Гены-регуляторы синтеза экзополисахаридов в формировании биопленок Rhizobium leguminosarum
ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………………………………………. 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………………… 15
1.1. Характеристика и применение PGPR микроорганизмов …………………………… 15
1.2. Ризобиальные экзополисахариды: регуляция биосинтеза и роль в
симбиотических взаимодействиях с бобовыми растениями ……………………………… 17
1.2.1. Структура ризобиальных экзополисахаридов …………………………………………. 18
1.2.2. Гены-регуляторы синтеза экзополисахаридов у R leguminosarum ……………. 20
1.2.3. Wzx/Wzy-зависимый биосинтез экзополисахаридов у R leguminosarum …….. 24
1.2.4. Геномные регионы, участвующие в биосинтезе ЭПС ……………………………… 26
1.2.5. Роль ЭПС в бобово-ризобиальном симбиозе ……………………………………………. 31
1.3. Структурно-функциональные особенности ризобиальных биопленок и их
роль в бобово-ризобиальном симбиозе…………………………………………………………….. 36
1.3.1. Молекулярные механизмы, влияющие на формирование ризобиальных
биопленок ………………………………………………………………………………………………………… 39
1.3.2. Характеристика биопленок R. leguminosarum ………………………………………. 50
1.3.3. Роль процессов биопленкообразования в бобово-ризобиальном симбиозе . 55
1.3.4. Применение ризобиальных штаммов в качестве биопленочных
биоудобрений ………………………………………………………………………………………………….. 59
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………………………. 63
2.1. Объекты исследования ……………………………………………………………………………… 63
2.2. Состав водных растворов и питательных сред …………………………………………… 65
2.3. Реактивы и материалы ………………………………………………………………………………. 66
2.4. Олигонуклеотидные праймеры ………………………………………………………………….. 67
2.5. Методы исследования ……………………………………………………………………………….. 69
2.5.1. Выделение ДНК………………………………………………………………………………………. 69
2.5.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей и подбор
специфичных праймеров к исследуемым генам …………………………………………………. 70
2.5.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и real-time ПЦР …………………………….. 70
2.5.4. Аналитический гель-электрофорез ДНК …………………………………………………. 71
2.5.5. Определение ростостимулирующего эффекта ризосферных бактерий ….. 72
2.5.6. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4 73
2.5.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами …………………………….. 74
2.5.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК ……………………………………………….. 75
2.5.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК …………………………………………………… 75
2.5.10. Подготовка компетентных клеток E. coli ……………………………………………. 77
2.5.11. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК …………… 78
2.5.12. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом ……… 78
2.5.13. Приготовление электрокомпетентных клеток ризобий ……………………….. 79
2.5.14. Электропорация компетентных клеток ризобактерий ………………………… 79
2.5.15. Образование ризосферными бактериями биопленок на инертных
поверхностях ………………………………………………………………………………………………….. 80
2.5.16. Оценка зависимости биопленкообразования от логарифма числа живых
клеток при росте культур на несменяемой среде …………………………………………….. 81
2.5.17. Подготовка корней томата к микроскопированию ………………………………. 81
2.5.18. Оценка количества адгезированных на корнях растений ризобактерий … 82
2.5.19. Статистический анализ ………………………………………………………………………. 82
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ………………. 84
3.1. Идентификация генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR в геноме R. leguminosarum
и R. galegae ……………………………………………………………………………………………………… 84
3.1.1.Проведение сравнительного анализа последовательностей генов,
участвующих в биосинтезе ЭПС ……………………………………………………………………… 85
3.1.2. Скрининг генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR в геноме R. leguminosarum и
R. galegae. ……………………………………………………………………………………………………….. 85
3.2. Получение штаммов клубеньковых бактерий, трансформированных генами-
регуляторами формирования биопленок ………………………………………………………….. 99
3.2.1. Создание векторных конструкций на основе плазмид широкого круга
хозяев, содержащих гены, регулирующие биосинтез экзополисахаридов ………… 100
3.2.2. Рекомбинантные по генам-регуляторам формирования биопленок
ризобиальные штаммы………………………………………………………………………………….. 106
