Новые рекомбинантные белки – антигены TREPONEMA PALLIDUM для серологической диагностики сифилиса

Материалы и методы исследования
Биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей
белков T. pallidum проводился с использованием следующих специализирован-
ных программ: 1) клеточная локализация белков оценивалась с помощью про-
грамм PSORTb 3.0.2 и Cello; 2) выявление трансмембранных альфа-спиральных
областей осуществлялось с использованием TMHMM Server v. 2.0; 3) обнаруже-
ние участков бета-складок выполнено с применением ресурсов BOMP и
TMBETADISC; 4) наличие сигнального пептида у предшественников белков оп-
ределялось с помощью SignalP 4.0; 5) поиск сайтов липидирования проводился
программами UiB Lipo и LipoP. При подтверждении специфичности исследуе-
мых белков для рода Treponema использовалась база данных Национальной ла-
бораторииЛос-Аламоса,США(STDSequencedatabases;
http://stdgen.northwestern.edu), содержащей полную информацию информация о
белках T. pallidum с Tp0001 по Tp1041.
В качестве исходного материала для создания генетических экспресси-
онных систем целевых белков T. pallidum использовалась геномная ДНК
штамма Nichols (GenBank NC_000919.1: 1134809..1135342), культивируемого на
тестикулярной модели у кроликов в виварии Сергиево-Посадского филиала
ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России Конструирование праймеров проведено в
программах NCBI Blast и OLIGO 6.0. Амплификация целевых фрагментов про-
водилась высокоточной полимеразой Pfu (Thermo, США) по следующей про-
грамме: 95 °С – 5 мин; (95 °С – 30 сек, 59 °С – 30 сек, 72 °С – 5 мин) 45 циклов;
72 °С – 7 мин. Полученные ПЦР-продукты и использованный для клонирования
вектор рЕТ28а(+) (содержащий ген устойчивости к канамицину и последова-
тельность His-тега) обрабатывались парой рестрикционных эндонуклеаз NdeI и
BamHI/HindIII/XhoI (Thermo, США), соответствующих сайтам рестрикции в по-
следовательности праймеров для каждого гена, и соединялись с помощью лига-
зы Т4 (Thermo, США). Продукты лигирования использовали для трансформа-
ции компетентных клеток E.coli штамм ТОР10 (Sigma Aldrich, США), получен-
ных путем обработки свежей культуры стерильным водным раствором CaCl2 с
последующей заморозкой на -80°С в растворе с 15% глицерина. Трансформа-
цию проводили методом теплового шока, инкубируя продукты лигирования с
компетентными клетками E. coli ТОР10 во льду в течение 30 мин с последую-
щим нагревом до 42°С в течение 2 мин и повторным охлаждением во льду.
Трансформированные клетки высевали на чашки с агаризованной средой 2xTY,
содержащей селективный антибиотик канамицин в конечной концентрации 50
мкг/мл и инкубировали 18 часов при 37°С.
Для гетерологической экспрессии белков T. pallidum использовались
штаммы-продуценты, полученные путем трансформации клеток E. coli
BL-21(DE3) или E. coli BL-21(DE3)PlysS (Sigma Aldrich, США) описанными
выше экспрессионными системами после их предварительного наращивания и
выделения из клеток E.coli ТОР10. При синтезе целевых продуктов каждый из
штаммов-продуцентов пересевали в жидкую среду 2xTY с 50 мкг/мл канами-
цина и культивировали при 37 °С с непрерывным перемешиванием в течение 3
часов. Индукцию биосинтеза рекомбинантного белка вызывали добавлением
изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 1
мM, после чего культивирование продолжали еще в течение 3 часов. Биомассу
штамма-продуцента осаждали центрифугированием после чего лизировали в
фосфатном буфере (50 мМ Na3PO4, 0,5 М NaCl, рН = 7,4) с применением лизо-
цима и смеси ингибиторов протеиназ (Sigma Aldrich, США).
