Морфофункциональные реакции стромальных стволовых клеток в условиях трехмерного моделирования регенерации костной ткани

Материалом для исследования служили стромальные стволовые клетки (ССК), выделенные из липоаспирата подкожной жировой ткани человека (Разрешение локально-этического комитета БФУ им. И. Канта: Протокол No1 от 28.02.2019). Экспериментальные исследования проведены на базе Центра иммунологии и клеточных биотехнологий БФУ им. И. Канта (директор центра – д-р мед. наук Л.С. Литвинова).
Критериями исключения материала из исследования являлись: возраст моложе 18 и старше 35 лет; инфекционные, онкологические, аутоиммунные, наследственные и психические болезни; алкогольная и наркотическая зависимости. Дизайн исследования схематично представлен на рис. 1.
В качестве подложки использовали коммерчески чистый титан (Ti, состав в массовых %: 99.58Ti, 0.12O, 0.18Fe, 0.07C, 0.04N и 0.01H) с двусторонним нанесением покрытия из фосфатов кальция; общий размер образцов 10×10×1мм3 (стороны квадрата; толщина).
Морфология поверхности рентгеноаморфных титановых подложек с КФ покрытием изучена при помощи оптической (инвертированный металлографический микроскоп Olympus GX-71, Olympus Corporation, Japan) и сканирующей электронной микроскопии (Philips SEM 515, Нидерланды) в Томском материаловедческом центре коллективного пользования. Микрорельеф КФ поверхностей с индексом шероховатости Ra=2-5 мкм представлен схожими нерегулярными элементами: сферолитами (10-20 мкм в диаметре) и сообщающимися углублениями между ними, пронизанными открытыми сообщающимися порами с диаметром 1-10 мкм. Топография искусственной КФ поверхности близка к таковой в минеральной части костной ткани при ее ремоделировании. Стромально-васкулярную фракцию (СВФ) с небольшой примесью эндотелиальных клеток, перицитов и гладкомышечных клеток получали, как описано ранее (Zuk P.A. et al., 2001). Первоначально выделенную ткань гомогенизировали механическим методом в небольшом количестве среды DMEM/F12(1:1) (Gibco Life Technologies, США), после чего ферментировали раствором коллагеназы 1 типа (Sigma-Aldrich, США) в течении 60 мин при 37 °C в термошейкере со скоростью вращения 600 об/мин (0,4g). После ферментативной обработки СВФ несколько раз отмывали с помощью фосфатно-солевого буфера (PBS, Sigma-Aldrich, США). Клеточную взвесь ресуспендировали и вливали в культуральный флакон, культивировали в среде DMEM/F12 (1:1) (Gibco Life Technologies, США). Содержание эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Sigma- Aldrich, США) составляло 10%, L-глутамина (Sigma-Aldrich, СШA) – 280 мг/л, гентамицина (Invitrogen, Великобритания) – 50 мг/л. СВФ пересевали до достижения конфлюэнтности 4 раза (каждый пассаж длился 5-7 дней) для увеличения популяции ССК. Питательную среду заменяли свежей порцией каждые 3-4 дня.
Рисунок 1 – Дизайн исследования. Ra – индекс шероховатости КФ поверхности.
В экспериментах использовали адгезирующие к пластику клетки после 5 пассажей. Для открепления адгезированных клеточных культур от пластика флаконы с культурой промывали 4 раза по 4 мл раствором PBS. После промывки монослой клеток ферментировали 3 мл 0,05% раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) в 0.53 мМ этилендиоксидтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Sigma-Aldrich, США) и инкубировали 4 мин при 37°С. Затем промывали флаконы раствором Хенкса, содержащего 20% ЭТС, собирали клеточную взвесь в микроцентрифужную пробирку, отмывали дважды центрифугированием с PBS в течении 5 мин при 1200 об/мин (300g.). После повторного центрифугирования аккуратно удаляли надосадок и доводили клеточную взвесь в осадке до 1 мл питательной средой.
Оценка количества и определение жизнеспособности клеток до и после культивирования производилась в культурах ССК с использованием автоматического счётчика клеток Countess TM Automated Cell Counter (Invitrogen, США) на слайдах с добавлением 0,4% раствора красителя трипанового синего (Invitrogen, США) в 0,9 % NaCl.
Оценка уровня цитотоксичности TiКФ образцов проводилась в соответствии с рекомендациями ГОСТ 10993-5-2011. ССК помещались в среду DMEM/F12 (1:1) (Gibco Life Technologies, США) с TiКФ образцами на протяжении 14 суток при 37 °C, 5% CO2. Содержание ЭТС (Sigma-Aldrich, США) составляло 10%, L-глутамина (Sigma-Aldrich, СШA) – 280 мг/л, гентамицина (Invitrogen, Великобритания) – 50 мг/л. Замена питательных сред производилась каждые 3-4 дня. По прошествии срока культивирования клеточные культуры откреплялись от пластика раствором трипсина определялась общая клеточность и жизнеспособность клеточных культур.