3.2.3. Оценка влияния индукции Pm промотора на штаммы,
трансформированные конструкцией pJB658GFPRosR …………………………………… 108
3.3. Изучение процессов формирования биопленок ризосферными бактериями на
инертных поверхностях и на поверхности корней растений …………………………… 109
3.3.1.Проведение детальных микроскопических исследований структур,
образуемых ризосферными бактериями на инертных поверхностях………………. 110
3.3.2. Оценка зависимости биопленкообразования диких и рекомбинантных
ризобиальных штаммов от логарифма числа живых клеток при росте культур
на несменяемой среде…………………………………………………………………………………….. 116
3.3.3. Флуоресцентная микроскопия биопленок, образованных мечеными
штаммами ризобактерий ……………………………………………………………………………… 123
3.3.4. Исследование возможности биопленкообразования рекомбинантными
ризобиальными штаммами на поверхности корней ……………………………………….. 126
3.4. Анализ влияния факторов окружающей среды на формирование биопленок
ризобиальными штаммами …………………………………………………………………………….. 131
3.5. Определение ростостимулирующего эффекта ризосферных штаммов,
синтезирующих модификаторы механизмов формирования биопленок на
поверхности корней ………………………………………………………………………………………. 139
3.5.1. Стимуляция всхожести семян ……………………………………………………………… 142
3.5.2. Влияние ризобиальных штаммов на длину корней проростков салата
латука, репы, козлятника восточного, огурца обыкновенного и клевера красного
……………………………………………………………………………………………………………………… 146
3.5.3. Влияние ризобиальных штаммов на длину гипокотилей проростков семян
козлятника восточного, огурца обыкновенного и клевера красного ………………… 151
3.5.4. Ростостимулирующий эффект ризобиальных штаммов на высоту стебля,
а также ширину и длину большего листа на побеге, на примере растений огурца
обыкновенного ………………………………………………………………………………………………. 154
ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………………….. 159
ВЫВОДЫ ……………………………………………………………………………………………………… 165
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………………………. 167
Объектами исследования в данной работе являлись: гены: pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, которые участвуют в биосинтезе ЭПС у R. leguminosarum; 114 штаммов R. leguminosarum и 3 штамма R. galegae из коллекции микроорганизмов ИБГ УФИЦ РАН «Симбионт». В опытах по определению ростостимулирующего эффекта ризосферных штаммов использовались следующие растения: салат латук (Lactuca sativa L.), репа (Brassica rapa L.), козлятник восточный (Galega orientalis Lam.), огурец обыкновенный (Cucumis sativus L.), клевер красный или луговой (Trifolium pratense L.), томат (Solanum lycopersicum L.) и рапс (Brassica napus L.). Штамм E.coli XL1 Blue был выбран для проведения экспериментов по клонированию. В исследованиях, посвященных изучению биопленкообразования ризосферными бактериями на биотических и абиотических поверхностях, применяли дикие и рекомбинантные по генам pssA, pssB, и rosR штаммы ризобактерий. Трансформацию штаммов проводили путем использования плазмид pJB658 PssB, pJB658GFP, pJB658GFP PSSA и pJB658GFP RosR.
Методы исследования. В работе использовались современные молекулярно-биологические и микробиологические методы: выделение бактериальной ДНК (Graham, 1978), ПЦР и электрофоретический анализ ее продуктов (Sambrook et al., 1989), трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК, определение нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК и их компьютерный анализ, а также автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом, анализ биопленкообразования ризосферными штаммами и их дальнейшее микроскопирование (световая и флуоресцентная микроскопия), оценка зависимости биопленкообразования от логарифма числа живых клеток при росте культур на несменяемой среде, определение количества адгезированных на корнях растений ризобактерий. Статистическую обработку
полученных результатов проводили с использованием стандартных пакетов
программы Microsoft Exсel 2010. При статистической обработке определяли средние арифметические значения из n-числа повторностей (где n≥10) и их стандартные отклонения. Для сравнения независимых выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p˂0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR в геноме