Очистку рекомбинантных белков T. pallidum проводили методом метал-
хелатной хроматографии на сорбенте Sepharose Ni-NTA (GE Healthcare, Вели-
кобритания). После нанесения бесклеточного лизата штамма-продуцента хро-
матографическую колонку промывали буфером с 50 мМ имидазолом, а затем
элюировали целевой белок линейным градиентом концентрации имидазола
100-500 мМ. Очищенные с помощью металл-хелатной хроматографии реком-
бинантные белки диализировали против исходного буфера, концентрировали в
фильтрационных колонках Amicon Ultracel (Millipore, США) с пределом отсе-
чения 10 кДа и определяли их финальную концентрации по методу Бредфорд.
При оценке эффективности использования синтезированных рекомбинант-
ных белков T. pallidum в качестве антигенов для трепонема-специфической ди-
агностики сифилиса использована коллекция образцов сыворотки крови, по-
лученных от пациентов консультативно-диагностического центра ФГБУ
«ГНЦДК» с предварительно верифицированным диагнозом первичного (n=19),
вторичного (n=27), раннего скрытого (n=36) и позднего скрытого (n =52) сифи-
лиса; больных боррелиозом (n=10) и здоровых индивидов (n=61).
Для исследования реактивности тестируемых образцов сыворотки методом
иммуноферментного анализа (ИФА) каждый из рекомбинантных белков
T. pallidum в концентрации 2 мкг/мл фосфатного буфера (1xPBS) наносили на
планшеты высокой сорбции (Greiner Bio-One, Германия) и инкубировали 12–16
часов при 4°С. Далее планшеты блокировали 1%-го раствором БСА и отмывали
в 1x PBS-Т (с 0,05% Tween-20). Для анализа образцы сыворотки крови (разве-
дение 1:10 в 1x PBS) вносили в лунки, инкубировали 3 часа при 37°С, отмывали
1x PBS-Т и далее проводили гибридизацию с коньюгатом антител к человече-
ским IgG с пероксидазой хрена в течение 1 часа. После этого планшеты отмы-
вали 1x PBS-Т и добавляли раствор хромогена о-фенилендиамина в цитратном
буфере с 0,03% пероксида водорода, инкубировали в течение 15 мин при 37°С.
Результат реакции оценивали значениями оптической плотности при длине
волны 492 нм, регистрируемой на ИФА-анализаторе Multiscan Ascent (Thermo,
США).
Для проведения реакции непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) рас-
творы рекомбинантных белков T. pallidum в концентрации 0,750 мг/мл в смеси
с гелеобразующими мономерами (метакриламида и N-замещенных аминосаха-
ров) наносились на поверхность активированного силаном стеклянного слайда
(Corning, США) и полимеризовали облучением с длиной волны 350 нм и ин-
тенсивностью 0,06 мкВт/см2. Растворы образцов сыворотки 1:10 в 1x PBS нано-
сили на стекло в зоне печати антигенов. После инкубации в течение 12–16 ча-
сов при 37°С стекла ополаскивали деионизированной водой, промывали 1x
PBS-Т в течение 30 минут при скорости 200 об/мин, вновь ополаскивали деио-
низированной водой и высушивали в потоке воздуха. Далее наносили раствор
коньюгата антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина человека с флуоресцент-
ным красителем Су5 (Sigma Aldrich, США). После повторной инкубации в те-
чение 1 часа при 37°С стекла промывали деионизированной водой, высушивали
в потоке воздуха и сканировали при длине волны 670 нм.