Дифференцировочный потенциал клеток после 5 пассажей определяли путем индукции полученной культуры клеток в адипогенном, хондрогенном или остеогенном направлении с использованием набора StemPro® Differentiation Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Питательную среду заменяли свежей каждые 3-4 дня. Культивирование проводили, соблюдая условия стерильности в 12-луночных планшетах с плоским дном (Orange Scientific, Braine-l’Alleud, Бельгия) при 37° C и 5% CO2.
Для детекции прохождения дифференцировки в хондрогенном направлении использовался краситель альциановый синий (Sigma-Aldrich, США), избирательно окрашивающий протеогликаны, синтезированные хондроцитами. По окрашенным таким методом протеогликанам можно судить об успешном прохождении хондродифференцировки. Раствор ализарина красного применялся для оценки минерализации межклеточного вещества за счет образования клетками нерастворимых солей кальция, прежде всего, фосфатов кальция. Для детекции адипогенеза использовался раствор красителя масляный красный (Sigma-Aldrich, США) в целях внутриклеточной окраски липидов и нейтральных триглицеридов. Окраску производили в соответствии с протоколом производителя. Степень окрашивания визуально оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Observer A1 (Carl Zeiss Microscopy, США).
Оценку продуктов деградации имплантатов проводили в соответствии с рекомендациями ГОСТ ISO 10993-9. Измеряли: изменения массы TiКФ образцов в результате их биодеградации; концентрации продуктов деградации с помощью метода ионо-селективных электродов.
Фенотипирование клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием набора MSC Phenotyping Kit human (Miltenyi Biotec, Германия).
В связи с высокой гетерогенностью первичных клеточных культур, получаемых из человеческого организма, была проведена дифференцировочная и фенотипическая идентификации принадлежности выделенного пула клеток к ССК согласно рекомендациям интернационального сообщества по клеточной терапии (ISCT) и интернациональной федерации жировой терапии и науки (IFATS) (Bourin P. et al., 2013; Dominici M. et al., 2006).
Морфологию СКК, их подвижность, способность образовывать монослой оценивали в системе непрерывного наблюдения в реальном времени за живыми культурами Cell-IQ® v2 MLF (CM Technologies, Финляндия). Данная система позволяет при помощи методов фазово-контрастной микроскопии оценивать вышеуказанные параметры на протяжении всего эксперимента. В эксперименте оценивались направления миграции клеток, относительно внесенных в лунки планшета образцов с КФ-покрытием на титановой Ti подложке (TiКФ).
Для оценки экспрессии генов остеодифференцировки (RUNX2, BMP2, BMP6, BGP, ALP) в СКК из полученных образцов выделяли РНК с использованием реагента Extract RNA kit (Евроген, Россия) согласно протоколу производителя. Затем проводили реакцию обратной транскрипции выделенной РНК с использованием праймера oligo(dT)23-primer (20 мкМ) (Beagle, Россия) и обратной транскриптазы MMLV (Евроген, Россия).
Мультиплексный ПЦР анализ проводили в трех повторах с использованием реагентов qPCRmixHS (Евроген, Россия), специфических зондов TaqMan и праймеров (Beagle, Россия) в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). В качестве
матрицы использовались 4 мкл кДНК. В качестве референсного гена использовали ген RPLPO.
Методом проточной флуориметрии количественно определяли концентрации факторов роста, про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов (IL-1α, IL- 2rα, IL-3, IL-12p40, IL-16, IL-18, CTACK, GROα, HGF, IFNα2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, b-NGF, SCF, SCGF-b, SDF-1α, TRAIL) в супернатантах культур (тест- система Bio-Plex Pro Human cytokine Group II 21-Plex Panel, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) согласно протоколу фирмы-производителя. Результаты считывали на автоматическом фотометре для микропланшетов Bio-Plex (Bio-Plex® Luminex 200 Systems, Bio-Rad, США) с использованием программы Bio-Plex Manager (Bio-Rad, США).
Для определения способности стромальных стволовых клеток формировать in vitro трехмерную остеогенную культуру с помощью образцов с КФ-покрытием на титановой подложке проводили эксперимент по прямому сокультивированию клеточных культур на TiКФ образцах.
После 24-ч адгезии клеток 3D-матриксы с клетками, засеянными на их поверхность, переносили в чистые лунки с бесклеточной ППС и культивировали 21 день при 370С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO2. Негативным контролем служила культура ССК (5×104 клеток/лунку) в ППС без 3D-матриксов. Позитивным контролем остеогенной дифференцировки считали двумерную культуру ССК в остеогенной дифференцировочной среде StemPro® Differentiation Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Осуществляли замену культуральных сред каждые 3-4 суток.
Через 21 день дважды отмывали изучаемые культуры с помощью фосфатного буфера. Адгезирующие клетки сушили на воздухе, фиксировали в парах формалина и окрашивали 2% водным раствором ализаринового красного S (Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции фирмы-производителя для определения минерализации межклеточного матрикса. Негативным контролем дифференцировки служили 2D- культуры ССК в стандартной ППС, не контактировавшие с 3D-матриксом в течение 21 суток.
Цитоморфометрическое исследование (площади, числа) окрашенных клеток проводили с использованием инструментов компьютерной программы Adobe Photoshop CS6 (Adobe Inc., США) согласно алгоритму, представленному в руководствах (Новицкий В.В. и др., 2004; Авантдилов Г.Г., 2006).
