадь
поверхности лунки планшета составляет 4 см2) (рисунок). Число клеток с
морфологией кроветворных на микрофотографиях (размер фото – 1,51 мм2)
окрашенных культур ММСК подсчитывали на поверхности лунки планшета на
пластике, около образовавшихся трёхмерных очагов/узелков минерализации (очаги с
окраской ализариновым красным). Для оптимизации подсчёта и представления
полученных данных, вводили поправочные коэффициенты; результаты выражали в
виде количества клеток на мм2 поверхности площади лунки планшета.

Рисунок 1 – Схема дизайна исследования

Статистическая обработка полученных результатов была проведена с
использованием методов статистического описания, а также методов проверки
статистических гипотез, использующиеся в стандартных пакетах IBM SPSS Statistics
20. Для анализа исследуемых выборок данных применяли гипотезу нормальности
распределения (Колмогорова-Смирнова). Рассчитывали параметры распределений:
медиану (Ме), 25%-й (Q1) и 75%-й (Q3) квартили. Для оценки статистической
достоверности различий между исследуемыми выборками, которые не подчинялись
закону нормального распределения, использовали критерий Манна-Уитни для
независимых выборок. Для выявления взаимосвязей между исследуемыми
значениями проводили корреляционный и регресионный анализы путем вычисления
коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) и коэффициента регрессии (r)
[Кремер Н.Ш., 2004]. Различия считали статистически значимыми на уровне
значимости р<0,05. Статистическая обработка данных ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени осуществлялась с помощью специализированной программы REST 2009 v. 2.0.12. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Симулировать in vitro структурно-функциональное состояние эндоста в различные фазы ремоделирования костной ткани возможно с помощью сокультивирования мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток (ММСК) на подложках с рельефным кальцийфосфатным (КФ) покрытием. Обнаруженный нами усиленный выход остеобластов и кроветворных клеток в экспериментальной трехмерной клеточной культуре ММСК-ЖТ человека, позволил намсформулироватьгипотезуобinvitroвзаимодействииММСК, дифференцирующихся остеобластов и ГСК, с образованием остеобластных (эндостальных) кроветворных ниш [Litvinova L.S. et al., 2018]. Однако клеточные, гуморальные и молекулярные механизмы обнаруженного феномена неясны. В проведённом нами исследовании, направленном на оценку функциональной роли ММСК в условиях in vitro моделирования экспериментальной системы "регенерирующая кость/кроветворное микроокружение", было выявлено, что присутствие искусственных трехмерных матриксов (Ra=2,0-3,0 мкм) с КФ покрытием в среде культивирования ММСК, потенцирует увеличение (в 2,5 раза) содержания клеток с иммунофенотипом [CD45,34,14,20]+, по сравнению с контрольными 2D- культурами ММСК (на 14 сутки), на фоне статистически значимого снижения числа клеток, презентирующих мембранные дифференцировочные молекулы CD73 и CD90 (таблица 1). Полученные нами экспериментальные данные убедительно демонстрируют, что изменение экспрессии молекул CD90, CD73 и CD105 на клеточной мембране ММСК, может играть решающую роль в модуляции дифференцировочного потенциала ММСК в сторону остеобластов. CD90, также известный как антиген 1 клеток тимуса (Thy-1) – один из основных классических иммунофенотипических маркеров ММСК [Netsch P. et al., 2018; Saalbach A., Anderegg U., 2019]. Презентация молекулы CD73 на клеточной мембране регулируется передачей сигналов Wnt-β-катенина - одним из основных путей гомеостаза костной ткани [Spychala J., Kitajewski J., 2004]. CD73 выполняет регуляторную функцию по контролю хондрогенной и остеогенной