R. leguminosarum и R. galegae.
Для изучения влияния экспрессии исследуемых генов на синтез ЭПС и выживаемость ризобий в целом, был проведен скрининг 114 штаммов R. leguminosarum и 3 штаммов R. galegae из коллекции микроорганизмов ИБГ УФИЦ РАН на предмет наличия в их геноме генов регулирующих биосинтез ЭПС (pssA, pssB, rosR, prsD, prsE). Для амплификации использовали олигонуклеотидные праймеры, подобранные к кодирующей части генов. Были обнаружены 10 штаммов (8,8% от общего количества исследуемых нами штаммов R. leguminosarum), в геноме которых были идентифицированы все исследуемые нами гены. Выявлено, что в некоторых случаях гены pssA, pssB, rosR, prsD, prsE могут не идентифицироваться. В 19 штаммах (16,7% от общего количества исследуемых штаммов) мы не обнаружили ни одного из представленных генов. Такие штаммы характеризовались скудным ослизнением клеток по сравнению со штаммами, у которых были идентифицированы все исследуемые гены. В геноме R. galegae исследуемые гены не были обнаружены, что может быть связано с тем, что подобранные нами праймеры обладали высокой специфичностью к виду R. leguminosarum.
Получение штаммов ризосферных бактерий, трансформированных генами-регуляторами синтеза экзополисахаридов
Для создания конструкций с генами pssA, pssB или rosR нами была выбрана плазмида pJB658 класса BHR (широкого круга хозяев), содержащая репликон Т2, а
также индуцибельный промотор Pm, который активируется m-толуиловой
кислотой (3-метилбензойная кислота) (Sletta et. al., 2004). В качестве матрицы для ПРЦ-амплификации последовательностей соответствующих кодирующим частям генов служила тотальная ДНК штамма R. leguminosarum Pvu5, выделенного из клубеньков фасоли обыкновенной (Phaseoli vulgaris L.). Амплификацию последовательностей целевых генов осуществляли с помощью Pfu-полимеразы.
Для получения плазмидной конструкции с геном pssB, амплифицированную последовательность клонировали в вектор pJB658 (рис. 1). Благодаря наличию разных сайтов рестрикции на концах продуктов ПЦР-амплификации (BamHI и NdeI), клонируемые последовательности попадали в рамку считывания с сайта NdeI в правильной ориентации. Наличие гена в полученном векторе подтвердил ПЦР-анализ с праймером, находившемся ниже Pm промотора – FpJB658 и обратного праймера (RBamHI), подобранного к гену pssB, а также проведенное ДНК-секвенирование. Секвенированная последовательность гена pssB была гомологична зарегистрированной под номером AAB67614.2 (Janczarek and Skorupska, 2003) последовательности, представленной в GenBank у R. leguminosarum bv. trifolii.
Рисунок 1.
Схема получения конструкции pJB658 с геном pssB.
Для визуализации взаимодействия микроорганизмов с корнями растений, нами был получен вектор pJB658GFP, который использовался для создания плазмидных конструкций с генами pssA и rosR. Так целевой ген gfp был амплифицирован из вектора pJN105TurboGFP (Баймиев и др., 2011) вместе с
промотором фага Т5 при помощи специфичных праймеров, содержащих сайт
рестрикции HindIII. Далее амплифицированную последовательность ДНК клонировали в промежуточный вектор pAL-2T (рис. 2). Затем плазмиду pAL- 2TGFP обработали рестриктазой HindIII. После этого целевая последовательность ДНК была клонирована в вектор pJB658 по сайту рестрикции HindIII.
Рисунок 2.
Схема создания вектора pJB658GFP.
Далее проводили лигирование амплифицированных последовательностей генов pssA/rosR и промежуточного вектора pAL-2T. Затем вектора pAL-2T pssA/rosR и pJB658GFP обрабатывали рестриктазой NdeI. В конечном итоге, было произведено лигирование необходимого гена (pssA/rosR) и вектора pJB658GFP по липким концам (рис. 3).
Рисунок 3.
Схема получения вектора pJB658GFP с генами pssA или rosR.
Наличие целевых генов в векторе pJB658GFP подтвердил ПЦР-анализ с
праймером, находившемся ниже Pm промотора – FpJB658 и соответствующих генам «обратных» праймеров. Секвенированная последовательность гена pssA была гомологична зарегистрированной под номером AAG45930.2 (Janczarek and Skorupska, 2007) последовательности представленной в GenBank у R. leguminosarum bv. trifolii. А в случае гена rosR у R. leguminosarum bv. trifolii, зарегистрированной под номером AAB67614.2 (Janczarek, 2009).