Оценка направленной миграции CСК через поры в мембране (инвазия), имитирующие поры кровеносных сосудов, проводилась с использованием электродной системы непрерывного наблюдения – xCELLigence ® RTCA DP (ACEA Biosciences Inc., США).
Изменения импеданса, снятого с этих электродов специального планшета, показывают площадь порсистой мембраны, занятую клетками на данный момент после инвазии через поры. Этот показатель визуализирует влияние наночастиц ГАП на положительную миграцию (инвазию) ССК в культуре клеток. Показания импенданса снимали каждые 15 мин в течении 25 часов. Для каждой экспериментальной группы использовали по 4 лунки.
При анализе, обработке и представлении данных использовалось программное обеспечение Prism 8.0.1 (Graphpad, USA). Нормальность распределения данных оценивали согласно гипотезе Колмогорова-Смирнова. В связи с тем, что выборки не подчинялись закону нормального распределения, для каждой выборки вычислялись такие критерии описательной статистики как медиана, первый и третий квартиль (Q1,
Q3). Для оценки достоверности различий зависимых выборок был использован T- критерий Вилкоксона, для независимых выборок применяли U-критерий Манна- Уитни. Для выявления связей между исследуемыми показателями вычислялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена (объем выборки не позволял определить закон распределения). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 (Кремер Н.Ш., 2004). Для поиска данных об известных белок- белковых взаимодействиях была использована биоинформатическая база данных STRING (Версия 11.5). В анализ вошли факторы, где при добавлении в культуру TiКФ образца было отмечено значимое различие уровня продукции фактора по сравнению с контрольными культурами. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Стромальные стволовые клетки (ССК), реагируют на (био)механические сигналы, что является важной областью исследований под общим названием «механотрансдукция». Так, достаточно механических воздействий, без дополнительных биохимических стимулов, чтобы способствовать дифференцировке и созреванию постнатальных ССК (Mathieu P.S., Loboa E.G., 2012). Например, циклический механический стресс в форме колебательного потока жидкости (Sen B. et al., 2014) сдвигает баланс процессов коммитирования с адипогенеза на остеогенез, способствует формированию костной и мышечной ткани in vivo и in vitro (Gurkan U.A., Akkus O., 2008). Согласно Prowse PD (2013), топография искусственного матрикса регулирует остеогенную дифференцировку ССК путем изменения цитоскелета. (Prowse P.D. et al., 2013). При этом, показано, что распределение актинового цитоскелета различно на поверхностях с вариациями шероховатости (Lüthen F. et al., 2005). Сравнительный анализ полученных результатов показал, что при локальном внесении взвеси ССК жировой ткани человека в центр лунки в условиях 2D культивирования, клетки хорошо адгезировали, принимали фибробластоподобную морфологию, мигрировали и пролиферировали, достигая состояния монослоя к 14 суткам наблюдения. Клетки вступали в межклеточные контакты, что тормозило их двигательную и пролиферативную активность и соответствующий прирост клеточной массы в точках визуализации. Известно, что наряду с межклеточными контактами, внеклеточный матрикс в значительной степени контролирует поведение ССК, включая их движение, адгезию, пролиферацию, дифференцировку и созревание, а также метаболизм и жизнеспособность (Wang Y.K., Chen C.S., 2013). Действительно, добавление в клеточную культуру 3D-матриксов с КФ покрытием, симулирующим состояние минерального вещества регенерирующей костной ткани, оказывало комплексное модулирующее влияние на морфофункциональное состояние культуры ССК. Этот эффект не был связан с токсичностью применяемых TiКФ образцов, так как результаты цитотоксического теста оказались сходными в 2D и 3D культурах клеток По результатам анализа способности стромальных стволовых клеток жировой ткани человека формировать in vitro трехмерную остеогенную культуру с помощью образцов с КФ-покрытием на титановой подложке показно, что 24 часов достаточно, чтобы ССК адгезировали к КФ поверхности TiКФ образцов, что делает возможным их перенос на образцах в ППС, не содержащую клетки. К 21-м суткам культивирования ССК созревают в остеобласты, что подтверждается окрашиванием клеточной культуры на КФ поверхности ализариновым красным (рис. 2А, ряд 3). Выявляется интенсивная окраска клеточной культуры по краям 3D-матриксов, а также вблизи них на пластиковой поверхности лунок планшетов. Это говорит о том, что ССК эмигрируют с КФ поверхности, заселяют свободную территорию на пластике, подвергаются остеогенной дифференцировке, занимая 20-32 % площади лунок планшета вокруг перенесенных 3D-матриксов (рис. 2Б). Рисунок 3Б демонстрирует, что клетки не просто смываются с КФ поверхности, а передвигаются на пластик с образцов, имеющих высоту не менее 1 мм, и формируют к 21-м суткам наблюдения трехмерную (3D) культуру остеобластов. При