дифференцировки ММСК, осуществляя возможное переключение этих сигнальных линий [Takedachi M. et al., 2012; Ode A. et al., 2013]. В свою очередь, молекула CD105 (эндоглин) представляет собой трансмембранный гликопротеин, один из корецепторов трансформирующего фактора роста β (TGF-β) [Shi D. et al., 2019; Brum S.T. et al., 2019]. Выявленная нами обратная корреляционная зависимость между содержанием клеток с фенотипом гемопоэтических [CD45,34,14,20]+ с числом клеток, позитивных по маркерам: CD90 (r = ˗ 0,80; p<0,002) и CD73 (r = ˗ 0,76; p<0,004), может свидетельствовать о сопряжённости процессов, происходящих в популяциях кроветворных и стромальных клеток, обусловленных дистантным (через продукты биодеградации) влиянием искусственного КФ матрикса. Таблица 1 –Фенотипические характеристики культур мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток в различных условиях культивирования in vitro (срок культивирования - 14 дней), Me (Q1 - Q3) Варианты культивирования ММСК Показатели2D модель3D модель n=6n=8 0,280,78 [CD45,34,14,20]+(0,26-0,38)(0,60-0,91) p < 0,05 93,21 95,83 [CD73]+(93,11-94,81) (94,91-96,11) p < 0,05 97,41 98,65 [CD90]+(96,65-97,79) (98,52-98,81) p < 0,05 98,9297,23 [CD105]+ (98,77-99,11)(97,03-98,35) Примечание: здесь и в таблицах 2,3: p - уровень значимости различий с соответствующей группой (2D модель), n – число проб В пользу дифференцировки ММСК в остеобласты также свидетельствует выявленный нами рост (на 40% относительно модели 2D-культивирования ММСК) экспрессии мРНК гена щелочной фосфатазы (ALPL) в 14-дневных культурах ММСК, в условиях их сокультивирования с матриксами, несущими КФ покрытие (рисунок 2). Экспрессия гена ALPL относится к ранним стадиям остеогенеза [Kim I.S. et al., 2008]. Активность ЩФ необходима для создания щелочного микроокружения, для последующей минерализации внеклеточного матрикса [Zheng, J. et al., 2018] и проявляется к 7-14 дню после контакта с остеогенными скаффолдами [Tian T. et al., 2019]. Одними из индукторов экспрессии гена ALPL являются ионы Ca2+, образующиеся при деградации биоматериала [Tian T. et al., 2019] и запускающие дифференцировку ММСК в остеобласты через экспрессию кальций-связывающих протеинов [Carlier A. et al., 2011]. Обнаруженная нами ассоциация между уровнем экспрессии гена ALPL и числом клеток, несущих молекулу СD105 (r=0,76, p<0,05), может быть интерпретирована тем, что эндоглин активирует экспрессию морфогенетического белка кости BMP-2, играющего ключевую роль в дифференцировке остеобластов, способствуя, в том числе, увеличению активности ALPL [Wu S. et al., 2018]. Интересной, на наш взгляд, оказалась выявленная позитивная взаимосвязь между уровнем экспрессии гена ALPL и числом клеток с фенотипом [CD45,34,14,20]+ (r=0,70, p<0,05) в 3D модели. Согласно ранее высказанной гипотезе о существовании в рельефе КФ микродуговых покрытий искусственных микротерриторий, способствующих дифференцировке ММСК в остеобласты [Khlusov I.A. et al., 2018], мы предположили, что последние, формируя ниши для кроветворных (в том числе, лимфоидных) стволовых клеток, способны управлять их поведением в микротерриториях, посредством клеточных контактов и секретируемых факторов роста [Zhang J. et al., 2003; Bernardo M.E., Fibbe W.E., 2013; Czekanska E.M. et al., 2014]. Рисунок 2 - Изменение относительного уровня (усл.