Данными конструкциями были трансформированы компетентные клетки Е. coli, R. galegae и R. leguminosarum. В случае наличия в геноме бактерий гена gfp, клетки приобретали зеленое окрашивание и способность флуоресцировать в зелёном диапазоне при их освещении синим светом (полоса возбуждения BP 450– 490, испускания BP 515–565).
Для того чтобы проанализировать на какие фенотипические признаки влияет наличие плазмиды pJB658GFP RosR в геноме ризобактерий, нами был трансформирован штамм R. leguminosarum VSy3, изолированный из клубеньков горошка лесного (Vicia sylvatica L.), у которого ранее нами были идентифированы гены pssB и prsE, но не был идентифицирован ген rosR. Клетки полученного рекомбинантного штамма, в отличие от дикого, характеризовались большим ослизнением клеточных стенок и окрасились в зеленый цвет (рис. 4).
Рисунок 4. Дикий и трансформированный ризобиальные штаммы:
А – R. leguminosarum VSy3; Б – R. leguminosarum VSy3 pJB658GFP RosR.
Нами был проведен real-time ПЦР, в котором ген recA был использован в роли референсного гена (housekeeping), для того чтобы определить интенсивность транскрипции гена rosR во время активации промотора Pm, а также в тот момент, когда он выключен. При необходимости индукции промотора, культивировали исследуемые штаммы на питательной среде с добавлением 1 мМ m-толуиловой кислоты. Так, на примере ризобиальных штаммов, трансформированных конструкцией pJB658GFP RosR, нами было выявлено, что показатели уровня
экспрессии гена rosR, при индукции промотора Pm, в трансформированных
штаммах были значительно выше показателей уровня экспрессии исследуемого гена зафиксированных для контрольного штамма (рис. 5). При этом, значения показателей уровня экспрессии гена rosR без добавления m-толуиловой кислоты – индуктора промотора Pm, также становились в несколько раз выше контрольного значения, что обусловлено неполным блокированием операторной области этого индуцибельного промотора.
Рисунок 5. Количественный ПЦР анализ уровня транскрипции гена rosR с использованием РНК, изолированной из R. leguminosarum (контрольный штамм и рекомбинантный штамм, содержащие плазмиду pJB658GFP RosR). По оси Y – условные единицы, обозначающие уровень транскрипции гена rosR в рекомбинантных штаммах относительно дикого штамма.
Контроль – штамм R.leguminosarum VSy3 GFP, трансформированный исходным вектором pJB658GFP. Опыт 1 и 2 – штаммы R. leguminosarum VSy3 RosR и R.leguminosarum VSy12 RosR, соответственно, трансформированные плазмидой pJB658GFP RosR.
Изучение процессов формирования биопленок ризосферными бактериями на инертных поверхностях и на поверхности корней растений
Ризосферные штаммы образуют биопленки со сложной трехмерной архитектурой на абиотических поверхностях и окрашивание данной биопленки обеспечивает визуализацию ее экзополисахаридной матрицы (Fujishige et al., 2006a). Ввиду этого, нами был проведен анализ возможности формирования ризобиями биопленок на 96 луночных планшетах. Для этого исходные и рекомбинантные штаммы выращивали 48 часов в жидкой среде на шейкере при 28°С и 140 об/мин до концентрации 108-109 КОЕ/мл Далее культуру разводили
свежей питательной средой до 106 КОЕ/мл и переносили по 1 мл в лунки 96-
луночного пластикового планшета, а затем герметизировали Parafilm и инкубировали при температуре 28°С и 50 об/мин в течение 7 суток.
Микроскопические исследования проводили с помощью методов световой микроскопии, используя универсальный способ сложной окраски – окрашивание по Граму. Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму в случае ризобий, которые являются грамотрицательными бактериями – окрашивание в цвет фуксина Пфейффера (розовый цвет). В качестве положительного контроля нами был выбран штамм Pseudomonas sp. EP4 из коллекции ВНИИСХМ, который образует высокоорганизованные комплексы биопленок похожие на соты. Отрицательным контролем являлся штамм R.leguminosarum Pvu6, при микрокопировании которого мы наблюдали одиночные, планктонные клетки (рис. 6).
