Конъюгативный перенос производной F-плазмиды в клетки штаммов экстраинтестинальной Escherichia coli

Объекты и методы исследования
Объекты исследования. В работе в качестве реципиентов (R) использовали культуры
E. coli, выделенные от пациентов медицинских учреждений г. Перми с инфекциями
мочевыводящих путей (n=198) и от вынужденно забитой птицы с системным
колибактериозом (n=50). В качестве донора (D) плазмидной ДНК выступал рекомбинантный
штамм E. coli N4i pOX38 GenRCmR (Starčič Erjavec et al., 2015). Также в работе были
использованы референс-штаммы: E. coli DL82 AmpR (Rijavec et al., 2006), E. coli К12 TG1
AmpR (Данилов др., 2002), K. pneumoniae АТСС®700603, P. aeruginosa АТСС®27853 и
E. faecalis ATCC®29212, полученные из Государственной коллекции патогенных
микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича (сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России,
г. Москва).
Дизайн исследования представлен на рисунке 1.

Рисунок 1. Дизайн проведенного исследования.
Скрининг штаммов на продукцию бактериоцинов и чувствительности к
бактериоцинам проводили с помощью техники «двойного слоя» по методу «отсроченного
антагонизма» (Budič et al., 2011). Наличие бактериофага в клетках определяли с помощью
метода индукции УФ-излучением. Определение уровня неспецифической адгезии
проводили в стеклянных пенициллиновых флаконах (гидрофильная поверхность) и в
полистироловых 96-ти луночных плоскодонных планшетах («Медполимер», Россия)
(гидрофобная поверхность), согласно (Николаев, 2000). Уровень специфической адгезии
бактерий к эритроцитам человека (A0+) и куриц определяли по методу (Брилис и др., 1986).
Определение биомассы биопленок. Биопленки выращивали в плоскодонном
полистироловом планшете, биомассу биопленки определяли с помощью окраски 0,1%
генциановым фиолетовым в течение 30 мин, согласно (Merritt et al., 2005). Для оценки
массивности полимерного матрикса биопленки, выращенные в лунках черного
непрозрачного планшета (Nunc, Дания), окрашивали водным раствором konA-
тетраметилродамина («Invitrogen», Life Tecnologies, США) (500 мкг/мл) в течение 40 мин в
темноте. Массивность полисахаридного каркаса матрикса оценивали по интенсивности
флуоресценции биопленки на планшетном ридере Infinite M1000 pro (TECAN, Швейцария)
при λ возбуждения/испускания 555/580 нм (Зорина и др., 2019).
Определение чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам
проводили, согласно клиническим рекомендациям «Определение чувствительности
микроорганизмов к антимикробным препаратам» межрегиональной ассоциации по
клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ, Версия-2018-03).
Продукцию бета-лактамаз расширенного спектра детектировали с помощью метода
«двойных дисков», согласно методическим указаниям МУК 4.2.1890-04.
Характеристикаантибактериальнойсистемы«kill»-«anti-kill».ColE7-
опосредованная «kill»–«anti-kill» система создана на основе пробиотического штамма
Nissle 1917, включает генномодифицированный штамм E. coli ŽP pOX38а GmRCmR
(киллерный донор, KD), несущий на конъюгативной плазмиде ген колицина E7 (colE7) с
ДНКазной активностью, а также ген immE7 в хромосоме, и штамм E. coli N4i pOX38
GmRCmR (контрольный донор, D) без colE7 на плазмиде (Starčič Erjavec et al., 2015).
Эксперименты по конъюгативному переносу in vitro. Частоту конъюгации
оценивали в стандартной модели (полистироловый планшет) в планктоне и биопленке.
Конъюгативную смесь формировали из реципиента и донора в соотношении 4:1. Для оценки
количества жизнеспособных клеток определяли число колониеобразующих единиц
(КОЕ/мл). Клетки реципиента отбирали на среде с ампициллином (50 мкг/мл), клетки донора
– на среде гентамицином (40 мкг/мл), клетки трансконъюганта – на среде с ампициллином
(50 мкг/мл) и хлорамфениколом (50 мкг/мл). Частоту конъюгации оценивали как
соотношение числа КОЕ трансконъюгантов к КОЕ реципиентов (Guglielmetti et al., 2009).
Для оценки конъюгативного переноса на поверхности урологических катетеров
использовали коммерчески доступные модели катетеров, разрешенные к применению в
современной медицинской практике: Фолея 2-ходовой (латекс, силикон с серебряным
напылением) и Нелатона (имплантационно-нетоксичный медицинский поливинилхлорид
(ПВХ), силикон) («Apexmed International BV», Нидерланды). В экспериментах по
конъюгативному переносу в смешанных биопленках конъюгативную смесь формировали
из реципиента и донора в соотношении 4:1 (контрольная модель) или реципиент,
ассоциант/бесклеточная культуральная жидкость, донор в соотношении 2:2:1
(экспериментальная модель).
Эксперименты по конъюгативному переносу in vivo. Все опыты выполняли в
виварии на базе ФГБОУ ВО «ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера» МЗ РФ. Общий уход за
крысами и птицами осуществлялся в соответствии с ГОСТ 34088-2017 (Руководство по
содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за
сельскохозяйственными животными). Животные были разделены на три группы:
контрольная группа (К), получавшая физиологический раствор, группа, получавшая
бактерий контрольного донора (I), группа, получавшая бактерий киллерного донора (II). В
контрольные точки определяли наличие в кишечнике бактерий-реципиентов, доноров и
трансконъюгантов. Число жизнеспособных клеток рассчитывали на 1 г фекалий, частоту
конъюгации определяли аналогично эксперименту in vitro.
Полимеразная цепная реакция. Генетическое типирование изолятов проводили
методом rep-ПЦР с праймерами М13 и ERIC1/2 (Huey, Hall, 1989; Versalovic et al., 1991),
определение филогенетической группы осуществляли по методу (Clermont et al., 2013).
Детектировали гены адгезинов, факторов вирулентности, продукции бактериоцинов,
БЛРС. Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Синтол» (Россия),
согласно литературным источникам. Амплификацию ДНК проводили на термоциклере DNA
Engine Dyad (Bio-Rad, США), визуализацию полос и документирование данных
осуществляли с помощью системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).
Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных
проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Office
XP Excel и STATISTICA 10.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1.БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ
Характеристика уропатогенных E. coli. В ходе данного исследования была собрана
и проанализирована коллекция из 198 изолятов UPEC, выделенных при ИМВП от пациентов
поликлиник и стационаров. Первичная коллекция была проверена на генетическое
разнообразие, в результате молекулярного типирования были выделены 116 культур с
индивидуальным генетическим профилем. Поскольку основной задачей исследования была
оценка частоты конъюгативного переноса производной F-плазмиды, штаммы были отобраны
по фенотипу чувствительности к антибиотикам (АmpR, CmS, GenS). Таким образом, в
итоговую рабочую коллекцию были взяты 29 штаммов UPEC.
Среди исследуемых уропатогенных E. coli с помощью метода мультиплексной ПЦР
были детектированы представители 6 распознаваемых филогрупп (A, B1, B2, C, E, F), а
также U и Clad I/II. Большинство культур принадлежали к группе В2 (41,38%), которую
принято ассоциировать с высоким вирулентным потенциалом UPEC. Продукция
бактериоцинов была обнаружена у 13 штаммов, инфицирование бактериофагом выявлено
только у 4 культур. Уропатогенные штаммы E. coli проявляли разную адгезивную
активность по отношению к абиотическим поверхностям, при этом была обнаружена
достоверная разница (W-test: p=0,047) в уровнях неспецифической адгезии штаммов к
гидрофобной (Me: 5,58, Q1-Q3: 1,76-9,73) и гидрофильной (Me: 2,43, Q1-Q3: 1,39-3,41)
поверхностям. Сильная корреляция (rs=0,69) была определена для принадлежности штамма к
группе B2 и уровня гидрофобной адгезии.
Среди штаммов UPEC наибольший уровень резистентности был зафиксирован к
ципрофлоксацину (58,62% культур), цефотаксиму (44,83% культур) и левофлоксацину
(41,38% культур). Пять штаммов были отнесены к группе полирезистентных (устойчивость к
5 и более антибиотикам, согласно (Magiorakos et al., 2012). Продукция бета-лактамаз
расширенного спектра была выявлена у 9 культур (31,03%). Двадцать четыре культуры
UPEC (82,76%) обладали устойчивостью к пяти и более бактериоцинам, тринадцать штаммов
(44,83%) – более чем к пятнадцати и пять штаммов оказались нечувствительны ко всем
протестированным бактериоцинам.
Среди исследуемых штаммов самым часто детектируемым геном адгезинов был
универсальный для бактерий E. coli fimH (72,41%). Вторым по распространенности оказался
ген flu, кодирующий поверхностный антиген Ag43a (68,97%). Чуть менее половины
представителей выборки (48,28%) имели papGII. Ген iha, гомолог адгезина, был обнаружен у
44,83% штаммов. В 34,48% детектировали ген Р-фимбрий papC. С равной частотой 20,69%
встречались ген S-фимбрий sfaDE, ген нефимбриального адгезина afa/draBC, а также ген yqi,
кодирующий фимбриальный адгезин, ассоциированный с группой E. coli, патогенных для
птиц. Частота определения гена другого нефимбриального адгезина (upaG) была 13,79%, а
papGIII – 10,34%. В результате анализа встречаемости генов адгезинов среди 29 штаммов
были определены 22 индивидуальных адгезивных генотипа. Из представленной выборки
повторялись следующие комбинации генов: fimH+flu+papGII (n=3), fimH+papGII (n=2),
flu+iha+papGII (n=2), fimH+flu+iha+papGII (n=2). Вариативность сочетаний разных
детерминант адгезии представлена на рисунке 2. Выявлено, что штаммы, несущие гены
только фимбриальных адгезинов, в среднем, имели бόльшие показатели адгезии к стеклу и
эритроцитам (рис. 3, а, в), в то время как штаммы с генами только афимбриальных адгезинов
– к полистиролу (рис. 3, б).
Среди вирулентных генов, наиболее часто характеризующих группу UРЕС, самыми
распространёнными были гены системы захвата и транспорта железа chuA (62,07%) и iroN
(27,61%). Шесть штаммов (20,68%) были носителями генов цитотоксического
некротического фактора 1 (cnf1) и гемолизина (hlyA). Четыре штамма (13,79%) были
носителями гена iss, обеспечивающего резистентность к сыворотке крови, 10,98% имели ген
домен-связывающего белка Toll/интерлейкинового рецептора (tcpC). Отдельно стоит
отметить, что 27,27% штаммов имели ген позитивного регулятора конъюгации traJ.
Специфическая амплификация к гену blaCTX-M выявлена у одиннадцати (37,93%) штаммов,
вторым по частоте встречаемости оказался blaTEM (n=5; 17,24%), в двух случаях определены
гены blaSHV или blaOXA. В восьми случаях (27,58%) детектированы фрагменты интегронов.

Рисунок 2. Варианты комбинаций Рисунок 3. Уровни адгезии клеток UPEC к стеклу (а),
генов адгезинов среди штаммов полистиролу (б), эритроцитам (в) и массивность
UPEC.биопленки (г) в зависимости от присутствия генов
фимбриальных (Ф) и афимбриальных (А) адгезинов
или их комбинации (Ф+А).
Таким образом, изученные штаммы UPEC демонстрировали разнообразие
биологических свойств, определяющих их успешное существование в мочеполовом тракте.
Клинические UPEC в большинстве случаев принадлежали к филогруппе B2, проявляли
устойчивость к широкому спектру колицинов и применяемых в урологии антибиотиков,
среди культур часто встречались продуценты бактериоцинов. Исследуемые UPEC также
характеризовалиськак носителимножественныхдетерминантвирулентности,
ассоциированных с адгезией, токсинообразованием и устойчивостью к антибиотикам.
Характеристика E. coli, патогенных для птиц. За период 2016-18 гг. было
исследовано более 250 органов куриц с системной коли-инфекцией с птицефабрик
Пермского края. Для эксперимента брали по одной культуре E. coli, выделенной от каждой
птицы, всего для изучения были взяты 50 культур. По результатам ERIC-типирования среди
первичной коллекции выявлены 28 индивидуальных геномовариантов APEC.
Среди штаммов E. coli (n=28) детектированы представители семи распознаваемых
филогрупп. Чаще всего определялась группа B1 – 8 (28,57%) штаммов, вторыми по
распространенности были группы B2 и E – по 4 (14,28%) штамма, далее следовали группы А,
С и F – по 2 (7,14%) штамма, D – 1 (3,57%) штамм. Продукция бактериоцинов определена у
20 (71,43%) APEC. Присутствие бактериофага было выявлено только в двух штаммах из
коллекции (7,14%).
