Исследование особенностей иммунного ответа при фотозависимой иммуногенной клеточной смерти

Исследование выполнялось с использованием постоянных клеточных линий глиомы мыши GL261 и фибросаркомы мыши MCA205; а также первичных культур дендритных клеток костного мозга мышей линии C57BL/6J. Культивирование опухолевых линий проводилось согласно паспорту культуры, для дендритных клеток использовался протокол Maes et al., 2009. Работы с культурами клеток проводились в специально оборудованных стерильных помещениях, культивирование производилось в условиях СО2-инкубатора с постоянным поддержанием температуры 35оС и 5%СО2.
В качестве in vivo объектов использовались мыши линии C57BL/6J и Nude. Животные содержались в сертифицированном виварии Национального исследовательского Нижегородского государственного университета, и исследовательская работа проводилась в соответствии с требованиями приказом No267 МЗ РФ от 19.06.2003, а также в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» и отвечали требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов», и были согласованы с биоэтической комиссией ННГУ.
В работе изучались следующие фотоагенты: фотосенс (Ниопик, Россия). фотодитазин (Вета-гранд, Россия), тетра(арил)тетрацианопорфиразины, а именно порфиразин I (фенантрен, pz I) и порфиразин III (фторбензил-О-фенил, pz III) (разработанные и предоставленные ИМХ РАН).
Анализ накопления фотосенсибилизаторов и локализации в компартментах клетки проводились с использованием системы лазерной сканирующей микроскопии Axiovert 200 M LSM META NLO (Carl Zeiss, Германия) и LSM 800 (Carl Zeiss, Германия). Для окраски использовались MitoTracker Green FM (Molecular probes) для окраски митохондрий, LysoTracker Green DND-26 (Molecular probes) для окраски лизосом, Hoechst 33342 (Molecular probes) для окраски ядра, ER-Tracker Green (BODIPY) (Molecular probes) для Эндоплазматического ретикулума, CellMask Green plasma membrane stain (Molecular probes) для окраски плазматической мембраны и BODIPY FL C5-ceramide complexed to BSA (Invitrogen) для окраски Аппарата Гольджи.
Для индукции клеточной смерти использовался светодиодный излучатель с фиксированной длиной волны 630 нм. Клетки облучались в дозе 20 Дж/см2. По разработанному протоколу клетки культивировались на чашках Петри диаметром 60 мм. Загрузка фотосенсибилизатора проводилась в
течение 4 часов в бессывороточной среде. Далее облучение культуры проводилось в полной среде после отмывки от фотосенсибилизатора.
С целью определения типа клеточной смерти проводился ингибиторный анализ с использованием ингибиторов апоптоза zVAD-fmk, некроптоза – necrostatin 1, ферроптоза – ferrostatin-1s и хелатора железа DFO.
Оценка жизнеспособности проводилась 2 способами. Окраской FITC Annexin V (Invitrogen) и DAPI (Thermo Fisher Scientific) определялся процент AnV+DAPI+ популяции. Анализ выполняли на проточном цитометре BD FACSCanto. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo. Анализ МТТ (AlfaAesar) выполняли в соответствии с инструкциями производителя, и оптическую плотность измеряли при 570 нм в Synergy MX Microplate Reader (BioTek).
Для анализа высвобождения DAMPs клетки отбирались через 20-24 часа (ATP и HMGB1) после индукции. После указанной временной точки супернатант собирали и очищали от умирающих опухолевых клеток центрифугированием, замораживали при -20 ° C для последующего количественного определения HMGB1 с помощью набора для ELISA (IBL- Hamburg). Все анализы были выполнены в соответствии с инструкциями соответствующих производителей, с использованием ридера для микропланшетов Tecan Spark®.
Анализ количества высвободившегося АТФ выполняли с использованием набора для анализа жизнеспособности на основе люминесценции клеток CellTiter-Glo® (Promega, G7571). Клетки прединкубировали с фотосенсибилизатором в среде, содержащей 2% сыворотки. Далее супернатанты живых и умирающих фотоиндуцированных клеток использовали для анализа содержания АТФ.
Для обнаружения эктокальретикулина клетки отбирались через 1,5-3 часа после индукции. Кальретикулин детектировали цитофлуорометрией с предварительным иммуноокрашиванием антителами anti-calreticulin antibody (ab210431; 0.5 mg/ml).