Рисунок 6.
Изображения, полученные при микроскопировании штаммов Pseudomonas sp. EP4 и R. leguminosarum Pvu6.
Нами было показано, что наличие в геноме штаммов R. leguminosarum Pvu5, R. leguminosarum VSy12, R. leguminosarum THy2, R. leguminosarum TPr4 дополнительной копии гена pssA или rosR положительно влияет на эффективность образования биопленок. Рекомбинантные штаммы ризобий формировали более сложные архитектурные структуры по сравнению с дикими штаммами. В случае штамма R. galegae 0702 значимых различий в биопленкообразовании между рекомбинантными и контрольными штаммами мы не выявили. Также мы исследовали на предмет биопленкообразования штаммы, содержащие в геноме ген rapA1. Экспрессия белка RapA1, который кроме свойств адгезина имеет также и
агглютинирующую способность, оказала положительное влияние на процессы
биопленкообразования на инертных поверхностях (рис. 7).
Рисунок 7. Биопленка, образованная контрольным и рекомбинантными штаммами за 7 суток: R. leguminosarum THy2, R. leguminosarum THy2 RapА1, R. leguminosarum THy2 PssA, R. leguminosarum THy2 RosR.
При этом проведенный нами анализ зависимости логарифма числа живых клеток от времени при росте культур на несменяемой среде выявил, что высокие показатели числа живых клеток от времени не всегда указывали на способность штаммов к быстрому образованию зрелой биопленки. Так, в случае контрольного и трансформированных штаммов R. leguminosarum THy2, наиболее зрелая биопленка, наблюдалась у штамма R. leguminosarum THy2 RapА1, несмотря на то, что после 2-х суточных измерений показатель количества клеток данной культуры был незначительно ниже показателей штамма дикого типа и отставал от показателей штаммов R. leguminosarum THy2 PssA и R. leguminosarum THy2 RosR (рис. 8).
Рисунок 8. Кривая роста и размножения штаммов R. leguminosarum THy2 (дикий тип), R. leguminosarum THy2 RapА1, R. leguminosarum THy2 PssA, R. leguminosarum THy2 RosR, представленная в виде логарифма.
Напротив, трансформация исследуемых штаммов генно-инженерной
конструкцией pJB658 + pssB в 2 раза уменьшала толщину биопленок (рис 9).
Рисунок 9. Относительная биомасса биопленок исходных и трансформированных штаммов бактерий после 7 суток культивирования при содержании 4,5 мМ Ca2+ в культуральной среде при 28°С. По оси Y – оптическая плотность кристаллического фиолетового, десорбированного после окрашивания биопленок, образованных на пластиковых планшетах.
Тем не менее, картина, которую мы можем наблюдать на модели образования биопленок на инертных поверхностях, не всегда может быть перенесена на модель формирования биопленок на поверхности корней, которая представляет собой среду богатую питательными веществами. Ввиду этого, нами были проведены исследования возможности биопленкообразования рекомбинантными ризобиальными штаммами на поверхности корней бобовых и небобовых растений, на примере контрольных и трансформированных конструкцией pJBGFP658 RosR штаммов. Контрольными штаммами являлись – R.leguminosarum VSy3, R. leguminosarum VSy12, опытные штаммы – R. leguminosarum VSy3 RosR, R. leguminosarum VSy12 RosR.
Так, было показано, что наличие в геноме R. leguminosarum дополнительной копии гена rosR, который кодирует регулятор транскрипции синтеза ЭПС и связан с экспрессией генов pssA и pssB, не оказывает существенного влияния на ростовые параметры растений, а также на образование клубеньков на корнях симбиотрофного растения клевера лугового. Тем не менее, эксперименты по совместному культивированию трансформированных конструкцией pJBGFP658 RosR штаммов и растений рапса, томата и клевера продемонстрировали, что в
случае обработки растений опытными штаммами, наблюдается увеличение
количества адгезированных клеток ризобактерий на поверхности корней по сравнению с контрольными штаммами (рис. 10).