Бактерии APEC проявляли разную адгезивную активность по отношению к
абиотическим поверхностям, однако не было обнаружено достоверных различий в уровнях
неспецифической адгезии штаммов к гидрофобной (Me: 3,43, Q1-Q3: 0,44-13,86) и
гидрофильной (Me: 0,76, Q1-Q3: 0-6,63) поверхностям. Клетки двадцати штаммов (71,43%)
лучше прикреплялись к поверхности куриных эритроцитов, шести штаммов (21,43%) – на
поверхности человеческих, и у двух культур (7,14%) показатели адгезии не различались.
Биопленки формировали 42,85% штаммов E. coli, и их массивность значительно варьировала
внутри исследуемой выборки.
Практически у всех исследованных культур APEC выявлена устойчивость к
тетрациклину, налидиксовой кислоте и триметоприм-сульфаметоксазолу (табл. 1). Для
большинства штаммов детектирована устойчивость к ампициллину (82,13%), к цефатоксиму
и цефтазидиму не чувствительными оказались 12 (42,90%) и 11 (39,39%) культур,
соответственно. Устойчивость к аминогликозидам варьировала от 10,75% к амикацину до
46,43% к гентамицину. Уровень резистентности к фторхинолонам, напротив, сходен для
ципрофлоксацина (50,0%) и левофлоксацина (46,45%). Все APEC обладали устойчивостью к
десяти и более бактериоцинам, 11 штаммов (39,39%) – более чем к пятнадцати и 2 штамма
оказались нечувствительны ко всем протестированным бактериоцинам. Обнаружена
отрицательная слабая связь во взаимоотношении устойчивости эшерихий к антибиотикам и
бактериоцинам: устойчивые к большому спектру бактериоцинов штаммы чаще
чувствительны к антибиотикам (rs=-0,27). Интересен тот факт, что эффективность колицинов
с ДНКазной активностью не зависела от устойчивости штамма к антибиотикам, то есть
данный тип колицинов эффективен даже для мультирезистентных бактерий.
Таблица 1
Распространенность устойчивости к различным антибактериальным агентам среди
штаммов APEC
АнтибиотикиУстойчивые Бактериоцины Устойчивые Бактериоцины Устойчивые
штаммы, %штаммы, %штаммы, %
Амикацин10,7Колицины группы АE632,1
Гентамицин46,4A96,4E753,6
Тетрациклин78,6K53,6Е8J28,6
Ципрофлоксацин50,0N100Колицины группы В
Левофлоксацин46,4S492,9B100
Триметоприм82,1E185,7Ia100
Сульфаметоксазол82,1E246,4Ib96,4
Ампициллин82,1E353,6D100
Цефотаксим42,9E425,0M100
Цефтазидим39,3E560,7
Исследованные штаммы АРЕС в 92,8% случаев несли ген fimH, кодирующий
фимбриальный адгезин. Двадцать один штамм (75,0%) АРЕС имел ген адгезина iha,
относящийся к факторам патогенности диареегенных E. coli. Белок-адгезин уропатогенных
штаммов E. coli, кодируемый геном upaG, был обнаружен у 67,88%. Следующим был
специфический птичий адгезин Yqi (yqi) – 60,75%. Ген инвазина ibeA встречался у
небольшого количества APEC – 27,58%. В результате анализа встречаемости генов адгезинов
среди 28 штаммов были определены всего лишь 10 индивидуальных адгезивных генотипов.
Из представленной выборки повторялись следующие комбинации генов: fimH+iha+upaG+yqi
(n=10), fimH+iha+upaG+yqi+ibeA (n=4), fimH+iha+upaG (n=4), fimH (n=3).
Среди вирулентных генов, наиболее часто характеризующих патотип АРЕС, самым
распространённым был ген специфического птичьего гемолизина hlyF (82,1%), 75,0%
штаммов были носителями гена subAB, кодирующего цитотоксин субтилазы, характерный
для шига-токсин продуцирующих штаммов E. coli, однако при этом в представленной
выборке отсутствовали гены шигаподобных токсинов (stx1/2), интимина (eaeA) и
энтерогемолизина (ehxA). Тем не менее, широко были представлены носители генов других
энтеротоксинов из группы энтеротоксигенных эшерихий. Гены термостабильных
энтеротоксинов estI/II были детектированы у 42,85% и 82,13% штаммов, соответственно,
термолабильный энтеротоксин (eltI) был найден у 14,34%, а больше половины штаммов
(60,77%) несли ген энтероаггрегативного термостабильного энтеротоксина (eastI). Ген
системы захвата и транспорта железа iroN встречался в 67,83%. Ген iss, экспрессия которого
обеспечивает выживаемость штамма в сыворотке крови, несли 57,12% штаммов и 35,74%
имели ген iutA, кодирующий рецептор аэробактина в острове патогенности SHI-2 (Shigella
pathogenicity island 2). Специфическая амплификация к гену blaTEM выявлена у 20 (71,43%)
штаммов, вторым по частоте встречаемости оказался blaCTX-M (n=15; 53,57%) и только в
одном случае определен blaSHV. В восьми случаях детектированы фрагменты интегронов.