этом именно прямой контакт ССК с КФ поверхностью индуцирует их остеогенную дифференцировку и созревание, поскольку в культуре клеток без образцов (рис.2А, ряд 4; рис.3Д) и после удаления 3D-матриксов из культуры (рис. 2А, ряд 2; рис. 3В) окраска остеобластов ализариновым красным не выявляется. Интересно, что ССК окрашиваются ализариновым красным после прямого контакта с 3D-матриксом не так интенсивно, как в двумерной остеогенной дифференцировочной среде на пластике (рис. 2, ряд 1; рис. 3Г), но площадь окраски более чем в 3 раза (p<0,05) больше. Это объяснимо, поскольку ССК в трехмерной культуре тратят значительное время на эмиграцию с TiКФ образцов и заселение лунок, поэтому не успевают к 21 суткам сформировать заметный кальцифицированный (минерализованный) межклеточный матрикс, окрашивающийся ализариновым красным, как в стационарной клеточной культуре в остеогенной среде. Таким образом, TiКФ образцы способствуют in vitro индукции остеогенной дифференцировки и созревания ССК человека, их эмиграции с поверхности образцов, заселению 30 % свободной территории вокруг образцов по типу "ползучего остеогенеза". Обнаружен новый феномен трехмерной культуры клеток in vitro: остеогенная дифференцировка вокруг образцов с растворимыми КФ опосредована не только высвобождением ионов кальция и фосфора, но и ССК, эмигрирующими с образцов на пластик и предифференцированными в остеобласты после прямого контакта с КФ поверхностью. Рисунок 2 - Внешний вид 21-дневных клеточных культур в 12-луночных планшетах до (А) и после удаления (Б) титановых матриксов с кальцийфосфатным покрытием для выявления способности стромальных стволовых клеток жировой ткани человека формировать in vitro трехмерную остеогенную культуру. Окраска ализариновым красным S. Рельеф микродугового КФ покрытия способствуют эпигеномному переключению дифференцировки ССК жировой ткани человека в остеогенном и, в меньшей степени, хондрогенном направлениях, в ущерб образованию адипоцитов на КФ поверхности (Khlusov I.A. et al., 2018). Наши результаты подтвердили дифференцировку и созревание СКК жировой ткани человека в остеобласты при прямом контакте с данным видом КФ покрытия. В то же время, удивительным оказался факт, что часть стволовых клеток эмигрирует с поверхности TiКФ образцов высотой не менее 1 мм и заселяет 30 % свободной территории вокруг образцов (рис.2,3; табл.2) по типу "ползучего остеогенеза" (остеокондукции) (Kübler N.R., 1997). Рисунок 3 - Микрофотографии 21-дневной культуры ССК жировой ткани человека при выявлении их способности формировать in vitro трехмерную остеогенную культуру с помощью образцов с КФ-покрытием на титановой Ti подложке: а) состояние клеток до окраски. Окрашенные клетки (б-д): б) Эмиграция клеток с поверхности образца, перенесенного в бесклеточную ППС после 24 ч сокультивирования с ССК (ряд 3 планшета на рис.2); в) Состояние культуры клеток на пластике после удаления образцов через 24 ч культивирования (ряд 2 на рис.2); г) Позитивный контроль остеогенной дифференцировки и созревания клеток на пластике в остеогенной среде (ряд 1 на рис.2); д) Негативный контроль остеогенной дифференцировки и созревания клеток на пластике в стандартной среде без остеогенных добавок (ряд 4 на рис.2). Окраска ализариновым красным S. Шкала 20 мкм, увеличение 100. При проведении экспериментов с опосредованным контактом TiКФ образцов с культурами ССК жизнеспособность клеточных культур 5-го пассажа была произведена по прошествии 14 суток культивирования в 2D и 3D культурах. Вариации процента живых клеток составили 91%-95%. Доля апоптотических и некротических форм ССК варьировала в пределах 0,8-4% и 3,7-6,8%, соответственно. Значимых различий между группами обнаружено не было, что говорит об отсутствии цитотоксичности TiКФ образцов. Согласно полученным результатам, представленным в табл.4, TiКФ образцы не вызывают накопления продуктов биодеградации в 1-2-недельных бесклеточных экстрактах. Концентрации тестируемых катиона и аниона не отличались значимо от значений в контрольной группе (среда RPMI-1640 без добавления образцов) при сроках растворения 7 и 14 суток (табл. 1). С другой стороны, отмечена прибавка массы TiКФ образцов в динамике теста на биодеградацию (табл. 1), что свидетельствует в пользу обратного осаждения (преципитации) ионов из раствора на КФ покрытие. Таблица 1 – Концентрации ионов (мМ) в экстрактах и изменения массы (мг) титановых образцов с микродуговым кальцийфосфатным покрытием в динамике растворения в среде RPMI-1640, Me(Q1-Q3) Группа исследования Растворитель (контроль), n=6 TiКФ образец, n=3 Растворитель (контроль), n=6 TiКФ образец, n=3 [Ca] общий 0,075 (0,050-0,100) 0,09 (0,04-0,09) 0,045 (0,04-0,10) 0,08 (0,08-0,12) Показатели [Ca2+] [PO43-] 7 дней растворения 0,25 (0,23- 4,57 (4,38-4,64) 0,26) 0,23 (0,21- 4,77 (4,40-5,02) 0,24) 14 дней растворения 0,23 (0,19- 4,69 (4,57-4,78) 0,26) 0,26 (0,25- 4,71 (4,51-4,81) 0,26) Прибавка массы образцов - 0,11 (0,08-0,13) - 