Рисунок 10. Анализ уровня колонизации корней после инокуляции исходными и трансформированными штаммами (по оси ординат изменение числа бактерий в %). 1 – R. leguminosarum VSy3; 2 – R. leguminosarum VSy3 RosR; 3 – R. leguminosarum VSy12; 4 – R. leguminosarum VSy12 RosR.
Кроме того, через 7 суток после совместной инокуляции исследуемых штаммов и растений томата, нами было проведено микроскопирование его корней на предмет наличия сформированных биопленок. Выявлено, что трансформированные штаммы способны образовывать зрелые биопленки на биотических поверхностях, причем их локализация зависит от того, каким штаммом инфицирована корневая система (рис. 11). В случае R. leguminosarum VSy3 и R.leguminosarum VSy3 RosR, мы наблюдали биопленки, которые находились на поверхности главного корня. В случае же R. leguminosarum VSy12 и R. leguminosarum VSy12 RosR, бактерии колонизировали преимущественно корневые волоски и биопленки наблюдались именно в этой области.
Рисунок 11. Образование биопленок экспериментальными штаммами на поверхности корней растений томата через 7 дней совместного культивирования.
Анализ влияния факторов окружающей среды на формирование биопленок ризобиальными штаммами
Биопленкообразование представляет собой стратегию выживания ризобий и различные факторы окружающей среды в той или иной степени влияют на эту способность. Так, нами была выявлена корреляция между концентрацией Ca2+ в культуральной среде и толщиной биопленок – добавление в среду 1,5 мМ Ca2+ приводило к увеличению толщины биопленок в 2 раза, 3 мМ Ca2+ – в 4 раза, 4,5 мМ Ca2+ – в 5 раз. На процессы биопленкообразования оказывает воздействие и температурный режим – как контрольные, так и трансформированные бактерии эффективно образовывали биопленки при температуре 28oC. При культивировании ризобий при более низкой температуре (18oC) способность штаммов формировать биопленки снижалась более чем в 2 раза. При повышении температуры до 38oC статистически значимых различий в эффективности формирования биопленок, по сравнению со штаммами, культивированными при 28oC, зафиксировано не было. Кроме того, в минимальной среде ризобии формировали биопленки в 3 раза толще тех, что были образованы в богатых питательными веществами средах. Таким образом, показано, что концентрация Ca2+ в культуральной среде положительно коррелирует с биопленкообразованием, а низкие температуры и доступность питательных веществ вызывают отрицательный эффект.
Ростостимулирующий эффект штаммов синтезирующих модификаторы механизмов формирования биопленок на поверхности корней
Для того чтобы оценить ростостимулирующий эффект штаммов синтезирующих регуляторы формирования биопленок, нами была создана коллекция генетически охарактеризованных штаммов ризосферных бактерий. Так, были отобраны 5 из 10 штаммов R. leguminosarum, у которых были идентифицированы исследуемые гены, ответственные за синтез ЭПС, и наблюдалось большее по сравнению с другими штаммами коллекции ослизнение клеточных стенок: R. leguminosarum Pvu5, R. leguminosarum VSy12 (2008), R. leguminosarum LSy10 (D17), R. leguminosarum THy1, R. leguminosarum TPr3
(2004). А также 1 штамм R. galegae 0702, клетки, которого продемонстрировали
наибольшее зафиксированное нами ослизнение клеточных стенок. В качестве положительного контроля были выбраны: штамм P. aureofaciens ИБ51 «Елена» – эффективный биопрепарат, стимулирующий рост и развитие растений, а также 2 штамма, трансформированных геном rapA1 – P. aureofaciens ИБ51+RapA1 и R.leguminosarum Pvu5+RapA1. Белок, кодируемый этим геном, способствует адсорбции микроорганизмов на поверхности корней. Показано, что конститутивная экспрессия гена rapA1 в клетках микросимбионта оказывает положительный эффект на ростовые параметры растений (Нигматуллина и др., 2015; Хакимова и др., 2017a; Вершинина и др., 2019a).