Печать экспериментальной партии иммуночипов, содержащих расширен-
ную панель диагностических антигенов T. pallidum проводили на базе ООО
«Биочип ИМБ» по описанной выше методике, нанося рекомбинантные белки в
смеси гелеобразующих мономеров на поверхность стеклянных слайдов с сила-
новым покрытием. Качество полученных иммуночипов оценивали в проходя-
щем свете с помощью биочип-анализатора (ИМБ РАН, Россия) с программным
обеспечением TestChip и QualityСontrol. Готовые к использованию иммуночи-
пы закрывали пластиковой инкубационной камерой объемом 60 мкл с отвер-
стиями для введения образца и хранили при +4 °С до проведения анализа.
Статистический анализ результатов взаимодействия рекомбинантных
белков T. pallidum с образцами сыворотки больных сифилисом, боррелиозом и
здоровых индивидов проводили с использованием программного обеспечения
AtteStat по критерию Манна-Уитни для непарных выборок с поправкой на мно-
жественное сравнение. Характеристика диагностической ценности отдельных
рекомбинантных белков T. pallidum дана в соответствии с ГОСТ Р53022.3–2008
«Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3».
Для решения задачи интегральной диагностики сифилиса и вероятностной
дифференциации его отдельных форм использован алгоритм линейного дис-
криминантного анализа на основе пакета программ Statistica 8.0.
Результаты исследования
Первый этап биоинформатического анализа был направлен на поиск
наиболее имунореактивных белков T. pallidum и базировался на сравнительном
анализе иммунопротеомов (совокупности белков, в отношении которых в сыво-
ротке крови больных сифилисом регистрировался специфический иммунный от-
вет). Проводилось сопоставление баз данных, полученных с использованием
двух взаимодополняющих подходов: 1) серологического скрининга тотальной
библиотеки рекомбинантных белков T. pallidum [Brinkman M.B. et al., 2006]; 2)
серологического скрининга нативных белков T. pallidum, разделенных методом
двумерного электрофореза [McGill M.A. et al., 2010].
Констатирован ограниченный перечень иммунореактивных белков
T. pallidum: 39 в составе тотальной библиотеки и 38 в нативном протеоме. Сре-
ди них для дальнейшего углубленного исследования были отобраны 7 белков,
показавших иммунореактивность по результатам использования обеих плат-
форм, а именно: Tp0163, Tp0216, Tp0319, Tp0684, Tp0769, Tp0971 и Tp1038.
Таблица 1 – Результаты биоинформатического анализа белков T. pallidum
НомерКоличествоНаличие
Клеточная локализацияЛокализация на на-Наличие сайтаКлеточная
открытойα-спиральныхсигнальнойСпецифич-
ружной мембранелипидированиялокализация
рамкитрансмембранныхпоследова-ность для
(наличие β-складок)(на основании
считыванияучастковтельностирода
комплексного
TM BETAUiBLipoTreponema
Программа PSORTb 3.0CelloBOMPTMHMMSignalP 4.0анализа)
DISC-PSSMLipoP
Tp0108Цитопл.Цитопл.––0–––Цитоплазма–
Tp0136Секр.Секр.––1+–+Цитопл. мебр.–
Tp0163Цит. мембр.Цитопл.––0++++Цитопл. мебр.–
Tp0216Цитопл.Цитопл.––0–––Цитоплазма–
Tp0249Перипл.Цитопл.––0+––Цитопл. мебр.–
Tp0259Цитопл.Цитопл.––0–––Цитоплазма+
Тр0277Цитопл.Цитопл.––0–––Цитоплазма–
Тр0319Цит. мембр.Цитопл.––0+++Цитопл. мебр.–
Tp0326Наружн. м.Наружн. м.++1+––Наружн. м.–
Tp0453Неизв.Наружн. м.–+1+++Наружн. м.+
Tp0608Цитопл.Цитопл.––1–––Цитоплазма+
Tр0684Перипл.Цитопл.––0+–+Цитопл. мебр.–
Цит./нар.
Tр0769Неизв.––0+––Наружн. м.–
мембр.