Гены общей патогенности (fimH, kpmsT, ompT, iroN) в выборке встречались чаще, чем
гены APEC (hlyF, yqi, iss, iutA) (F-test: p=0,029) или UPEC (F-test: p<0,01), APEC встречались чаще, чем UPEC (papC, papGII, papGIII, cnf1, upaG, usp, hlyA, sfaDE, afa/draBC, ibeA) (F-test: p<0,01), гены кишечных патогенных E. coli (IPEC) (estI, estII, eltI, eaeA, stx1, stx2, ehxA, eastI, iha, subAB) имели схожие частоты встречаемости в сравнении с общими генами, но значительно превышали частоты APEC и UPEC (F-test: p<0,01) (рис. 4). По результатам кластерного анализа наличия генов патогенности были выделены три условных группы штаммов APEC (рис. 5): патогенные для птиц и человека (наличие одновременно 2-6 генов, связанных с АРЕС, и 2-6 генов, связанных с ExPEC или IPEC; 24 штамма), патогенные для птиц и не патогенные для человека (наличие 2-6 генов, связанных с APEC, и 0-1 гена, связанного с ExPEC или IPEC; 2 штамма) и непатогенные (0-1 ген из любой группы, APEC, ExPEC, IPEC, 2 штамма). Рисунок 4. Соотношение генов, общих для всех Рисунок5.Кластерный анализ патотипов, APEC, IPEC и UPEC в штаммах распределения генов патогенности коллекции APEC.среди штаммов APEC. Таким образом, данная часть исследования показала, что штаммы APEC, циркулирующие на предприятиях птицеводства, устойчивы к большому числу антибиотиков, а более половины изолятов являются мультирезистентными. Изученные штаммы продуцируют бета-лактамазы TEM и CTX-M типа, большинство из которых ассоциировано с интегронами 1 класса. Кроме того, в условиях сельскохозяйственного производства начинают формироваться эковары APEC с высоким уровнем устойчивости не только к антибиотикам, но и к бактериоцинам. Подавляющее большинство штаммов были охарактеризованы как патогенные для птиц и человека, что свидетельствует о потенциале APEC как резервуаре факторов вирулентности для возбудителей инфекций человека. В их геноме присутствовали одновременно гены вирулентности, характерные для нескольких патотипов, при этом многие штаммы APEC по генетическому профилю имели сродство с группой диареегенных эшерихий. 2.КОНЪЮГАТИВНЫЙ ПЕРЕНОС В КЛЕТКИ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI Конъюгативный перенос в клетки штаммов уропатогенной E. coli. Оценку эффективности переноса плазмиды проводили в стандартной модели – плоскодонном полистироловом планшете. Частота переноса плазмиды pOX38 в уропатогенные штаммы E. coli в условиях планктонного роста в течение 6 ч варьировала от 1,28Е-05±1,03Е-05 до 1,26Е+00±2,05Е-01. Усредненные показатели эффективности горизонтального переноса в планктоне и биопленке составили Me: 3,54E-04, Q1-Q3: 1,02Е-04-1,08Е-02 и Me: 1,15Е-02, Q1-Q3: 3,84Е-04-1,43Е-01, соответственно. Частота передачи плазмиды была значительно выше в условиях биопленки, чем в планктоне (W-test: р=0,015) (рис. 6). Корреляция между частотой конъюгации и биомассой смешанной биопленки была отрицательной и составила rs=-0,41 для планктона и rs=-0,44 для биопленки. В связи с этим штаммы-реципиенты были разделены на две группы в зависимости от толщины сформированной 6-часовой биопленки. Считали, что штаммы, имеющие показатель ОП<0,3, формируют тонкие биопленки, а штаммы с ОП≥0,3 – толстые биопленки. Показано, что эффективность переноса плазмиды pOX38 в условиях тонкой биопленки (Me: 2,46E-02, Q1-Q3: 7,09E-03-2,73E-01) была выше, чем в толстой (Me: 3,77E-04, Q1-Q3: 2,20E-04-6,63E-03) (U-test: p=0,008) (рис. 7). Штаммы, имеющие множественную устойчивость к антибиотическим агентам (5 и более), достоверно не отличались по частоте конъюгации от штаммов, устойчивых менее чем к 5 антибиотикам в условиях планктонного роста. Однако конъюгативный перенос плазмиды был эффективнее в группе с множественной устойчивостью (Me: 7,29Е-02, Q1-Q3: 1,02Е-04-4,74Е-01 против Me: 3,11Е-04, Q1-Q3: 1,02Е-04-4,75Е-03). В биопленочной модели эффективность трансфера плазмиды в штаммы, имеющие устойчивость к 5 и более антибиотикам, также была выше по сравнению с другой группой (U-test: p=0,043). Рисунок 6. Частота конъюгации в клетки Рисунок 7. Частота конъюгации в клетки UPEC в планктоне и биопленке.UPEC в толстой и тонкой биопленке. Конъюгативный перенос в биопленках на поверхности урологических катетеров. На рисунке 8 представлены внешний вид, 3D-изображения рельефа и характеристика поверхности катетеров, использованных в работе. Биопленки, сформированные на поверхности урологических катетеров штаммами UPEC (n=6), различались по массивности. На латексе были образованы самые толстые биопленки Me: 0,139 ед. ОП, Q1-Q3: 0,112-0,231 ед. ОП, а на силиконе – тонкие Me: 0,034 ед. ОП, Q1-Q3: 0,032-0,042 ед. ОП (табл. 2). Необходимо отметить, что на силиконовом катетере с серебряным напылением биомасса биопленок не была определена, так как показатель оптической плотности отрицательного контроля (стерильный катетер) был выше, чем в опытах. Это объясняется следующим: биопленки на данном катетере были небольшие (согласно значениям ОП570), но при этом краситель не проникал в материал, а сам катетер (отрицательный контроль) активно его адсорбировал. Частота конъюгации в биопленках на поверхностях катетеров различалась. Однако статистически значимые отличия были получены только в отношении силиконового катетера, покрытого напылением серебра (W- test: p=0,027 в сравнении с остальными типами катетеров). Гидрофобность11,2617,5520,52103,95 (мкг/мл) Шероховатость0,1600,2730,4571,560 (Ra, мкм) Рисунок 8. Внешний вид, 3D-изображения рельефа и характеристика поверхности урологическихкатетеров(использованыфотографиикатетеровссайта http://www.apexmed.ru, 3D-изображения получены с помощью оптического цифрового 3D- видео микроскопа Hirox KH-7700 (Япония)). Таблица 2 Частота конъюгации и биомасса биопленок на поверхности катетеров Поверхность№Частота конъюгацииБиомасса, ед. ОП (570 нм) Латекс12,77E-020,094 (2,94Е-03-2,78Е-02)(0,076-0,150) 5,90E-020,042 ПВХ2 (6,45E-03-3,18Е-02)(0,033-0,059) р1 1,44E-030,052 Силикон3 (9,88E-05-9,35E-03)(0,048-0,060) р1 Силикон с серебряным4н.