ед.) транскрипции мРНК гена ALPL (щелочная фосфатаза) в культурах ММСК в условиях сокультивирования in vitro с трехмерным матриксом с кальцийфосфатным покрытием (Ra=2,0-3,0 мкм), срок культивирования - 14 дней В связи с вышесказанным, особый интерес в нашем исследовании представляла оценка секреции ММСК ростовых факторов, сигнальных молекул с про- и антивоспалительным, хемотаксическим действием в остеобластных и сосудистых кроветворных нишах, влияющих на ранние этапы кроветворения и участвующие в жизнедеятельности гемопоэтических клеток. Активность ММСК в 2D культуре, в отношении секреции сигнальных молекул после 14-суточного культивирования, была обусловлена ненулевой продукцией фактора стволовых клеток (stem cell factor, SCF), ингибирующего лейкемию фактора (leukemia inhibitory factor, LIF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), а также плейотропных цитокинов и хемокинов, регулирующих, в том числе, миграцию и активность кроветворных клеток. подобный профиль секретируемых факторов с балансом активаторов клеточной жизнедеятельности и их гибели, на наш взгляд, может обусловливать наличие кроветворных клеток в 2D культуре (таблицы 2, 3). На 14 сутки культивирования, в супернатантах 3D культур, нами было выявлено статистически значимое снижение (в среднем, в 2,5 раза относительно аналогичных показателей 2D культуры) содержания провоспалительных медиаторов (в частности, IFNg, IL-6, IP-10 и TNF-a, но не IFN-a) и проапоптотического фактора TRAIL (таблица 2). На сегодняшний день, роль TNFa в регуляции биологии ГСК представляется спорной: некоторые исследования показали, что TNFa подавляет функции ГСК, в то время как другие предполагают, что он инициирует их функциональную активность [Pietras E.M., 2017; Chavez J.S., Pietras E.M., 2018]. Выявлено, что TNFα, наряду с IFNγ, ингибирует рост ГСК и индуцирует их апоптоз [Baldridge M.T., King K. Y., Goodell M.A., 2011]. В то же время запуск апоптоза клеток интерферонами может быть активирован напрямую, либо посредством индукции каспазы-1, FAS и TRAIL [Masouridi-Levrat S. et al., 2016]. Последний является членом суперсемейства TNF и взаимодействует с рецепторами суперсемейства TNF [Rochette L. et al., 2019]. В свою очередь, IFN-γ индуцируемый белок-10 (IP-10, (CXCL10), провоспалительный хемокин [Mamishi S. et al., 2019], эндогенно ингибирует образование ГСК из плюрипотентных клеток, через взаимодействие с CXCR3 рецепторами [Rahman N. et al., 2017]. IL-6 - плейотропный провоспалительный цитокин [Tie R. et al., 2019; Rose-John S., 2020] также участвует в регуляции гемопоэза, метаболизме костной ткани, эмбриональном развитии и других фундаментальных процессах [Tie R. et al., 2019; Sovkova V. et al., 2021]. Таблица 2 – Содержание факторов с провоспалительной (IFNa, IFNg, IL-6, IP-10, TNFa), хемоаттрактантной (RANTES) и проапоптотической (TRAIL) активностью в супернатантах культур мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток в различных условиях культивирования in vitro (срок культивирования - 14 дней), Me (Q1 - Q3) Варианты культивирования ММСК Показатели2D модель3D модель n=6n=8 18,5617,1 IFNa, пг/мл (15,91-19,41)(17,1-18,41) 28,07 65,46 IFNg, пг/мл(20,6-35,07) (52,69-157,6) p < 0,05 380,03 484,83 IL-6, пг/мл(286,87-439,16) (459,375-510,915) p < 0,05 8,23* 19,25 IP-10, пг/мл(7,21-9,33) (16,595-48,46) p < 0,05 15,533,94 TNFa, пг/мл(10,33 – 32,12)(1,99 - 4,82) p < 0,05 2,71 4,37 TRAIL, пг/мл(2,49-2,81) (3,04-5,37) p < 0,05 32,82 11,66 RANTES, пг/мл(18,35 – 75,15) (4,09 – 15,32) p < 0,05 Учитывая вышесказанное, следует особо подчеркнуть значение выявленных нами отрицательных корреляций между содержанием [CD45,34,14,20]+ клеток с уровнем провоспалительных медиаторов в среде культивирования ММСК, в частности с TNFa (r=0,83, p<0,05) и IP-10 (r=-0,68, p<0,05). Т.