Молекулярно-генетический и биоинформационный скрининг вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus на основе анализа CRISPR/Cas-системы бактерии

В обзоре литературы представлен анализ опубликованных работ отечественных и зарубежных ученых в первой главе по вопросам биологических и клинико-эпидемиологических особенностей S. aureus, о роли данной бактерии в развитии различных заболеваний человека, диагностики и тяжести борьбы с данным возбудителем, а во второй главе – изучению молекулярно-генетических особенностей строения генома и системы СRISPR бактерии.
Материалы и методы исследования (глава 3) Объекты и методы исследования
Диссертационное исследование выполнено на базе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России в период с 2014 по 2019 г., а также микробиологические и молекулярно-генетические исследования проводили в НИИ Биомедицинских технологий ФГБОУ ВО ИГМУ, совместно с ведущим научным сотрудником НИИ БМТ ИГМУ, к.б.н. Джиоевым Юрием Павловичем; к.м.н., старшим научным сотрудником НИИ БМТ ИГМУ Степаненко Лилией Александровной; к.м.н., доцентом кафедры патологической физиологии и клинической лабораторной диагностики Карноуховой Ольгой Геннадьевной.
Объекты исследования.
Бактерии. В работе использовано 398 полногеномных последовательностей ДНК S. aureus из базы данных GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и 106 штаммов S. aureus, выделенных из различных биотопов (кишечник, зев, нос, эякулят) больных, обратившихся за медицинской помощью в лечебные учреждения г. Иркутска в 2015-2016 гг. на базе микробиологической лаборатории НИИ БМТ ИГМУ под руководством к.м.н. Карноуховой О.Г. Его забирали при
Название пар праймеров Primer pair1
Primer pair 2 Primer pair 3 Primer pair 4 Primer pair 5
Структура праймера (5′->3′)
F- AATCGGGTTGTTCAAGACCT
R- GTTGCGTTAATGGAGAGTGCT F- TGTCACAGTTTTTGACAGCCA R- CTATTACCGTTCTCGTCCCC
F- AATCGGGTTGTTCAAGACCT
R- GTTGCGTTAATGGAGAGTGCT F- TTTAGGAAGTATTTTACATG
R- CCAGAAAATTCACCAAACTTCA F- CACCTAACTCACTATCAAT
R- CCATCCCCTAAAAATAATC
поступлении пациентов с соблюдением этических принципов проведения медицинских исследований, изложенных в Хельсинской декларации Всемирной организации здравоохранения (WMA Declaration of Helsinki). Забор и доставку материала осуществляли в соответствии с Приказом Минздрава СССР от 22.04.1985 г. No 535.
Антибактериальные препараты. С целью определения чувствительности штаммов к антибиотикам в работе использовались диски, пропитанные антибиотиками (производство ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера): бензилпенициллин – 10 мкг; оксациллин – 1 мкг; гентамицин – 10 мкг; эритромицин – 15 мкг; ципрофлоксацин – 5 мкг; клиндамицин – 2 мкг; офлоксацин – 5 мкг; ванкомицин – 30 мкг.
Препараты бактериофагов. У выделенных штаммов S. aureus определяли чувствительность к фаговым препаратам: 1) Пиобактериофаг поливалентный очищенный. Производитель: ФГУП «НПО» Микроген», Россия (г. Уфа); 2) Пиобактериофаг комплексный. Производитель: ФГУП «НПО» Микроген», Россия (г. Нижний Новгород); 3) Бактериофаг стафилококковый. Производитель: ФГУП «НПО» Микроген», Россия (г. Нижний Новгород); 4) Интести-бактериофаг. Производитель: ФГУП «НПО» Микроген», Россия (г. Нижний Новгород).
Праймеры. Используемые в работе олигонуклеотидные праймеры синтезировали в компании ООО «Биосинтез» г. Новосибирск. Представленные в таблице 1 праймеры для ПЦР были наработаны на основе проведенного анализа фланкирующих последовательностей CRISPR-кассет, обнаруженных в геномах S. aureus из базы GenBank, методами биоинформатики при помощи программы PrimerBlast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности, использованные в качестве фланкирующих
праймеров CRISPR-кассет
Для детекции
основные генов cas в геномах S. aureus; данные праймеры представлены в таблице 2.
в геномах CRISPR-системы, были синтезированы праймеры на
Таблица 2. Нуклеотидные последовательности, использованные в качестве праймеров генов
CRISPR-системы S. aureus Название праймеров Структура праймера (5′->3′)
Cas 1
F – ACTCATTTCGAATCCATGTAAAGC R – AAACGTGGACGGTACAATGA
F- AGCACTCTCCATTAACGCAAC
R- TTCTTGCAGCCTGTGCTTCT
Cas 2
F – CGAGAGGTATGTCAGCGATGT R – TCGCACAACAACCTTAACCTCT F- ACGAGAGGTATGTCAGCGAT
R- TCGCACAACAACCTTAACCTC
Cas 6
F – AGGAAGTATTTTACATGGTGT
R – AACCTGAAAATTCGCCAAAC
F – AGATAGCCGAGCTATTCACTTCT R – TCGATTCAATTCCTCTGTTTCTAA
Секвенирование фрагментов CRISPR-кассет осуществляли на базе Государственного Бюджетного Учреждения Здравоохранения “Иркутский областной онкологический диспансер” по методу Сенгера на капиллярном секвенаторе Applied Biosystems 3500.