0,25(0,16-0,25) * Примечание: n – число исследованных образцов; *) статистически значимые различия (p<0,05) с 7 днями растворения согласно критерию Манна-Уитни. При этом, содержание фракций общего и свободного (ионизированного) кальция в трехмерной культуре статистически значимо снижалось (на 8 % и на 3,5 %) в сравнении с контрольной культурой ССК жировой ткани человека (табл.2), несмотря на присутствие КФ покрытия. Таблица 2 – Концентрации ионов (мМ) в супернатантах культуры стромальных стволовых клеток через 6 суток контакта с титановыми образцами с микродуговым кальцийфосфатным покрытием, Me(Q1-Q3) Группа исследования Культура клеток без контакта с TiКФ образцами (контроль), n=6 ССК+TiКФ образец, n=3 [Ca] общий 2,43 (2,41–2,53) 2.24 * (1,91–2,31) Ионы [Ca2+] 0,84 (0,83–0,85) 0.81 * (0,80–0,82) [PO43-] 1,31 (1,28–1,41) 1.20 (1,14–1,30) Примечание: n – число исследованных образцов; *) статистически значимые различия (p<0,05) с контролем согласно критерию Манна-Уитни. Причиной может быть отложение малорастворимых фосфатов кальция на клетках (кальцификация) и преципитация (обратное осаждение) солей на TiКФ образцах. Подобное поведение ССК в in vitro культуре может свидетельствовать в пользу их дифференцировки в остеобласты, поскольку именно костные клетки контролируют процессы минерализации межклеточного матрикса. Поэтому значение продуктов биодеградации TiКФ образцов для реализации механизмов остеодифференцировки ССК жировой ткани человека представляло непосредственный интерес. Выявлено визуально, что в 3D модели значительно увеличивается интенсивность окраски и количество фокусов окрашивания ализариновым красным (рис. 4б) в процессе минерализации межклеточного вещества при сокультивировании ССК с TiКФ образцами. Межклеточное вещество в 2D культурах (рис. 4а) окрашивалось менее интенсивно. При этом в присутствии TiКФ образцов плотность распределения клеток на пластиковой поверхности лунок планшетов значительно меньше, чем в аналогичной культуре без их добавления (рис. 4а,б). Рисунок 4 - Морфологическое состояние 21-суточной культуры стромальных стволовых клеток жировой ткани человека в стандартной среде DMEM/F12 при сравнительном окрашивании ализариновым красным участков минерализации межклеточного вещества: (а) 2D-культура клеток (контроль), (б) в присутствии 3D-матриксов с КФ покрытием. Линейка в углу снимков соответствует 100 мкм. Компьютерная морфометрия показала (табл. 3), что в 2D культурах не было обнаружено участков минерализации по прошествии 21 суток культивирования in vitro. Напротив, в 3D модели выявлены 156 участков минерализации на лунку; суммарная площадь минерализации в лунке составила около 60 мм2, а площадь отдельных минерализатов достигала 0.0037 (0.0034-0.0043) мм2 (табл. 3), что статистически значимо превышало соответствующие контрольные значения. Таблица 3 – Показатели минерализации внеклеточного матрикса в двух- или трехмерной 21- суточной in vitro культуре стромальных стволовых клеток жировой ткани человека, Me(Q1;Q3) Группа исследований 2D-культура ССК (контроль), n=4 3D-культура ССК, n=3 Тестируемые показатели 59,65* 0,0037* 156* (21,26; 88,47) (0,0034; 0,0043) (156; 208) Суммарная площадь участков минерализации в лунке, кв.мм Площадь отдельных участков минерализации, кв.мм Число участков минерализации в лунке Примечание: n – число исследованных образцов; *) статистически значимые различия (p<0,05) с контролем согласно критерию Манна-Уитни. Таким образом, в in vitro условиях трехмерного моделирования регенерации костной ткани (сокультивирования с трехмерным матриксом, имитирующим минеральное вещество регенерирующей костной ткани) минерализация межклеточного вещества значительно усиливается, что свидетельствует в пользу дифференцировки ССК в секретирующие остеобласты. Cell-IQ система непрерывного микроскопического наблюдения за клетками позволила установить, что эффект TiКФ образцов на функциональную (двигательную и пролиферативную) активность СКК зависит от расстояния. Так, динамика изменения клеточности в точке визуализации 01 (в противоположной стороне от образца) достоверно не отличается в контроле (2D культура) и 3D культуре, моделирующей трехмерную регенерацию костной ткани. В то же время, вблизи TiКФ образцов после 210 ч наблюдения в 3D культуре резко замедляется прирост клеточной массы (p< 0.01, по сравнению с 2D моделью согласно Т-критерию Вилкоксона) до 10-кратных различий к 14-м суткам за счет торможения числа клеточных делений до нуля и линейной скорости клеточной миграции. Дистантный (опосредованный) эффект TiКФ образцов на подвижность и пролиферацию СКК жировой ткани человека оказался короткоранговым, что обусловлено сбалансированными процессами растворения покрытия до ионов кальция и фосфата, и обратного их осаждения на КФ поверхность. При этом ионная преципитация преобладала, что вызвало рост массы образцов к концу наблюдения (табл.3). По данным рентгенофазового анализа, микродуговые КФ покрытия не имеют в своем