п. (2,89Е-06-0,00E+00) р1,2,3 напылением Примечание. н.п. – не представлено, рn – показатель достоверно отличается от поверхности n (W-test). Несмотря на технические проблемы с измерением биомассы биопленки, формирующейся на «серебряном» катетере, для остальных материалов была обнаружена сильная отрицательная зависимость эффективности конъюгативной передачи плазмиды pOX38 от толщины биопленки E. coli (rs=-0,88). Штаммы, формирующие менее массивную биопленку, имели бόльшую эффективность сопряжения и передачи плазмиды. То есть мы наблюдаем сходные тенденции (как и в экспериментах на полистироле) в отношении межклеточного взаимодействия эшерихий в различных по толщине биопленках. Конъюгативный перенос в смешанных биопленках. При сравнении общей массивности моновидовых и дуальных биопленок показано, что совместный рост E. coli c K. pneumoniae или P. aeruginosa давал преимущество в формировании более массивной биопленки (W-test: p<0,01), в то время как показатель биомассы биопленок E. coli+E. faecalis не изменялся по сравнению с контрольным вариантом (DL-82+D) (рис. 9, а). Влияние экзометаболитов данных ассоциантов на формирование 24-часовой биопленки E. coli также различалось: бесклеточная культуральная жидкость (БКЖ) K. pneumoniae не изменяла показатель биомассы по сравнению с контрольным вариантом (DL-82+D+LB), в то время как в вариантах с E. faecalis и P. aeruginosa были зарегистрированы более высокие показатели биомассы биопленок (W-test: p<0,01). Показано, что полимерный матрикс биопленки E. coli+P. aeruginosa был наиболее массивный (W-test: p<0,05 по сравнению со всеми вариантами) и не различался в других вариантах с добавлением клеточного компонента (рис. 9, б). При росте E. coli с БКЖ других бактерий были получены аналогичные результаты: самый высокий показатель флуоресценции был зарегистрирован для биопленки E. coli+P. aeruginosaБКЖ, в то время как биопленки с БКЖ других видов не различались по массивности матрикса. а)б) Рисунок 9. Показатели (а) биомассы биопленок и (б) массивности внеклеточного матрикса биопленок E. coli при совместном росте с клетками других бактерий и их супернатантами: 1 – DL-82+D, 2 – DL-82+D+LB, 3 – DL-82+D+K. pneumoniaeкл, 4 – DL-82+D+K. pneumoniaeБКЖ, 5 – DL-82+D+E. faecalisкл, 6 – DL-82+D+E. faecalisБКЖ, 7 – DL-82+D+P. aeruginosaкл, 8 – DL- 82+D+P. aeruginosaБКЖ. Частота конъюгативного переноса производной F-плазмиды в контрольных вариантах биопленок E. coli составила в среднем 2,48E-03±2,95E-03 (DL-82+D) и 4,72E-04±2,28E-04 (DL-82+D+LB) (табл. 3). При совместном росте E. coli и K. pneumoniae частота передачи плазмиды внутри биопленки значительно не изменялась, а присутствие клеток E. faecalis и P. aeruginosa снижало данный показатель (W-test: p=0,008). Ингибирующее действие на межклеточные контакты оказывали также метаболиты выбранных ассоциантов. Так при добавлении к конъюгативной смеси БКЖ K. pneumoniae и E. faecalis частота переноса снижалась примерно на 1,5 порядка, а в присутствии БКЖ P. aeruginosa конъюгация полностью отсутствовала. Таблица 3 Частота конъюгации в присутствии бактерий-ассоциантов и их метаболитов Ассоциация№ п/пЧастота конъюгации Клеточный компонентБКЖ Контроль (DL-82+D)12,48E-03 ± 2,95E-034,72E-04 ± 2,28E-04 DL-82+D+K. pneumoniae22,69E-04 ± 1,01E-044,93E-05 ± 3,66E-05* DL-82+D+E. faecalis31,78E-05 ± 5,38E-06*1,93E-05 ± 4,17E-07* DL-82+D+P. aeruginosa42,93E-05 ± 3,07E-05*0 Примечание. * – показатель достоверно отличается от контроля (W-test). Таким образом, показано, что частота конъюгативного переноса в клетки штаммов E. coli определяется такими биологическими свойствами реципиентов как форма существования бактерий (планктонная или сессильная), уровнем биопленкообразования и резистентности к антимикробным препаратам. Физико-химические параметры материалов такие, как гидрофобность и шероховатость, определяют массивность образующихся на них бактериальных биопленок и опосредовано – частоту конъюгации в бактериальных сообществах. По нашим данным, в смешанных культурах бактерий частота конъюгативного переноса определяется не характером взаимоотношений участников сообщества, но самим фактом присутствия физической помехи для межклеточного контакта. Конъюгативный перенос в клетки штаммов патогенной для птиц E. coli. Для выполнения основной задачи исследования – оценки частоты конъюгативного переноса производной F-плазмиды, штаммы необходимо было отобрать по фенотипу чувствительности к антибиотикам (AmpR, CmS, GenS). После фенотипического анализа антибиотикограммы в эксперименты по конъюгативному переносу удалось включить только 6 штаммов АPEC. Частота конъюгативного переноса варьировала в пределах 10Е-06–10Е-02 и была выше в формирующейся биопленке (Me: 7,38E-03, Q1-Q3: 1,28E-03-2,14E-02), чем планктоне (Me: 1,09Е-05, Q1-Q3: 5,35E-06-2,87E-05) после 6 ч культивирования (W-test: p=0,027) (табл. 4). С целью оценки возможности практического применения механизма конъюгативного переноса генов с использованием генно-модифицированного штамма была проведена серия экспериментов in vitro и in vivo, доказывающая пригодность бактериальной «kill»-«anti-kill» системы в качестве метода профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, например, в сфере ветеринарной медицины. Таблица 4 Частота конъюгации в планктоне и биопленке APEC через 6 ч ШтаммЧастота конъюгацииБиомасса, ед. ОП (570 нм) ПланктонБиопленкаСмешанная биопленка RB15,39E-06 ± 7,62E-061,92E-04 ± 2,72E-040,143 ± 0,012 RB25,33E-06 ± 7,54E-061,08E-02 ± 1,52E-020,114 ± 0,024 RB33,27E-05 ± 4,36E-054,01E-03 ± 5,65E-030,305 ± 0,044 RB47,17E-05 ± 7,91E-053,73E-04 ± 3,73E-040,382 ± 0,031 RB51,64E-05 ± 2,33E-056,36E-02 ± 9,00E-020,373 ± 0,041 RB64,58E-06 ± 