Tp0886Цитопл.Цитопл.––0–––Цитоплазма–
Tp0965Цитопл.Цитопл.––1–––Цитопл. мебр.–
Перипл./
Tр0971Цитопл.––0++++Цитопл. мебр.–
цитопл.
Tр1038Цитопл.Цитопл.––0–––Цитоплазма–
Кроме того, аналогичное решение было принято в отношении ещё 10
белков (Tp0108, Tp0136, Tp0249, Tp0259, Tp0277, Tp0326, Tp0453, Tp0574,
Tp0786, и Tp0965), показавших свою иммуногенность с использованием
только одной протеомной платформы, но упоминаемых в современных науч-
ных источниках в качестве «кандидатных» антигенов для совершенствования
серологической диагностики сифилиса.
Второй этап биоинформатического анализа был ориентирован на иссле-
дование структуры отобранных белков T. pallidum, поиск сайтов липидиро-
вания и определение их вероятной клеточной локализации (Таблица 1).
Оценка локализации анализируемых белков в клетке T. pallidum с помощью
программ PSORTb и CELLO указывала на цитоплазматическое расположение
Tp0108, Tp0216, Tp0259, Тр0277, Tp0608, Tp0886 и Tp1038, что согласовыва-
лось с результатами их структурного анализа (для белка Тр0277 возможной
также являлась локализация в периплазматическом пространстве клетки T.
pallidum).
В свою очередь комплексный анализ белков Tp0249 и Tp0965 свиде-
тельствовал об их локализации на цитоплазматической мембране. Белок
Tp0326 был определен как компонент наружной мембраны, а Tp0136 опреде-
лился обеими программами как «секретируемый» с вероятной локализацией
на клеточной поверхности. Для белков Tp0163, Тр0319, Tp0453, Tp0684,
Tp0769 и Tp0971 клеточные локализации, предсказанные программами
PSORTb и CELLO, совпадали не полностью или идентифицировались только
одной из программ.
С использованием программы THHMM наличие единичных α-
спиральных участков было показано для 5 белков: Tp0136, Tp0326, Tp0453,
Tp0608 и Tp0965. При этом интерпретация данного результата предполагала
низкую вероятность локализации подобных белков на наружной мембране
при более высокой вероятности как белков внутренней (цитоплазматической)
мембраны. С помощью серверов BOMP и TMBETADISC были определены β-
складчатые структуры исследуемых белков, являющихся топологическими
маркерами их расположения на наружной мембране T. pallidum. При этом
наличие β-складчатых структур было показано только для двух белков –
Tp0326 и Tp0453, для которых ранее было установлено присутствие транс-
мембранных α-спиральных областей.
Поиск сигнальных пептидов, являющихся характерной особенностью
предшественников мембранных белков и указывающих на их вероятный экс-
порт через цитоплазматическую мембрану, был выполнен с помощью серве-
ра SignalP 4.0. Наличие сигнального пептида было установлено для 9 из 17
анализируемых белков T. pallidum (Tp0136, Tp0163, Tp0249, Тр0319, Tp0326,
Tp0453, Tp0684, Tp0769 и Tp0971).
На основе интегральной оценки результатов биоинформатического ана-
лиза по совокупности критериев: 1) иммунореактивность, доказанная при ис-
следовании иммунопротеома T. pallidum; 2) локализация в клетке T. pallidum,
доказанная с использованием специализированных компьютерных программ
и лежащая в основе их различной доступности для иммунной системы.
Для последующей разработки были отобраны 6 белков:
– Tp0277 (Prc) – нелипидированная С-терминальная пептидаза S41A;
– Тр0319 (TmpC; PnrA) – липопротеин, связанный с цитоплазматической
мембраной и выполняющий функцию рецептора и транспортера пуриновых
нуклеозидов через цитоплазматическую мембрану;
– Тр0453 – липопротеин, ассоциированный с наружной мембраной, транс-
портер липидов и гликолипидов через наружную мембрану;
– Тр0684 (MglB-2) – липопротеин периплазмы, связанный с цитоплазмати-
ческой мембраной и обеспечивающий АТФ-зависимый транспорт глюкозы и
галактозы;
– Тр0965 (macA) – нелипидированный белок внутренней мембраны с веро-
ятной транспортной функцией;
– Тр1038(TpF1) – нелипидированный цитоплазматический бактериоферри-
тин.