Так, было выявлено, что инокуляция растений салата латука, репы, козлятника восточного, огурца обыкновенного и клевера красного исследуемыми ризосферными штаммами приводит к увеличению показателя всхожести семян, длины корней и гипокотилей проростков этих растений. Кроме того, на примере растений огурца обыкновенного, показано, что применение ризобиальных штаммов, синтезирующих ЭПС, при обработке растений, как и в случае биопрепарата «Елена», ведет к увеличению размеров листа. Штамм R. galegae 0702 также оказывает положительное действие на этот параметр.
Следовательно, штаммы R. leguminosarum Pvu5, R. leguminosarum VSy12 (2008), R. leguminosarum LSy10 (D17), R. leguminosarum THy1, R. leguminosarum TPr3 (2004)и R. galegae 0702 представляют собой PGPR и могут найти широкое применение в сельском хозяйстве в качестве эффективных биопленочных биоудобрений. Применение такого биопрепарата, который повышает всхожесть семян растений, способствует их росту и развитию, а также обладает высокой конкурентоспособностью и выживаемостью в ризосфере, целесообразно использовать и в искусственных симбиотических системах.
Таким образом, были изучены механизмы формирования биопленок ризосферными бактериями на поверхности корней растений в ассоциативных
симбиозах путем использования в качестве модификаторов данных процессов
генов-регуляторов путей синтеза ЭПС ризобий (pssA, pssB и rosR). ВЫВОДЫ
1. В результате проведенного скрининга штаммов R. leguminosarum было выявлено 10 штаммов, в которых идентифицировались гены pssA, pssB, rosR, prsD, prsE, участвующие в биосинтезе экзополисахаридов и 19 штаммов, в которых не было обнаружено ни одного исследуемого гена. Штаммы R. leguminosarum, в геноме которых отсутствовали исследуемые гены, характеризовались скудным ослизнением клеточных стенок по сравнению со штаммами с идентифицированными генами.
2. С использованием векторных конструкций pJB658GFP PssA, pJB658GFP RosR и pJB658+pssB, содержащих гены, регулирующие биосинтез ЭПС (pssA, pssB и rosR) под управлением индуцибельного промотора Pm, были получены 12 рекомбинантных по генам pssA и rosR ризобиальных штаммов, меченных флуоресцентным белком GFP, а также 5 штаммов рекомбинантных по гену pssB.
3. Микроскопические исследования структур, образованных ризобиальными штаммами на инертных поверхностях и корнях растений, показали, что наличие в геноме штаммов R. leguminosarum Pvu5, R. leguminosarum VSy12, R. leguminosarum THy2, R. leguminosarum TPr4 дополнительной копии гена pssA или rosR положительно влияет на эффективность образования биопленок. Напротив, трансформация исследуемых штаммов генно-инженерной конструкцией pJB658+pssB уменьшает толщину биопленок.
4. Обнаружено, что инокуляция растений ризобиальными штаммами, трансформированными конструкцией pJBGFP658 RosR, приводит к увеличению количества адгезированных клеток ризобактерий на поверхности корней томата по сравнению с контрольными штаммами.
5. Выявлена корреляция между концентрацией Ca2+, питательных
веществ в культуральной среде, а также температурным режимом и толщиной биопленок.
6. Показано, что инокуляция растений салата латука, репы, козлятника восточного, огурца обыкновенного и клевера красного ризосферными штаммами, трансформированными генами-модификаторами механизмов формирования биопленок на поверхности корней, приводит к увеличению показателя всхожести семян, длины корней и гипокотилей проростков этих растений. Кроме того, на примере растений огурца обыкновенного, обнаружено, что применение ризобиальных штаммов, синтезирующих ЭПС, при обработке растений, положительно влияет на параметры высоты стебля, а также длины и ширины большего листа на побеге.
Актуальность проблемы
В настоящее время в качестве альтернативы химическим удобрениям для
повышения продуктивности важных сельскохозяйственных культур, а также их
защиты от фитопатогенов, применяются биопленочные биоудобрения, которые
представляют собой стимулирующие рост растений ризобактерии (PGPR),
образующие микроколонии на поверхности корней растений (Вершинина и др.,
2017a; Pathania et al., 2020). Важным представителем группы PGPR являются
ризосферные бактерии рода Rhizobium, которые способны вступать в симбиоз с
бобовыми растениями и фиксировать атмосферный азот, образуя клубеньки на их
корнях (Kloepper et al, 2003; Хакимова и др., 2017b; Asante et al., 2020; Palai et al.,
2021; Purwaningsih et al.,2021).