Дендритные клетки костного мозга мыши изолировались из бедренных и большеберцовых костей мышей C57BL/6J 6-8 недель с использованием среды RPMI (GIBCO) с добавлением 5% термоинактивированной телячьей сыворотки, 20 нг / мл mGM-CSF, 1% L-глутамина и 50 мкМ 2- меркаптоэтанола. Свежую культуральную среду добавляли на 3-й день, а на 6- й и 9-й день среду обновляли для роста и размножения культуры.
Клетки-мишени GL261 и MCA205 метили 1 мкМ CellTracker Green CMFDA (Molecular Probes) в бессывороточной среде в течение 30 мин, а затем либо оставляли без воздействия, либо вызывали гибель с помощью ФДТ с применением различных фотосенсибилизаторов. Клетки собирали, промывали и совместно культивировали с дендритными клетками в
соотношении 1: 1, 1: 5 или 1:10 в течение 2 часов. Затем совместно культивированные клетки собирали, иммуноокрашивали PE-Cy-anti-CD11c (BD PharMingen, 561022) и, наконец, анализировали проточной цитометрией на BD FACSCanto. Анализ проводился с помощью программы FlowJo (v.10.0.8). Истинное поглощение CMFDA-меченого материал мертвых клеток дендритными клетками определялось с использованием стратегии стробирования как CD11c CMFDA дважды положительные клетки.
Для определения фенотипического статуса дендритных клеток после сокультивирования в течении 24 часов мертвые клетки исключали из анализа проточной цитометрии путем окрашивания SYTOX Blue (Molecular Probes, S11348). Созревание дендритных клеток анализировали с помощью иммуноокрашивания PE-Cy-anti-CD11c (BD PharMingen), APC- или eFluor 450-anti-CD86 (eBioscience), Pacific Blue-anti-CD40 (Biolegend), eFluor 45-anti- CD80 ( Thermo Fisher Scientific) и блок Fc мыши (Thermo Fisher Scientific). После совместного культивирования антигенпрезентирующих клеток с опухолевыми клетками MCA205 супернатанты собирали и определяли IL-6 с помощью иммуноферментного анализа (BioLegend, 431304).
В модели противоопухолевой вакцинации самкам мышей C57BL/6J (7- 8 недель) или Nude (6-8 недель) подкожно инъецировали 5×105 умирающих клеток MCA205 или GL261 в левый бок. На 8 день после вакцинации мышам проводили заражение опухолевыми клетками на противоположной стороне: 1×105 живых опухолевых клеток. Рост опухоли в месте заражения контролировали с помощью штангенциркуля в течение до 4 недель после
привития опухоли. Мышей выводили из эксперимента, когда опухоли становились некротическими или превышали 2 см3.
Основу дендритноклеточной вакцины составляли изолированные десятидневные культуры ДК костного мозга самок мышей линии С57BL/6J возраста 6-8 недель. Опухолевые клетки глиомы мыши GL261 были индуцированы по вышеописанному протоколу и инкубировались 24 часа. После клетки подвергались 6 циклам замораживания при -80оС и оттаиванию на водяной бане при 55оС. 2 мг протеина клеточного лизата добавлялось к суспензии 10×106 дендритных клеток на 90 минут. С целью гиперактивации
дендритных клеток, далее была проведена 24-часовая инкубация клеток с липополисахаридом (0,5 мкг/мл).
Мышам линии C57BL/6 была проведена двукратная внутрибрюшинная инъекция дендритными клетками в количестве 1×106 с перерывом в 7-8 дней. Через 7 дней после последней вакцинации проведена интракраниальная инъекция жизнеспособных клеток глиомы GL261.
В постоперационном периоде у животных оценивался неврологический статус и динамика роста опухоли методом МРТ. Послойные срезы в фронтальной плоскости с получением Т1-томограмм, взвешенных по протонной плотности, осуществляли, применяя импульсную последовательность MGEMS (multi gradient echo multi slice, «разноградиентное многослойное эхо») с параметрами: TR=1000 мс, TE=1.49мс, количество эхо – 6, FOV – 20х20 мм, матрица – изначально использовалась 128х128, а затем 256х256, толщина среза – 1 мм, количество срезов – 15, время сканирования – 17мин 04 с.