Для создания генетических экспрессионных систем, кодирующих
выбранные целевые белки, была осуществлена амплификация соответст-
вующих генов из тотальной ДНК T. pallidum штамм Nichols (GenBank
NC_000919.1: 1134809..1135342).
Проведенное с этой целью конструирование праймеров, наряду со
стандартными требованиями, предусматривало: 1) фланкирование полной
транслируемой последовательности; 2) добавление с 5’-конца каждого прай-
мера трех дополнительных нуклеотидов и далее последовательности сайта
расщепления рестрикционной эндонуклеазы; 3) контроль положения после-
довательности целевого белка в рамке считывания вектора, 4) присоедине-
ние His-тэга с N-конца синтезируемого пептида и 5) стоп-кодон, обеспечи-
вающий остановку синтеза в конце последовательности целевого белка.
Последовательности сконструированных праймеров приведены в таб-
лице 2.
Таблица 2 – Последовательности праймеров, использованных для амплифи-
кации целевых генов T. pallidum штамм Nichols и длина соответствующих
продуктов ПЦР
Длина
НазваниеПоследовательность 5′-3′
(п.о.)
Тр0277_F_NdeIAATCATATGCAGACGGTGCAGGATGTCTAC
1347
Тр0277_R_HindIIITTTAAGCTTTCAAGATACCTTCTTTTTTTCCTGT
Tp0319_F_NdeITATCATATGGACAGGCCGCAGATGGGAAAC
1080
Tp0319_R_XhoITTTCTCGAGTGTTCATCATGCGTGCAGATCG
Tp0453_F_NdeIGTTCATATGGCATCAGTAGATCCGTTGGGG
Tp0453_R_BamHITGTGGATCCCGAACTTCCCTTTTTGGAGTACAA
Tp0684_F_NdeITTTCATATGGCGGTGCTTGTGGTAGGCTGT
1212
Tp0684_R_HindIIITTTAAGCTTGGTATTTGAGCTTGTCTGTATAG
Tp0965_F_NdeITTTCATATGCTGCGTCGGGTTCCGCCG
Tp0965_R_XhoITTTCTCGAGTTTTCCTCGCTGCACTTTGGTC
Tp01038_F_NdeIGGGCATATGAACATGTGTACAGATGGAAAAAAA
Tp01038_R_ XhoITTTCTCGAGTCAGGCTTTCAGGGTAGCAC
Примечание – подчеркиванием выделены сайты расщепления соответствую-
щих рестрикционных эндонуклеаз

Эффективность амплификации была подтверждена наличием продукта
ПЦР соответствующей длины при электрофорезе в 2% агарозном геле. Очи-
щенные продукты ПЦР были обработаны смесью двух рестрикционных эн-
донуклеаз, соответствующих имеющимся в праймерах сайтам рестрикции,
после чего были лигированы в вектор рЕТ28а(+).
Полученные в результате лигирования экспрессионные системы были
использованы для трансформации компетентных клеткок E. coli ТОР10 с по-
следующим высевом на чашки с агаризованной средой 2xTY, содержащей
селективный фактор – антибиотик канамицин (50 мкг/мл).
Наличие целевой генетической конструкции в выросших колониях бы-
ло подтверждено результатами амплификации с праймерами к встроенному
фрагменту ДНК, а также с праймерами к регионам Т7-промотора (5’-
ATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTG-3’) и Т7-терминатора (5’-
GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT-3’), охватывающими локусы встраи-
вания кодирующего фрагмента в вектор рЕТ28а(+). Окончательное подтвер-
ждение локусов встраивания целевых кодирующих последовательностей в
вектор рЕТ28а(+) и положения целевых фрагментов ДНК в соответствии с
рамкой считывания создаваемой экспрессионной системы было подтвержде-
но секвенированием продуктов ПЦР по Сенгеру.