6,00E-062,50E-02 ± 3,54E-020,143 ± 0,012 Оценка эффективности конъюгативной передачи гена colE7 в клетки штаммов патогенной для птиц E. coli in vitro. В экспериментах с контрольным донорным штаммом E. coli N4i частота конъюгативного переноса через 24 ч варьировала в пределах 10Е-06–10Е- 02 и была выше в модели биопленки (Me: 2,13E-03, Q1-Q3: 7,10E-04-6,83E-03), по сравнению с планктоном (W-test: p=0,07) (табл. 5). Во всех вариантах конъюгации с киллерным донором E. coli ŽP и штаммами-реципиентами трансконъюганты не были детектированы. Данный результат означает, что клетки реципиентов, получившие сolЕ7-ген посредством конъюгативного переноса, экспрессировали его и лизировались за счет ДНК-азной активности колицина. Эксперимент по конъюгативному переносу плазмиды показал возможность эффективной передачи pOX38 в клетки штаммов E. coli, выделенных от птиц. Из представленных результатов можно сделать предположение, что генно-модифицированные бактериальные штаммы с встроенной конъюгативно-опосредованной антибактериальной системой могут быть применены в практических целях, например, для создания пробиотических препаратов направленного действия, и требуют дальнейшего изучения. Таблица 5 Количество клеток доноров, реципиентов, трансконъюгантов и частота конъюгации в планктоне (А) и биопленке (Б) после 24 ч экспозиции А E. coli N4i (контрольный донор)E. coli ŽP (киллерный донор) Штамм APEC DRTƳKDRTƳ RB11,04E+07 1,70E+08 2,10E+05 1,33E-03 3,14E+07 9,13E+070- ±1,13E+06±2,50E+07±7,25E+04±6,22E-04±2,13E+06±3,75E+06 RB21,76E+06 1,16E+08 2,62E+06 2,46E-02 8,43E+07 3,86E+070- ±6,63E+05±1,13E+07±2,21E+06±2,13E-02±5,08E+07±3,63E+06 RB35,71E+07 5,50E+07 2,16E+05 2,92E-03 1,70E+08 6,80E+070- ±2,79E+07±2,25E+07±2,01E+05±2,46E-03±3,40E+07±1,45E+07 RB41,74E+06 3,65E+08 1,84E+05 5,03E-04 2,03E+07 1,59E+080- ±5,63E+05±1,56E+07±1,66E+05±4,55E-04±1,45E+07±3,63E+07 RB52,36E+07 2,89E+08 1,13E+04 3,94E-05 6,83E+07 1,88E+080- ±7,63E+06±4,88E+07±1,25E+03±2,31E-06±4,75E+07±3,25E+07 RB63,88E+07 2,79E+07 2,80E+05 8,13E-03 2,35E+08 3,58E+070- ±1,13E+07±1,46E+07±2,20E+05±3,63E-03±1,84E+08±2,34E+07 Б E. coli N4i (контрольный донор)E. coli ŽP (киллерный донор) Штамм APEC DRTƳКDRTƳ RB11,15E+07 1,15E+07 5,13E+02 4,89E-05 7,94E+06 3,04E+070- ±6,15E+06±1,04E+06±3,63E+02±2,06E-05±1,29E+06±2,67E+07 RB24,07E+06 7,76E+06 7,38E+03 1,60E-03 3,43E+07 3,03E+070- ±3,81E+06±3,56E+06±6,88E+03±3,42E-04±2,22E+07±2,62E+07 RB35,32E+06 4,78E+06 1,13E+03 2,13E-04 4,70E+06 5,25E+060- ±3,93E+06±8,75E+05±7,75E+02±1,23E-04±2,08E+06±2,00E+06 RB48,16E+06 3,96E+07 2,49E+04 5,58E-04 1,48E+06 2,83E+070- ±3,44E+06±7,56E+06±1,91E+04±3,76E-04±3,25E+05±2,50E+07 RB57,43E+06 2,02E+07 2,50E+01 8,47E-06 1,55E+06 2,96E+060- ±3,07E+06±1,73E+07±2,50E+01±8,47E-06±3,00E+05±1,16E+06 RB67,82E+06 2,01E+07 1,10E+03 2,40E-04 9,38E+06 7,74E+060- ±3,20E+06±1,75E+07±1,00E+02±2,13E-04±3,63E+06±5,26E+06 Примечание. D – контрольный донор, КD – киллерный донор, R – реципиент, Т – трансконъюгант, Ƴ – частота конъюгативного переноса. Количество клеток представлено в КОЕ/мл. Оценка эффективности конъюгативной передачи гена colE7 in vivo. Первый эксперимент по конъюгативному переносу плазмиды in vivo проводили на 30-дневных самцах беспородных крыс, разделенных на три группы (контрольная и две опытные). В предварительных исследованиях в кишечнике крыс не были обнаружены E. coli, устойчивые к ампициллину, хлорамфениколу и гентамицину. Трансконъюгантные E. coli с фенотипом AmpRCmR были детектированы на третий день после введения реципиента, в среднем их число составило 2,15Е+02±1,75Е+02 КОЕ/г, а частота конъюгации была 6,07Е-02±5,58Е-02 (табл. 6). В данной группе наблюдался рост числа клеток как штамма донора, так и реципиента в течение всего времени эксперимента. В группе II число жизнеспособных клеток киллерного донора и реципиента в те же сроки составило 1,50Е+04±1,25Е+03 КОЕ/г и 2,19Е+03±1,25Е+03 КОЕ/г, соответственно. В последующие сроки наблюдалось увеличение количества клеток E. coli ŽP до 10Е+07 КОЕ/г, в то время как число реципиентов незначительно возросло после первого введения. Трансконъюганты в данной группе не детектировались ни в один из контрольных сроков. В контрольной группе во все сроки не были обнаружены E. coli, устойчивые к ампициллину, хлорамфениколу и гентамицину. Второй эксперимент по конъюгативному переносу in vivo проводили на маньчжурских перепелах (Coturnix coturnix). Учитывая результаты колонизации кишечника животных донорными штаммами в первом эксперименте, в модели с маньчжурскими перепелами введение реципиента и оценку конъюгативного переноса проводили на более ранних сроках. Уже через двое суток после применения препаратов E. coli численность клеток донорного и киллерного штаммов в кишечнике птицы составила 2,70E+06±2,01Е+05 и 8,12Е+05±2,22Е+05 КОЕ/г, соответственно. Частота конъюгативного переноса в группе I с контрольным донором была на уровне Е-02–Е-03 в течение 6 дней наблюдения. Аналогично эксперименту с крысиной моделью, трансконъюганты во II группе (с киллерным донором) не были обнаружены ни в один из контрольных сроков. В контрольной группе бактерии E. соli, устойчивые одновременно к ампициллину, хлорамфениколу и гентамицину, в течение эксперимента детектированы не были. Таблица 6 Эффективность конъюгативной доставки плазмиды и киллинга в условиях кишечного тракта крыс (А) и перепелов (Б) А I группаII группа День E. coli N4i (контрольный донор)E. coli ŽP (киллерный донор) RDTƳRKDTƳ 103,54Е+032,96Е+062,15Е+02 6,07Е-022,19Е+035,97Е+050- ±1,23Е+03±2,01Е+06±1,75Е+02±5,58Е-02±1,25Е+03±2,58Е+05 145,21Е+05 1,26Е+07 4,11Е+04 7,87Е-02 4,22Е+04 5,64Е+070- ±2,13Е+04±8,64Е+06±4,00Е+03±8,32Е-03±2,36Е+04±8,96Е+06 218,69Е+06 7,25Е+07 6,15Е+04 7,08Е-03 5,91Е+04 2,23Е+070- ±5,55Е+06±2,35Е+07±1,02Е+03±9,64Е-04±4,98Е+03±1,00Е+07 Б I группаII группа День E. coli N4i (контрольный донор)E. coli