е., снижение продукции молекул с провоспалительным действием может потенцировать рост числа ГСК в экспериментальной 3D модели дистантного культивирования ММСК. В то же время, выявленное нами в среде 3D модели более высокое (в 2,8 раз по сравнению с 2D моделью культивирования на пластике) содержание хемокина RANTES, может быть обусловлено увеличением числа клеток с фенотипом [CD45,34,14,20]+, что подтверждается позитивной корреляцией между этими параметрами (r=7,64, p<0,05). Установлено, что хемокин RANTES вовлечен в регуляцию развития и функциональной активности различных гемопоэтических клеток-предшественниц, в том числе, моноцитарного ряда. Его синтез осуществляется, главным образом, различными иммунокомпетентными клетками [Mikolajczyk T.P. et al., 2016]. Однако в ряде экспериментальных работ было показано, что источником RANTES могут быть также остеобласты и остеокластоподобные клетки в ответ на рост внеклеточного Ca2+ в костном микроокружении во время резорбции кости [Yano S. et al., 2005]. В связи с вышесказанным, обнаруженная нами взаимосвязь между уровнем экспрессии гена ALPL и содержанием хемокина RANTES (r=0,72, p<0,05) в 3D- модели может также свидетельствовать о синтезе этого хемокина остеобластами. Как уже упоминалось выше, ионы Ca2+, выделяющиеся при деградации биоматериала [Tian T. et al., 2019], запускают дифференцировку ММСК в остеобласты через экспрессию кальций-связывающих протеинов и являются индуктором экспрессии ЩФ и митогеном для остеобластов [Carlier A. et al., 2011]. Кроме того, отрицательная корреляция содержания RANTES с числом мертвых клеток (r=-0,82, p<0,05), обнаруженная нами в 3D культурах, может свидетельствовать о протекторном действии этого хемокина в отношении ММСК [Yano S. et al., 2005]. Далее, наряду с продукцией провоспалительных факторов, в экспериментальных культурах ММСК нами были проанализированы концентрации некоторых медиаторов, оказывающих влияние на жизнедеятельность кроветворных клеток. Согласно полученным результатам, содержание медиаторов LIF, SCF и G-CSF в супернатантах экспериментальных трехмерных культур ММСК значительно превышало (в 1,4; 2,75 и 4,2 раза) соответствующие контрольные значения 2D культур ММСК на пластике, на 14 сутки культивирования (таблица 3). SCF и G-CSF, являясь одними из ключевых членов семейства гемопоэтических факторов роста, регулируют кроветворение, способствуя увеличению клеток- предшественниц периферической крови [Mickiene G. et al., 2020]. В свою очередь LIF, в основном, продуцируется регуляторными Т-клетками [Nicola N.A., Babon J.J., 2015], стромальными клетками костного мозга [Lorgeot V. et al., 1997]. Установлено, что этот медиатор способствует самоподдержанию популяции и тотипотентности эмбриональных стволовых клеток (ЭСК); плюрипотентости гемопоэтических стволовых клеток мыши, ограничивая их дифференцировку; обеспечивает стимуляцию пролиферации миелоидных клеток и мегакариоцитопоэза, а также стимулирует дифференцировку ММСК в остеобласты (но не в адипоциты) [Sims N.A., Johnson R.W., 2012; Nicola N.A., Babon J.J., 2015]. На наш взгляд, LIF, SCF и G-CSF могут быть гемопоэтинами для наращивания ГСК, лимфоидных и гранулоцитарных прекурсоров (на фоне снижения продукции факторов с провоспалительным и проапоптотическим действием) в остеобластных микротерриториях, формирующихся in vitro из ММСК на КФ поверхности и трехмерных очагов (узелков) минерализации на пластике вокруг образцов. Вышесказанное также подтверждается выявленными нами прямыми корреляциями числа [CD45,34,14,20]+ клеток в экспериментальных 3D культурах ММСК с медиаторами - LIF, SCF и G-CSF (r=0,81, r=0,75, r=0,68; p˂0,05 во всех случаях, соответственно). Таблица 3 – Содержание гемопоэтических факторов роста (LIF, SCF, G-CSF) в супернатантах культур мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток в различных условиях культивирования in vitro (срок культивирования - 14 дней), Me (Q1 - Q3) Варианты культивирования ММСК Показатели2D модель3D модель n=6n=8 20,21 14,3 LIF, пг/мл(16,35-21,17) (8,71-16,23) p < 0,05 11,27 3,92 SCF, пг/мл(4,68-11,3) (3,61-4,66) p < 0,05 24,39 15,83 G-CSF, пг/мл(15,82-36,31) (14,47-63,61) p < 0,05 Резюмируявышесказанное,приэкспериментальномдистантном сокультивировании ММСК с 3D матриксами с КФ покрытием, на 14-е сутки регистрируется завершение провоспалительной фазы, что характеризуется снижением содержания провоспалительных (TNFa, IFNg, IP-10, IL-6) и проапоптотических (TRAIL) медиаторов в культуре клеток, а также началом дифференцировки ММСК в остеобласты (повышение экспрессии гена ALPL). Мы предполагаем, что секреция ММСК провоспалительных биомолекул in vitro, по принципу обратной связи, тормозит экспрессию их генов, что может быть ключевым моментом переключения на экспрессию ММСК остеогенных генов (в частности, ALPL). Кроме того, в условиях увеличения продукции ММСК и остеобластами факторов с остеомодулирующими свойствами, а также функцией сигнальных молекул кроветворных ниш (LIF, SCF и G-CSF), протекает закладка микротерриторий гемопоэтических стволовых клеток. Далее, нами была предпринята попытка оценить дистантное влияние образцов с КФ покрытием на формирование участков/узелков минерализации межклеточного матрикса в культурах ММСК и изменение числа клеток с морфологией кроветворных (площадь минерализации межклеточного матрикса и подсчёт числа кроветворных клеток оценивали на пластике, около экспериментальных образцов), в условиях 21- суточного культивирования. Так, при дистантном сокультивировании ММСК с образцами, несущими КФ покрытие, значительно увеличивалась суммарная площадь участков/узелков минерализации межклеточного матрикса на пластике вокруг образцов (в сравнении с контрольной 2D культурой клеток без образцов) (таблица 4). Следует отметить, что площадь участков минерализации межклеточного матрикса в полях зрения в культурах ММСК в присутствии образцов с КФ покрытием была выше, чем в 2D культурах без образцов, но менее значительной в сравнении с культивированием ММСК в остеогенной дифференцировочной среде(2D модель_остео) (2,74 (1,75 – 4,77) см2 против 3,95 (1,86 – 6,61) см2) (таблица). Таблица 4 – Суммарная площадь островков/узелков минерализации (при окраске ализариновымкрасным)вкультурах мультипотентныхмезенхимных стромальных/стволовых клеток в различных условиях культивирования in vitro (срок культивирования – 21 день), Me (Q1 - Q3) Варианты культивирования ММСК Показатели2D модель2D модель_остео3D модель n1=35n1=35n1=205 Суммарная площадь03,952,74 островков минерализации(0 - 0,15)(1,86 – 6,61)(1,75 – 4,77) (при окраске ализариновымp1 < 0,001p1 < 0,001 красным), мм2 / см2p2 < 0,05 поверхности лунки Примечание: здесь и в таблицах 5, 6: p1 - уровень значимости различий с соответствующей с группой - 2D модель, p2 - уровень значимости различий с группой - 2D модель_остео; n1 - число снимков При проведении морфометрического исследования культур ММСК на 21 сутки, в остеогенной дифференцировочной среде (2D модель_остео), количество клеток с морфологией кроветворных соответствовало контрольным значениям, тогда как анализ культуры ММСК в присутствии 3D матриксов (Ra=2,0-3,0 мкм), позволил выявить достоверное увеличение количества клеток с морфологией кроветворных около экспериментальных образцов и вокруг участков минерализации, по сравнению с контрольными значениями 2D культуры и культурами ММСК в остеогенной дифференцировочной среде (в среднем, в 3 раза) (таблица 5). Взаимосвязь между суммарной площадью островков/узелков минерализации на пластике и числом клеток с морфологией гемопоэтических в in vitro моделях ММСК также была убедительно