Методы исследования.
Бактериологическое исследование. Выделение и идентификация S. aureus проводились в соответствии с Приказом Минздрава СССР от 22.04.1985 No 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно- профилактических учреждений», с использованием метода посева биологического материала по Голду. Количественную оценку ДНК-зной активности проводили в соответствии с рекомендациями Е.М. Гординой (2015), гемолитической – Н.Г. Ходаковой (2008).
Определение чувствительности к антибиотикам проводили Диско- диффузионным методом (ДДМ) на поверхности агара Мюллера-Хинтон в соответствии с МУК 4.2.1890-04. В качестве тестируемых препаратов использовали основные группы антибиотиков, рекомендованных соответствующими методическими указаниями (МУК, 2004) и на основании литературных данных о встречаемой устойчивости штаммов S.aureus к препаратам. Определение чувствительности к препаратам бактериофагов проводилось в соответствии с МУК 4.2.1890-04.
Молекулярно-генетическое исследование. Для определения принадлежности выделенных бактерий к виду Staphylococcus aureus использовали набор реагентов «АмплиСенс MRSA-скрин-титр-FL», предназначенный для выявления ДНК метициллин-чувствительного и метициллин-резистентного S. аureus, в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Для экстракции ДНК
использовали комплект реагентов «РИБО-преп» («АмплиСенс», Россия), рекомендованный ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, в соответствии с инструкцией. Выделение ДНК проводили в присутствии внутреннего контрольного образца – ВКО STI-87, что позволило контролировать процедуру анализа каждого образца.
Выделенную ДНК непосредственно использовали для постановки ПЦР с детекцией в реальном времени на амплификаторе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия). Для амплификации использовали комплект реагентов «MRSA-скрин- титр-FL» (АмплиСенс, Россия). Приготовление реакционных смесей проводили согласно инструкции к набору реагентов.
Электрофорез продуктов амплификации ДНК. Результат ПЦР-реакций с наработанными праймерами для получения фрагментов CRISPR-кассет и детекции генов cas подтверждали стандартным методом электрофореза в агарозном геле (Великов, 2013).
Разработка биоинформационного программного алгоритма. Поиск генов CRISPR-систем, повторяющихся последовательностей и спейсеров в расшифрованных геномных последовательностях S. aureus осуществляли при помощи ряда отобранных биоинформационных программ. В итоге был сформирован программный алгоритм поиска и анализа CRISPR, состоящий из ряда программ. Для поиска генов cas, определения их функциональных и структурных характеристик использовали три программных моделирования: Macromolecular System Finder (MacSyF, ver. 1.0.2), с вспомогательными пакетами makeblastDB (ver. 3.0) и HMMER (ver. 2.2.28), и онлайн доступных софтов: CRISPRCasFinder (https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/CrisprCasFinder/Index) и CRISPROne (https://omics.informatics.indiana.edu/CRISPRone/). Схема идентификации CRISPR- генов, основанная на обнаружении консенсусного варианта cas-генов в геномах S. aureus, представлена на рисунке 1.
Полногеномные последовательности S. aureus, загруженные из базы данных Genbank (NCBI)
Macromolecular System Finder (MacSyF, ver. 1.0.2)
Рисунок 1. Обнаружение консенсусного варианта cas-генов в геномах Staphylococcus aureus.
CRISPRCasFinder [online] CRISPROne [online]
Обнаружение повторяющихся последовательностей (CRISPR-кассет) осуществляли при помощи ряда программ: CRISPR RT (http://www.room220. com/crt/); CRISPI: CRISPR-interactivedatabase (http://crispi.genouest.org); CRISPRsFinder (http://crispr.u-psud. fr/); CRISPRDetect: A flexiblealgorithmtodefine CRISPR arrays (http://brownlabtools.otago.ac.nz/CRISPRDetect/ predict_crispr_ array.html), онлайн доступный софт CRISPRCasFinder (https://crisprcas.i2bc.paris- saclay.fr/CrisprCasFinder/Index). Результаты обнаружения считались достоверными только при совпадении повторов и спейсеров в ряде программ. Для детекции бактериофагов и плазмид в обнаруженных спейсерных участках посредством биоинформационных алгоритмов BLASTn по молекулярным базам Gen_Bank- Phage использовали программы CRISPRTarget (http:// bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html) и Mycobacteriophage Database (http://phagesdb. org/blast/) (рис. 2).