Статистический анализ был выполнен в программе GraphPad Prism (v.6.0). Для выбора статистического критерия использовался тест Д’Агостино- Пирсона на нормальность. Выживаемость клеток при ингибировании разных путей клеточной смерти анализировали при помощи t-критерия Уэлча. В экспериментах, в которых проводился количественный анализ высвобождения DAMPs и анализ фагоцитоза проводился с помощью теста Манна-Уитни. Для оценки созревания использовали t-критерий для независимых выборок с использованием критерия Уэлча или тест Манна-Уитни. Кривые выживаемости Каплана-Мейера, показывающие график развития опухоли, анализировали с помощью лог-рангового теста Мантела-Кокса. Различия между объемами опухолей в экспериментах по профилактической вакцинации против опухолей in vivo анализировали с помощью непараметрического критерия Уилкоксона.
.
Результаты и их обсуждение
Анализ накопления и локализации фотосенсибилизаторов в компартментах опухолевых клеток
Локализация фотосенсибилизатора является одним из ключевых факторов, определяющих первичные мишени при облучении и весь ход последующего развития внутриклеточных событий, включая молекулярные механизмы ответа на воздействие и тип смерти.
Описаны спектральные характеристики всех фотосенсибилизаторов, и показано накопление и локализация фотоагентов в компартментах клеток
Рисунок 1. Накопление фотосенсибилизаторов в клетках глиомы GL261 на конфокальных изображениях
глиомы мыши GL261 (Рис. 1) и фибросаркомы МСА205. Морфологически и метаболически отличающиеся типы клеток двух клеточных линий по-разному накапливали фотоагенты и реагировали на фотодинамическое воздействие.
Место накопления соединения в органеллы определяется химической природой фотоагента. Показано, что фотосенсибилизаторы фотодитазин, порфиразин I и порфиразин III локализуются в Аппарате Гольджи, но также накапливаются в эндоплазматической сети клеток глиомы мыши (Табл. 1). Фотосенс локализуется в основном в лизосомах, хотя также наблюдался в небольшом количестве в эндоплазматическом ретикулуме. Такая локализация
характерна для гидрофильных лизосомотропным эффектом.
фталоцианинов и объясняется
Таблица 1. Локализация разных фотоагентов в компартментах клеток глиомы мыши линии GL261
Фотоагент Локализация в клетках глиомы GL261
Фотосенс Фотодитазин Порфиразин I Порфиразин III
лизосомы митохондрии ЭПР Аппарат Ядро Гольджи
+–+–– ––++– ––++– ––++–
В лизосомах клеток фибросаркомы также отмечалось присутствие обоих порфиразинов. Помимо этого, в аппарате Гольджи клеток фибросаркомы МСА205 накапливается порфиразин I, в то время как порфиразин III зафиксирован в ЭПР.
Регулируемая индукция клеточной гибели и определение типа клеточной смерти опухолевых клеток
Был разработан протокол индукции клеточной смерти, который предполагает фотодинамическое воздействие на культуры опухолевых клеток с использованием выбранных фотосенсибилизаторов. Выбраны оптимальные условия облучения клеток, которые заключаются в свете длиной волны 630 нм и равномерной дозе излучения в 20 Дж/см2 (Рис. 2).
Рисунок 2. Схема индукции клеточной смерти опухолевых линий
Проанализирован тип клеточной смерти опухолевых клеток при фотодинамическом воздействии и определено, что клетки при накоплении фотосенса погибают по смешанному пути апоптоза и ферроптоза, при использовании фотодитазина – апоптоза. Порфиразины, воздействующие на опухолевые клетки запускают апоптотические программы, но также реагируют на хелаторы железа, что является предпосылкой к ферроптотической смерти. Тип клеточной гибели важен в определении
механизма гибели, ассоциированном с локализацией фотоагента в органеллах клетки (Табл. 2).