продемонстрирована с помощью регрессионного анализа (r=0,5871, р<0,05) (рисунок 3). Важно отметить, что увеличение суммарной площади трёхмерных островков/узелков минерализации на пластике в экспериментальной 3D культуре коррелировало с ростом содержания клеток с морфологией кроветворных (r=0,89, p<0,05), а также было положительно взаимосвязано с концентрацией остеокальцина в среде культивирования (r=0,87; p<0,05). Следует отметить также наличие положительной взаимосвязи между концентрацией остеокальцина и числом клеток c морфологией кроветворных (r=0,90, p<0,05). Увеличение уровня остеокальцина, регистрируемое нами на 21 сутки культивирования (таблица 6), в супернатантах экспериментальных 3D культур ММСК относительно значений контроля, может свидетельствовать об инициации процессов формирования внеклеточного костного матрикса [Carvalho M.S. et al., 2020; Gerosa L., Lombardi G., 2021]. Таблица 5 – Содержание клеток с морфологией кроветворных в культурах мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток в различных условиях культивирования in vitro (срок культивирования – 21 день), Me (Q1 - Q3) Варианты культивирования ММСК 2D модель2D модель_остео3D модель Показатели n1=35n1=35n1=205 Число клеток с24,5127,11100,5 морфологией кроветворных(19,2 – 26,8)(21,34 – 34,50)(89,07-110,93) на мм2 снимка поверхностиp1 < 0,001 лунок планшетаp2 < 0,05 Рисунок3 – Регрессионная зависимость числа гемопоэтических клеток от суммарной площади трехмерных очагов/узелков минерализации (мм2) на пластике в in vitro моделях ММСК Таблица 6 – Содержание остеокальцина в супернатантах культур мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток жировой ткани человека в различных условиях культивирования in vitro (срок культивирования - 14 дней), Me (Q1 - Q3) Варианты культивирования ММСК Показатели2D модель2D модель_остео3D модель n=6n=6n=8 16,33 Остеокальцин,12,4822,45 (13,21 – 20,76) (20,11 – 25,23) нг/мл(11,31 - 14,38)p1 < 0,05 p1 < 0,05 p2 < 0,05 Подводя итог вышесказанному, КФ покрытие, посредством продуктов биодеградации, активирует in vitro дифференцировку части пула ММСК в остеобласты, что сопровождается снижением числа клеток, экспрессирующих маркёры ММСК [CD73, CD90, СD105]+, ростом экспрессии гена ALPL, снижением продукции ММСК сигнальных молекул с провоспалительной и проапоптотической активностью и, напротив, увеличением содержания в среде культивирования сигнальных молекул кроветворных ниш (LIF, SCF и G-CSF) (все изменения регистрировались нами на 14 сутки культивирования); увеличением суммарной площади трехмерных очагов/узелков минерализации межклеточного матрикса на пластике в полях зрения в культуре ММСК (на 21 сутки культивирования). Как следствие, появление так называемых “остеобластных ниш” в культуре ММСК способствует накоплению ГСК (в малом количестве присутствующих в первичной культуре ММСК), регистрируемого нами в виде повышения содержания клеток с фенотипом [CD45,34,14,20]+ на 14 сутки культивирования и роста числа клеток с морфологией кроветворных на 21 сутки эксперимента, через контроль гуморальных и клеточных механизмов их жизнедеятельности (рисунок 4). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Экспериментальное in vitro 3D моделирование функционирования мультипотентных мезенхимных стромальных/стволовых клеток жировых ткани (ММСК-ЖТ) в условиях системы"регенерирующая кость/кроветворное микроокружение", предпринятое нами, позволило получить новые фундаментальные знания в области физиологии ремоделирования костной ткани. Используемая нами 3D модель дистантного сокультивирования ММСК с трёхмерными матриксами с КФ покрытием, имитирующая прообраз системы кость/надкостница/костный мозг, модулирует условия функционирования ММСК, приближенные к реальным, позволяя детектировать процессы формирования костной ткани (рисунок 4). Согласно полученным нами результатам, морфофункциональные реакции ММСК на трехмерной границе раздела кровь/кость значительно отличаются от существующих представлений о физиологических механизмах функционирования ММСК в условиях 2D сокультивирования in vitro на пластике. Наше исследование убедительно продемонстрировало, что ММСК являются ключевыми регуляторами нишевых территорий, обеспечивающих формирование костной ткани. Так, согласно полученным нами результатам, остеогенная дифференцировка ММСК в присутствии 3D образцов с КФ покрытием, опосредованная продуктами биодеградации матрикса, способствует формированию in vitro «остеобластных ниш» и «ниш кроветворных клеток», посредством создания эффективной гуморально-клеточной кооперации ММСК, остеобластов и гемопоэтических клеток (рисунок 4). Полученные нами результаты, безусловно, нуждаются в дальнейшем изучении. В целом, детальное исследование закономерностей и механизмов функционирования ММСК в условиях in vitro моделирования системы "регенерирующая кость/кроветворное микроокружение, может стать перспективной стратегией для обеспечения жизнедеятельности и направленного масштабирования клеточных популяций из пула стволовых клеток в in vitro условиях, приближенных к физиологическим. Рисунок 4 - Схема, отражающая клеточные и гуморальные регуляторные механизмы остеогенеза и гемопоэза, в условиях дистантного in vitro культивирования ММСК с трёхмерным скаффолдом с кальцийфосфатным покрытием, имитирующим минеральный матрикс костной ткани ВЫВОДЫ 1. Мультипотентные мезенхимные стромальные/стволовые клетки жировой ткани (ММСК-ЖТ) человека дифференцируются в остеобласты, секретирующие остеокальцин и минерализованный костный матрикс, что сопровождается снижением экспрессии [CD73, CD90]+ маркеров стволовости, ростом экспрессии мРНК гена щелочной фосфатазы (ALPL), увеличением в культуре доли [CD45,34,14,20]+ и морфологически идентифицируемых гемопоэтических клеток в условиях экспериментального моделирования процессов регенерации системы "кость/костный мозг" при 14-21-суточном дистантном in vitro культивировании с трёхмерным скаффолдом, несущим кальцийфосфатное покрытие, имитирующее минеральный матрикс костной ткани. 2. Увеличение числа [CD45,34,14,20]+ кроветворных клеток в 14-дневной культуре ММСК-ЖТ,дистантноконтактирующихстрёхмернымматриксомс кальцийфосфатным покрытием, прямо коррелирует с содержанием в среде культивирования хемокина RANTES и уровнем экспрессии мРНК гена щелочной фосфатазы (ALPL), протекает на фоне снижения концентрации факторов с провоспалительным (IL-6, IP-10, IFNg и TNFa) и проапоптотическим (TRAIL) действием. 3. Важным фактором, способствующим росту числа гемопоэтических [CD45,34,14,20]+ клеток в трехмерной культуре ММСК-ЖТ является нарастание в супернатантах концентрации молекул LIF, SCF и G-CSF. 4. Суммарное увеличение площади островков минерализации культуры ММСК-ЖТ в условиях 21-дневного присутствия скаффолда с кальцийфосфатным покрытием, имитирующим минеральное вещество костной ткани, прямо коррелирует с ростом концентрации остеокальцина в среде культивирования и увеличением содержания морфологически идентифицируемых гемопоэтических клеток. 5. Моделирование структурно-функционального состояния костномозговых лакун костной ткани определяет способность культуры ММСК-ЖТ человека формировать in vitro прообраз системы "кость/костный мозг", посредством активной гуморальной и межклеточной кооперации в развитии минерализованного костного матрикса, как тканевого элемента гемопоэиндуцирующего микроокружения.