составе ГАП, однако, содержит атомы фосфора и кальция, а также фазу монетита (CaHPO4). Хотя точный механизм остеоиндукции, обусловленной КФ материалами, в настоящее время неизвестен, установлена взаимосвязь между растворением материала и его остеогенностью (Yuan H. et al., 2010). В свою очередь, RTCA исследование показало, что наночастицы ГАП в концентрации 1 мг/мл без прямого контакта с ССК уменьшали скорость вертикальной миграции клеток через поры в мембране (инвазия) на всех участках наблюдения (рис. 5) системы RTCA в 1.5 раза (p <0.001) по сравнению с контрольной пробой без ГАП Рисунок 5 - Экспериментальные кривые (1—4) и кривые регрессии (сплошные линии y1— y4) изменения импеданса в RTCA системе, отражающего индекс клеточной миграции (ИКМ) стромальных стволовых клеток жировой ткани человека через микропористую мембрану (у1) в присутствии нановзвеси гидроксиапатита (у2). Кривые 3 и 4 показывают изменения импеданса, когда в верхней камере нет клеток; в нижней камере находятся либо нанодисперсия ГАП (y3) либо стандартная культуральная бесклеточная среда (y4). В целом, динамика кальция в ССК и его роль в дифференцировке остеобластов еще не полностью выяснены (Parrington J., Tunn R., 2014; Sun S. et al., 2007). Однако, становится очевидным, что остеодифференцировка ССК, выделенных из костного мозга человека, сопровождается экспрессией Ca2+-связывающих белков (Carlier A. et al., 2011). Тем не менее, при блокировке кальциевых каналов, остеодифференцировка проходит, но в меньшей степени. Это свидетельствует о наличии иных путей проникновения кальция в ССК, которые предстоит изучить (Ye B., 2010). В частности, с использованием фазово-контрастной Cell-IQ микроскопии показано, что визуально определяемые микрочастицы, образующиеся в процессе биодеградации КФ покрытия, присутствуют в среде и внутриклеточном пространстве. При контакте с частицами КФ покрытия, ССК фагоцитируют микрокристаллиты, что, по-видимому, ингибирует их пролиферацию и миграцию после контакта. Другими словами, фагоцитоз может быть еще одним механизмом поступления кальция внутрь стволовых клеток и запуска их морфофункциональной трансформации в остеобласты. Таким образом, продукты деградации 3D-матриксов с КФ покрытием (ионы, микрочастицы) являются близкодействующими триггерами in vitro дифференцировки и созревания части пула ССК жировой ткани в секретирующие остеобласты, с последующей минерализацией (кальцификацией) межклеточного матрикса. Скоординированные взаимодействия с гуморальными факторами, другими клетками и внеклеточным матриксом определяют локальную нишу стволовых клеток со сложной динамической регуляцией (Discher D.E. et al., 2009). Считается, что ССК, в основном, проявляют остеогенный потенциал за счет растворимых паракринных биомолекул и внеклеточных везикул. Качественный состав секретома в ССК варьирует в разных условиях. Эти секретируемые компоненты играют решающую роль в улучшении выживаемости клеток, регуляции регенерации поврежденных тканей (Rahimi B. et al., 2021). Жизнеспособность и функционирование ССК зависит от условий микросреды, в частности, гипоксия, изменения цитокинового профиля биологических жидкостей и клеток микроокружения изменяют биологию ССК (Méndez-Ferrer S. et al., 2010). Сеть медиаторов, образованная не только ССК, но и клетками тканевого микроокружения (Vallés G. et al., 2020), способна существенно влиять на остеогенные свойства ССК. Пока не ясно, но представляет большой интерес, реализуется ли остеомодулирующий эффект этой сети биомолекул посредством ее собственных сигнальных путей, или за счет модуляции активности известных генов остеодифференцировки ССК. В результате оценки экспрессии генов остеодифференировки показано, что ССК после 14-суточного контакта с TiКФ образцами показали повышают уровень экспрессии генов остеодиференцировки (RUNX2, BMP6, ALPL) и пролиферации (hTERT). Так, медианный уровень экспрессии hTERT при добавлении образцов возрастал практически в 7 раз, RUNX2, BMP6 и ALPL примерно в 1,5 раза (табл. 4). Значимые различия в экспрессии других анализируемых генов не обнаружены. Таблица 4 - Уровни относительной экспрессии генов в стромальных стволовых клеток жировой ткани человека при дистантном 14-суточном in vitro сокультивировании с образцами, несущими кальцийфосфатное покрытие, Me (Q1; Q3) Определяемый ген Уровень экспрессии трехмерная (3D) культура, n=7 hTERT 6.90(6.40; 56.5) * RUNX2 BMP6 1.40(1.04; 1.69) * 1.44(1.07; 1.69) * ALPL 1.43(1.03; 1.63) * Примечание: кратность (разы) экспрессии относительно референсного гена RPLPO получены при помощи оценки стандартной ошибки (SE) с помощью модифицированной формулы Пфаффла, (-) знак означает подавление относительной экспрессии гена по сравнению с контрольной культурой клеток на пластике без образцов, *) - p <0,05 по сравнению с культурой клеток без исследуемых образцов по U-критерию Манна – Уитни По результатам мультиплексного анализа по оценке содержания факторов