ŽP (киллерный донор) RDTƳRKDTƳ 25,00E+05 2,70E+06 5,00E+03 1,00E-02 4,68Е+04 8,12Е+050- ±4,55Е+05±2,01Е+05±1,12Е+03±1,12Е-01±2,25Е+04±2,22Е+05 33,05E+06 4,45E+06 1,05E+04 3,44E-03 7,39Е+05 1,74E+060- ±2,41Е+05±3,05Е+06±1,11Е+04±2,46Е-03±5,57Е+05±1,96E+06 69,12Е+06 6,42Е+07 4,18Е+05 4,58Е-02 8,29Е+05 2,57Е+070- ±7,15Е+06±6,16Е+07±4,00Е+05±2,12Е-01±5,55Е+05±3,01Е+07 Примечание. D – контрольный донор, КD – киллерный донор, R – реципиент, Т – трансконъюгант, Ƴ – частота конъюгативного переноса. Количество клеток представлено в КОЕ/г. Таким образом, эксперимент in vivo показал, что генно-модифицированный штамм E. coli ŽP, несущий ген синтеза колицина ColE7, способен эффективно заселять кишечник крыс и сельскохозяйственной птицы и сохраняться там на протяжении длительного времени. Конъюгативный перенос плазмиды от контрольного донора в условиях кишечного тракта происходил с достаточно высокой частотой, в то время как, в группе с киллерным донором трансконъюганты отсутствовали, что свидетельствует об эффективности работы конъюгативно-опосредованной антибактериальной системы. Сниженное число клеток реципиентов в группе II также доказывает активность изучаемого штамма в отношении патогенных E. coli. Исходя из проведенных исследований по конъюгативному переносу в различных моделях in vitro и in vivo, можно сделать заключение, что механизм конъюгативного переноса генов является перспективным инструментом в прикладных сферах и требует дальнейшего детального изучения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами были изучены биологические свойства штаммов уропатогенных E. coli (n=29) с индивидуальным генетическим профилем. Большинство культур принадлежали к группе В2, второй по распространенности была группа А, что согласуется с ранее проведенными исследованиями других авторов (Najafi et al., 2017; Кузнецова и др., 2018; Cristea et al., 2019; Tewawong et al., 2020). Штаммы UPEC существенно различались по биопленкообразующей способности на полистироле и проявляли разную адгезивную активность по отношению к абиотическим материалам, а именно, лучше адгезировались к гидрофобной поверхности. Среди исследуемых UPEC наибольший уровень резистентности был зафиксирован к фторхинолонам, а самыми эффективными антибиотиками оказались меропенем и фосфомицин. В исследуемой выборке широко была распространена устойчивость к бактериоцинам всех групп. Были изучены генетические детерминанты вирулентности UPEC, включающие гены адгезинов, токсинов, белков наружной мембраны и капсулообразования. Основными факторами вирулентности представленных культур были участники систем захвата и транспорта железа, обеспечивающие длительную сохранность и возможность персистенции клеток в мочеполовом тракте. Показано, что адгезия бактерий и скорость развития биопленки могут определяться природой полимерного материала. Увеличение гидрофильности поверхности катетера снижало эффективность формирования 24-часовой биопленки UPEC, однако при этом гидрофильные клетки активнее колонизировали поверхности с меньшим показателем гидрофобности. В данной работе изучены биологические свойства штаммов APEC, которые являются возбудителями колибактериоза – системного экстраинтестинального поражения внутренних органов сельскохозяйственной птицы, что приводит к значительным экономическим потерям в птицеводстве (da Rocha et al., 2002; Новикова, Бартенев, 2015). Среди культур чаще всего встречались представители группы B1. Биопленки активно формировали чуть менее половины штаммов. Внутри данной выборки APEC широко был распространен такой признак, как продукция бактериоцинов. В отличие от группы UPEC, птичьи штаммы не демонстрировали выраженную адгезию к какой-либо абиотической поверхности. Показано, что бактерии APEC, циркулирующие на предприятиях птицеводства, устойчивы к большому числу антибиотиков, включая бета-лактамы и фторхинолоны, а более половины изолятов являются мультирезистентными. Изученные культуры продуцируют бета-лактамазы TEM и CTX-M типа, большинство из которых ассоциировано с интегронами 1 класса. Кроме того, в условиях сельскохозяйственного производства начинают формироваться эковары APEC с высоким уровнем устойчивости не только к антибиотикам, но и к бактериоцинам. Результаты данного исследования также показывают, что E. coli, выделенные при системном колибактериозе у птиц, по генетическому профилю имеют большее сходство со штаммами, вызывающими острые кишечные инфекции у человека, чем с уропатогенными E. coli. Несмотря на многочисленные исследования, доказывающие фено- и генотипическое сходство APEC и UPEC (Mitchell et al., 2015; Najafi et al., 2019; Meena et al., 2020; Zhuge et al., 2020), фекально-оральный путь передачи возбудителя от зараженной птицы человеку является наиболее вероятным с эпидемиологической точки зрения. Изучаемые штаммы были выделены из различных экстраинтестинальных органов птицы, что свидетельствует о высоком риске заражения через продукты питания. Нами показано, что эффективность передачи производной F-плазмиды в штаммы E. coli варьировала внутри группы и была значительно выше в биопленке, чем в планктоне. Частота конъюгативного переноса плазмиды pOX38 была выше в группе штаммов, формирующих тонкие биопленки (ОП<0,3) и не зависела от филогенетической группы реципиентов, продукции бактериоцинов, присутствия конъюгативных плазмид, наличия бактериофага или каких-либо генов вирулентности. Эффективность конъюгации на поверхности катетеров различалась и была также выше в тонких биопленках. На катетере с серебряным напылением частота горизонтального переноса была наименьшей, что может являться результатом действия ионов серебра, включенных в поверхность: расхождение нитей ДНК, вызванное воздействием серебра, препятствует репликации и передаче плазмидной ДНК (Asmaa et al., 2020). В представленной работе рассмотрены межвидовые