Таблица 2. Локализация в клеточных компартментах и тип клеточной смерти опухолевых клеток при воздействии разных фотосенсибилизаторов
фотосенсибилизатор
фотосенс фотодитазин
порфиразин I
порфиразин III
клеточная линия
GL261
MCA205
MCA205
накопление в органеллах
аппарат Гольджи, ЭПР
аппарат Гольджи, лизосомы
ЭПР, лизосомы
тип клеточной смерти
апоптоз
апоптоз
апоптоз, некроптоз
GL261
лизосомы
апоптоз, ферроптоз
GL261
аппарат Гольджи, ЭПР
апоптоз
GL261
аппарат Гольджи
апоптоз, ферроптоз
Анализ высвобождения DAMPs умирающими клетками фибросаркомы и глиомы мыши
В качестве DAMPs были рассмотрены ядерный белок HMGB1, свободный АТФ, испускаемый в качестве сигнала «съешь меня» и ранний эктокальретикулин. Исследована реакция двух опухолевых линий на
Рисунок 3. Высвобождение ключевых DAMPs фотоиндуцированными клетками фибросаркомы мыши МСА205. А – значения представлены кратным увеличением АТФ по сравнению с необработанными клетками ± стандартная ошибка среднего, n = 4, * – р = 0,001, критерий Манна-Уитни. Б – значения HMGB1 представлены как среднее ± стандартная
ошибка среднего, n ≥ 4, * – р = 0,01, критерий Манна-Уитни
индукцию клеточной гибели. Опухолевые клетки в течение первых трех часов после фотодинамического воздействия экспонируют кальретикулин, что является ранним маркером морфологических изменений клетки. Позже, через 18-24 часа клетки испускают АТФ и HMGB1, которые определяются в супернатантах клеток (Рис. 3). Эти молекулы позволяют сигнализировать антигенпрезентирующим клеткам о подступающей опасности. Высвобождение молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением DAMPs является важным маркером иммуногенной клеточной смерти. Проведенный количественный анализ испускаемых умирающими клетками иммуностимулирующих молекул демонстрирует иммуногенный потенциал фотоиндуцированной клеточной смерти.
Для клеточной линии глиомы GL261 показано, что наибольший выход HMGB1 вызвал порфиразин I, при этом наибольшей уровень АТФ во внеклеточной среде зафиксирован в группе клеток глиомы, обработанных фотосенсом с совокупности с ФДТ.
Определение фенотипического статуса антигенпрезентирующих клеток после сокультивирования с умирающими опухолевыми клетками
Дендритные клетки костного мозга были сокультивированы с опухолевыми линиями фибросаркомы МСА205 и глиомы GL261. В течение двух часов показано, что клетки, индуцированные всеми выбранными фотосенсибилизаторами, активно фагоцитируются антигенпрезентирующими клетками в различных соотношениях в течение 2-х часов (Рис. 4). С
Рисунок 4. Диаграммы цитофлуорометрии с окрашенными дендритными клетками на специфический маркер дифференцировки СD11c и окрашенными опухолевыми в соотношении 1:5. По оси ОУ – интенсивность флуоресценции CD11c – PE-A, окрашена популяция дендритных клеток, по оси ОХ – Cell Tracker Green-CMFDA, окрашена популяция целевых клеток
увеличением соотношения дендритных клеток к целевым фотоактивированным клеткам фагоцитирующая активность антигенпрезентирующих клеток увеличивается.
Рисунок 5. Коэффициент созревания на основе анализа CD11+CD86+ популяции дендритных клеток после сокультивирования с фотоактивированными опухолевыми клетками глиомы GL261 и фибросаркомы МСА205. Значения представлены кратным увеличением по сравнению с дендритными клетками, сокультивированными с живыми опухолевыми клетками (А) или клетками, убитыми циклами замораживания, оттаивания (Б). n ≥ 3, * – p<0.05, t-тест Уэлча Через 24 часа дендритные клетки активируются, что фенотипически отражается в экспрессии маркеров дифференцировки CD40, CD80, CD86 и молекулы гистосовместимости II класса (MHC II). Процесс кросспрезентации запускает цитотоксический противоопухолевый механизм, который представляет собой созревание CD8+Т- клеток. В результате анализа фенотипического статуса антигенпрезентирующих клеток после взаимодействия с фотоиндуцированными опухолевыми клетками показано увеличение маркера дифференцировки CD86 (Рис. 5). Помимо этого, для клеточной линии МСА205 оценено количество поверхностного CD40 и CD80. Для соединений фотосенс и фотодитазин на двух клеточных линиях показана активация CD40, запускающего активацию Т-клеточных популяций. Для порфиразинов I и III характерна индукция активирующего пути дифференцировки CD8+Т-лимфоцитов и CD4+Т-лимфоцитов, что показано как увеличение количества ко- стимулирующей молекулы CD80 на поверхности дендритных клеток (Рис. 6). 