роста, про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов в супернатантах показано что, ССК в стандартной двумерной (2D) культуре секретируют не менее 20 факторов роста, про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. Моделирование трехмерной (3D) культуры приводило к мало выраженному изменению секреторного профиля ССК жировой ткани человека (табл.5). Тем не менее, после 14 суток сокультивирования с TiКФ образцами содержание в супернатантах IL-16, IL-2Ra и GROa снижалось на 23% (p=0,001), 52% (* p=0,001) и 29% (p=0,0001), соответственно. Напротив, концентрации IL-18 и GROa статистически значимо повышались до 152% и 116%, соответственно. Результаты модельного эксперимента позволяют предположить, что 14-й день in vitro культивирования ССК в контакте с шероховатым микродуговым КФ покрытием является переломной точкой окончания провоспалительной фазы, которая характеризуется процессами клеточной миграции и пролиферации, и началом дифференцировки стволовых клеток в секретирующие остеобласты. Повышение (в 1,5 раза) содержания провоспалительного цитокина IL-18 в среде культивирования в условиях 3D культуры способно инициировать процессы остеогенной дифференцировки (Amarasekara D.S. et al., 2021). Кроме того, усиленная секреция IL-18 стромальными клетками подавляет остеокластогенез (Cornish J. et al., 2003). Отмечено значимое повышение уровня секреции провоспалительного хемокина GROa (CXCL1) являющегося медиатором хемотаксиса ССК (Pu Y. et al., 2017). Также GROa способен проявлять остеокластогенную активность (Hardaway A.L. et al., 2015). Увеличенная секреция GROa может свидетельствовать об окончании провоспалительной фазы и переключении на остеогенные процессы (Loi F. et al., 2016). В условиях растущей сети цитокинов и хемокинов, обладающих остеомодулирующими свойствами (IL-18, CXCL1) (Hardaway A.L. et al., 2015), а также функцией сигнальных молекул кроветворных ниш (SCF) (He N. et al., 2014), протекает ремоделирование костного матрикса и закладка новых микротерриторий для гемопоэтических стволовых клеток. По данным корреляционного анализа, выявлены качественные изменения сети биомолекул в 3D культуре ССК. Так, в контрольных культурах установлено 9 сильных корреляционных взаимосвязей, а в 3D - обнаружено только 2 сильных связи. Так, в 3D культурах содержание HGF фактора роста, участвующего в развитии органов в эмбриогенезе и регенерации тканей, было значимо снижено, однако содержание HGF прямо коррелировало (r= 0,76, p<0,05) с уровнем фактора ингибитора лейкемии (LIF), оказывающим иммуномодулирующий эффект на культуру ССК (Nasef A. et al., 2008), и хемотаксическим белком моноцитов-3 (MCP-3) (r= 0,76, p<0,05) оказывающим эффект хоуминга на ССК (Schenk S. et al., 2007). Таблица 5. Секреторная активность (пг/мл) стромальных стволовых клеток жировой ткани человека через 14 дней культивирования с титановыми подложками, несущими кальцийфосфатное покрытие, Me (Q1-Q3). Определяемые биомолекулы IL-1a IL-2Ra IL-3 IL-12p40 IL-16 IL-18 IFN-a2 M-CSF b-NGF HGF LIF MCP-3 MIF MIG GROa SCF SCGF-b SDF-1a TRAIL CTACK Двумерная (2D) культура, n=12 Воспалительные цитокины 0,07 (0 - 0,6725) 17.84 (12.8-27.63) 5,995 (5,49 - 7,88) 30,59 (15,67 - 50,32) 36,87 (30,8 - 48,29) 6,43 (3,445 - 7,905) 17,75 (17,22 - 18,33) Ростовые факторы 15,95 (14,66 - 18,07) 8,595 (7,54 - 10,52) 372 (301,6 - 401,6) Хемокины 13,08 (12,05 - 14,33) 75,68 (63,23 - 125,2) 646,4 (541,5 - 805,5) 9,54 (7,37 - 12,32) 39,06 (36,52 - 41,88) 6,465 (3,843 - 8,73) 15909 (12203 - 19013) 64,64 (45,35 - 83,64) 3,975 (2,888 - 4,73) 42,31 (34,85 - 45,96) Трехмерная (3D) культура, n=18 0,37 (0 - 0,8625) 5,57 (3,763 - 7,295) 38,04 (18,3 - 46,08) 28,49 (20,06 - 33,12) * p=0,001 9,795 (6,595 - 13,15) * p=0,0009 17,6 (16,37 - 17,99) 15,03 (13,87 - 17,55) 7,71 (5,58 - 10,14) 265,7 (166,4 – 336) * p=0,0001 13,01 (11,03 - 14,85) 84,56 (60,75 - 147,7) 652,8 (505,4 - 792,1) 12,28 (8,688 - 14,42) 45,38 (38,96 - 68,12) * p=0,0316 7,76 (4,32 - 10,39) 14604 (12334 - 20057) 71,18 (61,19 - 132,6) 4,3 (3,43 - 5,73) 46,38 (36,21 - 59,48) Примечание: n – число исследованных образцов; *) статистически значимые различия (p<0,05) с контролем согласно критерию Манна-Уитни. В то же время, ген фактора роста гепатоцитов человека (HGF), по механизму обратной связи с концентрацией регулируемого белка, может активироваться, участвуя при этом в регенерации костной ткани (Zhen R. et al., 2018). Согласно полученным нами результатам, в 3D культуре LIF прямо коррелировал с основным фактором формирования кости - геном остеокальцина BGLAP (r= 0,70, p<0,05). В условиях 2D культуры таких закономерностей обнаружено не было. Общая схема внутригрупповых корреляционных взаимосвязей отражена на рисунке 6. 8,48 (8,48-10,23) * p=0,001 Рисунок 6 - Схема корреляционных связей в 3D-модели культуры ССК человека. Красным выделены положительные, синим – отрицательные корреляции. Сила корреляционных взаимосвязей при r > 0,6 выделена шириной линии, соединяющей показатели.