Бобово-ризобиальный симбиоз является высокоспецифичным и каждый вид
бобовых растений способен нодулироваться лишь ограниченным количеством
видов ризобактерий. Тем не менее, было обнаружено, что некоторые штаммы
ризобий обладают способностью формировать неспецифические ассоциативные
взаимодействия с корнями небобовых растений, не образуя истинные клубеньки
(Perrine-Walker et al., 2007; Palai et al., 2021). Однако такие системы не стабильны,
потому что в естественных условиях ризобии, ввиду их недостаточной
выживаемости и неспособности конкурировать с хорошо адаптированными
местными штаммами микроорганизмов, вытесняются более агрессивными
микроорганизмами, нередко оказывающими негативное воздействие на растения
(Bottomley and Myrold, 2007; Ashraf, 2013). Решением данной проблемы является
регулирование формирования биопленок ризобиями в ассоциативных
симбиотических системах, так как существование ризобий в форме биопленок
позволяет им поддерживать необходимую плотность клеток в течение достаточно
длительного периода до момента взаимодействия с растением-хозяином
(Baigonussova et al., 2021). При этом они оказывают положительное влияние на
растения через прямые или косвенные механизмы: ограничивают роль
фитопатогенных микроорганизмов, повышают доступность макро- и
микронутриентов из окружающей среды и могут использоваться в качестве
недорогой и экологически безопасной технологии устранения стресса растений
(Вершинина и др., 2017a; Pathania et al., 2020; Sirghalage and Seneviratne, 2020).
Показано, что такие экологические стрессы как засоление почв, засуха, избыток
воды и воздействие патогенов, преодолеваются путем биопленокообразования
(Rekadwad and Khobragade, 2017). При этом формирование биопленки
ризобактериями также способствует и развитию симбиотических отношений,
благодаря поддерживанию необходимого уровня влажности ризосферы и pH
почвы, которые, в свою очередь, приводят к усилению обмена питательных
веществ и биоконтролю, обеспечивая развитие «здоровой» корневой системы
растений (Wang et al., 2008; Williams et al., 2008; Perez-Gimenez et al., 2009).
Экзополисахариды (ЭПС), бактериальные поверхностные полисахариды,
которые играют важную роль в биопленкообразовании ризобий, влияют на
процессы адгезии ризобактерий к корням растений, а также образование
клубеньков (Fujishige et al., 2006b; Russo et al., 2006; Wells et al., 2007; Rinaudi and
Gonzalez, 2009; Rinaudi and Giordano, 2010). Более того, их синтез в
симбиотических взаимодействиях также имеет большое значение, так как
экзополисахариды вовлечены в инфицирование и образование клубеньков, в
процесс бактериального освобождения от инфекционных нитей, развития
бактероидов, подавления реакции защиты растений и синтеза ими
противомикробных соединений (Skorupska et al., 2006; Janczarek, 2011). Кроме
того согласно результатам, полученным при исследовании влияния штаммов
ризобий на всхожесть семян различных небобовых растений, инокуляция
растений штаммами ризобий синтезирующими ЭПС, значительно увеличивает
всхожесть семян и рост проростков небобовых растений (Лавина и др., 2014;
2016a; Хакимова и др., 2017b; Castellane et al., 2015).
Таким образом, зона почвы, непосредственно окружающая корень растения,
где происходят сложные биологические и экологические процессы, называемая
ризосферой, образует среду, которая отвечает всем требованиям для
формирования биопленок. Биоплекообразование позволяет неспорообразующим
бактериям почвы колонизировать окружающую среду обитания и дает
возможность выжить в условиях экологического стресса. Ключевую роль в
процессах колонизации корней растений ризобиями и формирования биопленок
играют ЭПС. Ввиду этого, получение искусственных симбиотических ассоциаций
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
5 (8 отзывов)
4.9 (66 отзывов)
5 (91 отзыв)
4.8 (1033 отзыва)
4.9 (298 отзывов)
5 (18 отзывов)
4.2 (6 отзывов)
4.7 (96 отзывов)
4.8 (40 отзывов)