17 Рисунок 6. Коэффициент созревания на основе анализа CD11+CD80+ популяции дендритных клеток после сокультивирования с фотоактивированными клетками МСА205. Значения представлены кратным увеличением по сравнению с группами ДК+живые или ДК+FT. n ≥ 3, * - p<0.05, t-тест Уэлча. PS – фотосенс, PD – фотодитазин, pz I – порфиразин I, pz III – порфиразин III Рисунок 7. Количество экскретируемого IL-6 дендритными клетками, сокультивированными в разных соотношениях с опухолевыми клетками, сокультивированными с индуцированными фотодинамической терапией клетками фибросаркомы в соотношении 1:1, 1:5 и 1:10. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, n ≥ 4, * - р = 0,01, t-тест с поправкой Бонферрони Анализ высвобождения интерлейкинов антигенпрезентирующими клетками Показано, что в экспериментах по сокультивированию дендритных клеток с умирающими клетками фибросаркомы антигенпрезентирующие клетки высвобождают провоспалительный интерлейкин 6 (Рис. 7). Высвобождение IL-6 способствует развитию местной воспалительной реакции, а также активации незрелых дендритных клеток путем активации соответствующих рецепторов (TLR4 и P2RX7) на их поверхности. Затем происходит процессинг фагоцитированных опухолевых антигенов и их презентация зрелыми дендритными клетками для наивных T-лимфоцитов, что приводит к активации Т-клеточного ответа. В дальнейшем происходит миграция эффекторных клеток к опухоли, инфильтрация опухоли Т-клетками, распознавание опухолевых клеток Т-лимфоцитами и их уничтожение. Активация адаптивной иммунной системы в экспериментах in vivo В экспериментах in vivo исследовалась роль адаптивного иммунитета в механизме защиты от опухоли. На модели профилактической Рисунок 8. Вакцинация мышей умирающими фотоиндуцированными клетками фибросаркомы МСА205. А – кривая Каплана-Мейера иллюстрирует наличие у мышей опухоли на прививаемой стороне после вакцинации фотоактивированными умирающими клетками. Результаты представлены проентом мышей, не имеющих опухоли на прививаемой стороне. *,# - р < 0,01, логарифмический критерий Мантеля-Кокса. Б – размер прививаемой опухоли после вакцинации. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. *,# - р < 0,05, * - статистически значимое отличие от группы PBS, # - статистически значимое отличие от группы F/T, критерий Уилкоксона противоопухолевой вакцинации показано, что умирающие клетки защищают от образования и роста опухоли, при этом активируя адаптивный противоопухолевый иммунитет (Humeau et al., 2019). При действии фотосенса на опухолевые клетки вакцина оказывала 100% протективный эффект и прививаемая опухоль не развивалась. В случае эксперимента с фотодитазином 80% мышей были защищены от опухолевого роста (Рис. 8). Порфиразин III показал иммуногенный характер клеточной смерти и 90% мышей выбыли защищены от развития опухолевого очага. Проведение вакцинации фотоиндуцированными клетками фибросаркомы МСА205 иммунодефицитных мышей линии Nude подтвердило значимый вклад адаптивной иммунной системы в реализации противоопухолевого ответа (Рис. 9). Рост опухоли в области инъекции жизнеспособных опухолевых клеток наблюдался во всех экспериментальных группах в 100% случаях. При этом развитие опухолевого процесса было более интенсивным, чем у иммунокомпетентных животных. Рисунок 9. Вакцинация мышей линии Nude умирающими клетками фибросаркомы МСА205, индуцированными фотодинамичсекой терапией на основе порфиразинов I и III. . А – кривая Каплана-Мейера иллюстрирует наличие у мышей опухоли на прививаемой стороне после вакцинации фотоактивированными умирающими клетками. Результаты представлены проентом мышей, не имеющих опухоли на прививаемой стороне. *,# - р < 0,01, логарифмический критерий Мантеля-Кокса. Б – размер прививаемой опухоли после вакцинации. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. *,# - р < 0,05, * - статистически значимое отличие от группы PBS, # - статистически значимое отличие от группы F/T, критерий Уилкоксона Иммунизация животных умирающими фотоиндуцированными клетками против развития глиомы головного мозга in vivo Наиболее выраженные иммуногенные свойства в эксперименте in vivo с использованием клеток фибросаркомы мыши МСА205 проявил фотосенсибилизатор фотосенс. Также in vitro фотоактивация фотосенса вызывала высвобождение DAMPs, индукцию фагоцитарной активности дендритных клеток и их фенотипическое созревание. С использованием этого фотоагента была апробирована модель профилактической вакцинации от глиомы мыши GL261. Двойная иммунизация самок мышей линии C57BL/6J 6-8- недель фотоиндуцированными клетками глиомы линии GL261 приводила к активации противоопухолевой защиты у 100% мышей при последующей инъекции живых опухолевых клеток подкожно (Рис. 10). Также показано, что однократное введение вакцины на основе фотоактивированных клеток не вызывало активации противоопухолевой защиты. Рисунок 10. Двойная иммунизация мышей умирающими клетками глиомы GL261, индуцированными фотодинамичсекой терапией на основе фотосенса (PS). FT – клетки, подвергшиеся циклам замораживания/оттаивания. А – кривая Каплана-Мейера иллюстрирует наличие у мышей опухоли на прививаемой стороне после двойной вакцинации умирающими клетками. Результаты представлены процентом мышей, не имеющих опухоли на прививаемой стороне. * р <0,01, логарифмический критерий Мантеля-Кокса. Б – размер прививаемой опухоли после вакцинации. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего Моделирование профилактической противоопухолевой вакцинации дендритноклеточной вакциной in vivo Активированные in vitro дендритные клетки выступают в качестве мощного стимула для активации Т-клеточных популяции in vivo в модели противоопухолевой вакцинации от глиомы головного мозга (Garg et al., 2016). Вакцина на основе активированных дендритных клеток дважды вводилась животному для эффективной иммунизации. Развитие опухолевого очага в головном мозге моделировалось введением стереотаксическим координатам суспензии живых опухолевых клеток. В результате использования дендритной вакцины на основе фотоиндуцированных фотосенсом клеток, по Рисунок 11. Вакцинация мышей дендритноклеточной вакциной на основе умирающих фотоактивированных фотосенсом клеток (PS). FT – применение дендритноклеточной вакцины на основе некротически- погибших клеток глиомы. Кривая Каплана-Мейера иллюстрирует выживаемость мышей в эксперименте. Результаты представлены процентом выживших животных. * - р <0,05, логарифмический критерий Мантеля-Кокса умирающих по иммуногенному пути, показано, что выживаемость мышей значительно выше в сравнении с не иммунизированными животными (Рис. 11). При визуализации опухолевого очага животных магнитно-резонансной томографией показано, что к 11 дню после инокуляции клеток глиомы GL261 в головной мозг мыши всех экспериментальных групп имели опухоль размером от 0,41 до 0,63 см3 без выраженного некротического очага. К 18 дню после инокуляции опухоли контрольных животных в 1,3 раза превысили объем опухолей иммунизированных животных из группы «PS» (фотосенс) и составил 1,04±0.55 см3. При этом у мышей из группы негативного неиммуногенного контроля (FT) опухоли развились до объема 1,34±0,55 см3, сильно деформируя черепную коробку, углубляясь к обонятельному тракту, нарушая сосудистую сеть. Также наблюдалась обширная зона некроза в области брегмы (Рис. 12). Рисунок 12. Репрезентативные томографическое изображение фронтальных срезов головного мозга мыши с развитым опухолевым очагом (18 день после инокуляции), перенесшей прививку умирающих фотоиндуцированных фотосенсом опухолевых клеток. А – неиммунизированная мышь; Б – животное, привитое дендритноклеточной вакциной на основе клеток, подвергшихся замораживанию/оттаиванию; В – вакцинированные животное дендритноклеточной вакциной на основе иммуногенно-погибающих клеток глиомы. TR=1000 мс, FOV – 20х20 мм, толщина среза – 1 мм При оценке динамики неврологического дефицита было показано, что все животные после инокуляции опухолевых клеток до 9 дня имели легкую степень выраженности очаговой неврологической симптоматики, но к 12 дню наблюдалось умеренной степени тяжести поражение у неиммунизированных мышей. Значительная разница в неврологическом статусе иммунизированных животных зафиксирована на 18 день эксперимента по сравнению с группой контроля «PBS», при этом только к 22 дню у животных группы «PS» фиксировалась умеренная неврологическая симптоматика (Рис. 13). Рисунок 13. Изменение неврологического статуса мышей по шкале неврологического дефицита, вакцинированных дендритноклеточной вакциной на основе иммуногенно- погибающих клеток глиомы GL261 (PS) после иммунизации. FT – применение дендритноклеточной вакцины на основе некротически-погибших клеток глиомы. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. * - р <0,01, статистически значимое отличие от группы PBS, критерий Уилкоксона Таким образом, профилактическая вакцинация от глиомы головного мозга с использованием дендритноклеточной вакцины на основе фотоактивированных фотосенсом клеток глиомы показала эффективность в активации противоопухолевых иммунных процессов, увеличила выживаемость животных в эксперименте, привела к меньшему проявлению симптомов неврологического дефицита и вызывала развитие меньшего по объему опухолевого очага в сравнении с контрольными группами. Это свидетельствует о иммуногенности гибели опухолевых клеток после фотодинамического воздействия. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследованные в работе фотосенсибилизаторы (фотосенс, фотодитазин, порфиразин I и порфиразин III) активируют регулируемые формы клеточной гибели клеток фибросаркомы МСА205 и глиомы GL261 вследствие развития фотодинамической реакции в отдельных компартментах клетки. Фотоиндуцированные клетки глиомы мыши GL261 и фибросаркомы МСА205 при использовании выбранных фотосенсибилизаторов в совокупности с фотодинамической терапией экспонируют на поверхности мембраны ранний маркер иммуногенной клеточной смерти кальретикулин, высвобождают свободный АТФ, а также испускают HMGB1 во внеклеточную вреду после индукции. Важнейшим преимуществом терапии с индукцией иммуногенной клеточной смерти является непрямое воздействие на организм. Не исключая своей таргетности иммуногенная клеточная смерть позволяет активировать иммунные силы организма против опухолевого очага. Опухолевые фотоиндуцированные клетки являются мощными стимулятором фагоцитирующей активности антигенпрезентирующих клеток и обеспечивают их фенотипическое созревание. Экспонирование маркеров дифференцировки CD86, CD80 и CD40 доказывает возможность кросс- презентации опухолевого антигена Т-клеточному иммунитету. Помимо этого, антигенпрезентирующие клетки вследствие взаимодействия с фотоиндуцированными умирающими/мертвыми опухолевыми клетками испускают провоспалительный цитокин IL6. Показан противоопухолевый эффект вакцинации на основе всех исследуемых фотосенсибилизаторов на модели in vivo. На линии иммунокомпетентных мышей доказана эффективность вакцины на основе умирающих клеток фибросаркомы мыши после ФДТ воздействия. На иммунодефицитных животных доказано, что фотодинамическое воздействие с применением выбранных фотосенсибилизаторов активирует противоопухолевый адаптивный иммунитет in vivo. В модели дендритноклеточной вакцинации против глиомы головного мозга и в сингенной модели глиомы показаны противоопухолевые эффекты вакцин на основе фотоактивированных фотосенсом клеток. Активация иммуногенной клеточной смерти приводила к значительному повышению выживаемости животных в эксперименте, к меньшему проявлению симптомов очагового неврологического дефицита и меньшему развитию объема опухолевого очага в головном мозге мышей. Проведенные in vitro и in vivo исследования показали, что индукция смерти опухолевых клеток посредством фотодинамического воздействия с применением фотосенса, фотодитазина, порфиразина I и порфиразина III активирует противоопухолевый адаптивный иммунный ответ. ВЫВОДЫ: 1. Локализация фотосенсибилизаторов (фотосенс, фотодитазин, порфиразин I и порфиразин III) в клетках глиомы GL261 и фибросаркомы МСА205 ассоциируется с регулируемыми формами клеточной смерти вследствие фотодинамического воздействия; 2. Фотодинамическое воздействие с применением исследуемых фотосенсибилизаторов вызывает высвобождение ключевых DAMPs опухолевыми клетками, что свидетельствует о иммуногенном характере клеточной смерти; 3. Клетки глиомы GL261 и фибросаркомы MCA205, индуцированные фотодинамической терапией с применением фотосенсибилизаторов фотосенс и фотодитазин, порфиразин I и порфиразин III, эффективно фагоцитируются антигенпрезентирующими клетками и обеспечивают их фенотипическое созревание; 4. Умирающие опухолевые клетки, подверженные воздействию фотодинамической терапии с применением исследуемых фотоагентов, в модели профилактической противоопухолевой вакцинации защищают от образования и роста опухоли, активируя адаптивный противоопухолевый иммунитет.