Рисунок 2. Идентификация повторяющихся и спейсерных последовательностей при помощи биоинформационных программ. Красным выделена область результатов совпадений программных компонентов.
Анализ секвенированных фрагментов CRISPR-кассет осуществляли при помощи программ BioEdit v. 7.0.4, Applied BiosystemsSequencing Analysis Software v. 5.3.1, Genius prime 2019, v. 2.1
Методы статистического анализа данных. Статистическую обработку и анализ математических данных производили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, версия 7.0, STATISTICA, версия 7.0. Вычисляли средние арифметические значения, ошибки средних величин и доверительные интервалы. Достоверность различий между статистическими параметрами определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ с целью изучения связи

между чувствительностью / устойчивостью к антибиотикам и бактериофагам проведен с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Шелудько, 2016).
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика устойчивости выделенных от больных штаммов
Staphylococcus aureus к действию антибиотиков и бактериофагов (глава 4). Исследование антибиотикорезистентности 106 штаммов S. aureus позволило выявить высокий удельный вес резистентных культур для исследуемых антибиотиков. Результаты исследования показали, что к антибиотикам группы пенициллинов – бензилпенициллину и его полусинтетическому аналогу оксациллину, резистентность S. aureus составляла 32,1±4,5% и 12,3 ± 3,2% соответственно. Чуть выше была резистентность к представителю первого поколения ряда макролидов – эритромицину, которая составляла 15±3,5%. Анализ резистентности штаммов к препарату группы гликопептидов – ванкомицину показал, что устойчивыми были 3,8±1,9% исследованных изолятов. К препаратам фторхинолонов второго поколения отмечался столь же высокий уровень чувствительности: для ципрофлоксацина резистентность оказалась равна 2,8 ± 1,6%, а для офлоксацина- 1,9±1,3%. Точно такой же уровень резистентности показал анализ и для линкозамидов, а именно клиндамицина – 1,9±1,3%. Наименьший уровень резистентности наблюдался для представителя группы аминогликозидов гентамицина, к которому оказались нечувствительны лишь 0,9 ±
0,9% исследованных штаммов.
Исследование устойчивости штаммов к препаратам бактериофагов
проводимые в соответствии с МУК 4.2.1890-04 позволили выявить максимальный уровень резистентности для стафилококкового бактериофага – 55,6 ± 4,8%. Резистентность к интести-бактериофагу составляла 43,4 ± 4,8%, к пиобактериофагу поливалентному очищенному – 42,5 ± 4,8%. Наименьшую резистентность изоляты показали к пиобактериофагу комплексному, к которому устойчивыми оказались 39,6 ± 4,7% штаммов.
С целью изучения тесноты связи между антибиотикорезистентностью и устойчивостью к бактериофагам была проведена сравнительная оценка штаммов по выборочному линейному коэффициенту корреляции (Таблица 3).
Таблица 3. Сводная таблица частоты устойчивых (R) и чувствительных (S) к антибиотикам
стафилококков и устойчивых (R) и чувствительных (S) к бактериофагам штаммов стафилококков и корреляции (r) между чувствительностью – устойчивостью к антибиотикам и бактериофагам (%).
Бактериофаг и
Антибиотики
Пен Окс Эри Ван Цип Офл Кл Ген SRSRSRSRSRSRSRSR
% 67, 32, 87, 12, 8 1 96, 3, 97, 2, 98, 1, 98, 1, 99, 0, % 9173552828191919

S 63,1
0,9 0,88 0,89
0,73 0,44 0,47
0,9 0,77 0,64
0,9 0,78 0,81
0,83 0,82 0,82 0,82 0,81 0,35 0,35 0,34 0,34 0,33
0,71 0,53 0,52 0,52 0,52
0,73 0,72 0,71 0,71 0,70
R 39,6
2
3 4
S 44,4
R 55,6
S 56,6
R 43,4
S 57,2
R 42,5
Примечание: S (susceptible) – чувствительные микроорганизмы; R (resistant) – резистентные микроорганизмы; окс – оксациллин, ван – ванкомицин, пен – бензилпенициллин ген – гентамицин, эри – эритромицин, цип – ципрофлоксацин, кл -клиндамицин, офл – офлоксацин, 1 – комплексныйпиобактериофаг, 2 – стафилококковый бактериофаг, 3 – интести- бактериофаг, 4 – поливалентный очищенный бактериофаг.
Отсутствие взаимосвязи между множественной устойчивостью к бактериофагам и антибиотикорезистентностью подтверждается отсутствием статистически достоверной корреляции (р>0,05). Однако при анализе показателей чувствительности стафилококков в отношении отдельных антибиотиков и бактериофагов была выявлена связь у анализируемых штаммов. Полученные коэффициенты, сопоставленные со шкалой Чеддока, указали на высокую (0,7