Таким образом, к 14-м суткам в 3D культуре СКК жировой ткани человека формируется трехмерная сеть взаимодействующих плейотропных генов и биомолекул, характеризующих переход от процессов клеточной миграции и пролиферации к межклеточной адгезии и дифференцировке стволовых клеток в секретирующие остеобласты. К 21-м суткам наблюдения образуется минерализованный межклеточный матрикс, свидетельствующий о переходе разрозненных клеточных популяций к прототипу культуры костной ткани in vitro.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С точки зрения физиологической интерпретации полученных данных, стромальные стволовые клетки (ССК) жировой ткани человека в стандартной двумерной 14-21-суточной in vitro культуре слабо экспрессируют гены остеобластов RUNX2, BMP6 и ALPL, сохраняют маркеры стволовости (CD90, 73, 105), активно мигрируют и пролиферируют, но не формируют минерализованный межклеточный матрикс. В 3D культурах ССК жировой ткани человека при прямом контакте с модельными образцами, имитирующими минеральное вещество регенерирующей костной ткани, мигрируют с КФ покрытия и активно заселяют пластиковую поверхность лунок планшетов; при этом культура стволовых клеток на образцах с КФ покрытием и вокруг них претерпевает морфофункциональные изменения, соответствующие выраженной дифференцировке и созреванию в остеобласты.
Основные механизмы остеогенной активности ССК жировой ткани человека в трехмерной in vitro модели регенерации костной ткани включают высвобождение ионов кальция и фосфора и эмиграцию стромальных стволовых клеток с растворимой кальцийфосфатной поверхности, формирование трехмерной сети регуляторных цитокинов/хемокинов. Межмолекулярный сигналинг между плейотропными цитокинами/хемокинами и генами остеодифференцировки приводит к 14-м суткам к активации ранних генов остеодифференцировки (RUNX2, BMP6, ALPL). Как следствие, к 21-м суткам наблюдения образуется минерализованный межклеточный матрикс, свидетельствующий о переходе разрозненных клеточных популяций к прототипу трехмерной культуры костной ткани in vitro.
Полученные данные могут послужить основой для расшифровки механизмов остеоинтеграции изделий с разнообразными КФ покрытиями, выявления сферы их применения при реконструкции костной ткани в области ортопедии и травматологии, челюстно-лицевой хирургии, дентальной имплантологии.
ВЫВОДЫ
1. Адгезирующие фибробластоподобные стромальные стволовые клетки (ССК), выделенные из жировой ткани человека, в стандартной (двумерной) 14-21-суточной in vitro культуре на пластиковой поверхности сохраняют маркеры стволовости (CD73, CD90 и CD105), слабо экспрессируют мРНК остеогенных генов RUNX2, BMP6 и ALPL, активно мигрируют и пролиферируют, но не формируют минерализованный межклеточный матрикс, характерный для культур остеобластов.
2. Трехмерное in vitro моделирование регенерации костной ткани с помощью биосовместимых образцов с кальцийфосфатным покрытием, имитирующим минеральное вещество кости, способствует эмиграции ССК с кальцийфосфатной поверхности, заселению 30 % свободной территории вокруг образцов, индукции дифференцировки и созревания в остеобласты.
3. ССК жировой ткани человека в трехмерной in vitro модели претерпевают на пластике существенную морфофункциональную трансформацию (в сравнении со стандартной культурой клеток на пластике), характеризующую их дифференцировку и созревание в остеобласты: снижение активности процессов миграции и инвазии; уменьшение числа клеточных делений; падение экспрессии маркеров стволовости (CD73, CD90 и CD105) и рост презентации антигенов гемопоэтических клеток (CD 14, CD 20, CD 34, CD 45); повышение экспрессии мРНК остеогенных генов RUNX2, BMP6 и ALPL; изменение секреторного профиля клеток (IL-2Rα, IL-16, IL-18, HGF, GROα); формирование кальцифицированного межклеточного матрикса. 4.Гуморальные механизмы in vitro формирования на пластике минерализованного 3D- прототипа костной ткани включают высвобождение ионов кальция и фосфора и формирование трехмерной сети остеомодулирующих цитокинов/хемокинов.