взаимодействия в полимикробных биопленках, образованных двумя штаммами Е. coli (донором конъюгативной плазмиды и реципиентом) и представителями трех различных таксонов (K. pneumoniae, E. faecalis и P. aeruginosa). Для пары E. coli и K. pneumoniae получены следующие данные: доля бактерий E. coli в смешанной биопленке была существенно меньше, чем K. pneumoniae. В случае с E. faecalis наблюдалась противоположная ситуация: количество клеток E. coli, а также биомасса совместной биопленки были сопоставимы с контролем, однако конъюгация была ниже на два порядка, как в присутствии клеток ассоцианта, так и его БКЖ. В последнем случае частота конъюгации могла снизиться и за счет формирования более массивной биопленки, в которой клетки сохраняли жизнеспособность, но передача происходила только в ее верхних слоях. В варианте E. coli+P. aeruginosa наблюдался ранее изученный тип взаимоотношений для данной пары микроорганизмов (Кузнецова и др., 2012; Kuznetsova et al., 2013; Гриценко и др., 2016). Следует отметить, что в представленном исследовании было зарегистрировано полное ингибирование процесса передачи плазмиды после воздействия БКЖ P. aeruginosa на E. coli. Полученные данные свидетельствуют о разнохарактерном ответе бактериальных клеток, содержащихсявбиопленкахприсимбиотическихилиантагонистических взаимоотношениях. Во всех случаях присутствие бактерий-ассоциантов или их экзометаболитов негативно влияло на скорость конъюгации. Однако, несмотря на схожий вектор изменений, вопрос о механизмах взаимодействия клеток внутри биопленки остается открытым и требует дальнейшего исследования. Генно-модифицированный штамм E. coli ŽP, несущий ген синтеза колицина ColE7, является перспективным в качестве основы пробиотического препарата за счет возможности воздействия на устойчивые к антибиотикам и бактериоцинам энтеробактерии. Эксперимент in vivo показал, что штамм E. coli ŽP способен эффективно заселять кишечник крыс и сельскохозяйственной птицы и сохраняться на протяжении длительного времени. Конъюгативный перенос плазмиды от контрольного донора в условиях кишечного тракта происходил с достаточно высокой частотой, в то время как, в группе с киллерным донором трансконъюганты отсутствовали, что свидетельствует об эффективности реализации конъюгативно-опосредованной антибактериальной системы. Сниженное число клеток реципиентов в последней группе также доказывает действие изучаемого штамма на потенциально патогенные E. coli. Эффективность работы штамма E. coli ŽP определяется альтернативной системой доставки колицина, что обеспечивает его высокую конкурентоспособность в различных экологических нишах, где могут присутствовать, в том числе, и эшерихии патогенных патотипов – продуценты бактериоцинов. Учитывая, что в условиях птицеводческих и животноводческих комплексов эти штаммы активно циркулируют, сельское хозяйство является наиболее важной областью его применения. Использование конъюгативного механизма при создании нового пробиотического средства в птицеводстве является перспективным и соответствует мировым тенденциям в данной области науки и практики. В полной мере раскрыть биотехнологический потенциал генно- модифицированного штамма E. coli ŽP, в том числе, его действие на зоотехнические показатели птицы, помогут дополнительные исследования. Актуальным является изучение его эффективности при лечении и профилактике эшерихиозов у животных и оценка терапевтического и противоэпидемического потенциала. ВЫВОДЫ 1.Штаммы уропатогенной E. coli и E. coli, патогенной для птиц, характеризовались вариабельностью биологических свойств внутри групп как по частоте встречаемости, так и в отношении уровня активности некоторых факторов: гемолитической активности, адгезивной и биопленкообразующей способности, чувствительности к антимикробным агентам, бактериоциногении, лизогении. 2.Среди вирулентных генов, наиболее часто характеризующих группу UРЕС, самыми распространёнными были гены системы захвата и транспорта железа chuA (62,07%), цитотоксического некротического фактора 1 (cnf1) и гемолизина (hlyA) (по 20,68%). 3.Культуры, выделенные при системном колибактериозе птиц, характеризуются высокой патогенностью в отношении сельскохозяйственной птицы, по генетическому профилю являются более близкими к штаммам группы DEC и обладают зоонозным потенциалом. Среди штаммов АРЕС 75%, классифицированных как высокопатогенные для птиц и человека, характеризовались высокими частотами встречаемости генов вирулентности патогенных для птиц и диареегенных E. coli, островка патогенности SHI-2, а также генов бета-лактамаз расширенного спектра и участков интегронов 1 класса. 4.Показано, что в общей выборке частота конъюгативного переноса плазмиды pOX38 in vitro была выше в биопленке, чем в планктоне, при этом толщина биопленки играла существенную роль в эффективности передачи плазмиды. Полиантибиотикоустойчивые штаммы характеризовались более высокой частотой конъюгации в биопленке, но не в планктоне. 5.В присутствии клеток бактерий других видов – K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. faecalis или их метаболитов частота переноса плазмиды pOX38 в клетки UPEC снижалась на один-два порядка, независимо от взаимного положительного или отрицательного влияния ассоциантов друг на друга при формировании биопленки. Включение ионов серебра в поверхность силикона не ингибировало адгезию бактерий, но снижало жизнеспособность клеток и эффективность конъюгации в зрелых биопленках. 6.Установлено, что в условиях in vivo генно-модифицированный штамм E. coli ŽP, несущий ген синтеза колицина ColE7, эффективно заселял кишечник животных и сохранялся там не менее месяца. Конъюгативный перенос производной F-плазмиды pOX38 происходил со средней частотой 10Е-02, что позволяет рассматривать штамм E. coli ŽP как основу для нового ветеринарного пробиотического препарата.