Подтвержденные экспрессионные системы амплифицировали в клетках
E. coli ТОР10 и выделенной плазмидной ДНК трансформировали компетент-
ные клетки E. coli BL-21(DE3) или BL-21(DE3)pLysS, оптимальные для экс-
прессионных систем на основе вектора рЕТ28а(+).
Экспрессию целевых белков в полученных штаммах-продуцентах
BL-21(DE3)-Тр0319, BL-21(DE3)-Тр0453, BL-21(DE3)-Тр0965, BL-21(DE3)-
Тр1038 индуцировали добавлением ИПТГ; для штаммов BL-21(DE3)pLysS-
Tp0277 и BL-21(DE3)pLysS-Tp0684 использовали протокол «холодной ин-
дукции» при температуре 18ºС. Результаты экспрессии подтверждены дена-
турирующим электрофорезом в полиакриламидном геле с окраской Кумасси
G250, свидетельствующим о появлении четко выраженных полос, при срав-
нении с маркерами молекулярных весов несколько превышающих молеку-
лярные массы целевых белков за счет присоединения фрагмента из 6 амино-
кислотных остатков гистидина.
Последовательности полученных рекомбинантных белков подтвержде-
ны в ходе масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF MS) методом
прямого профилирования с использованием времяпролетного масс-
спектрометра MALDI Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия) и идентифициро-
ваны с помощью программного обеспечения Mascot (Matrix Science) методом
Peptide Mass Fingerprint, основанном на анализе масс-спектрометрических
пептидных карт специфического протеолитического гидролиза исследуемых
белков в ЦКП «Протеом человека» на базе ФГБНУ «Научно-
исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича».
Очистка целевых рекомбинантных белков из лизированной и обрабо-
танной ультразвуком биомассы штаммов-продуцентов после индукции ИПТГ
проведена методом металл-хелатной хроматографии на никель-сефарозном
сорбенте. Наличие целевых белков в хроматографических фракциях было
подтверждено с помощью денатурирующего полиакриламидного гель-
электрофореза в 14% полиакриламидном геле с окраской Кумасси G250.
Фракции, содержащие целевые белки в гомогенном состоянии, объединяли,
диализировали против исходного фосфатного буфера, после чего концентри-
ровали в фильтрационных колонках с пределом отсечения 10кДа (Рисунок 1).
Окончательная оценка концентрации целевых белков по методу Бред-
форд характеризовала их следующими значениями: 1,5 мг/мл для Тр0277;
2,05 мг/мл для Тр0319; 1,95 мг/мл для Тр0453; 1,93 мг/мл для Тр0684; 1,1
мг/мл для Тр0965 и 0,85 мг/мл для Тр1038.
Рисунок 1 – Результаты электрофореза синтезированных de novo целевых ре-
комбинантных белков T. pallidum
Характеристика диагностической ценности полученных рекомби-
нантных белков T. pallidum. Предварительная оценка возможности исполь-
зования рекомбинантных белков Тр0277, Тр0319, Тр0453, Тр0684, Тр0965 и
Тр1038 в качестве антигенов для специфической серологической диагности-
ки сифилиса проведена методом иммуноферментного анализа (ИФА) на вы-
борке образцов сыворотки крови больных сифилисом, сыворотки больных
боррелиозом и здоровых индивидов. Сравнительное изучение диагностиче-
ской ценности 6 синтезированных de novo и 4 коммерчески доступных ре-
комбинантных белков Тр15, Тр17, Тр47 и TmpA проведено методом непря-
мой иммунофлуоресценции (нРИФ) на примере той же выборки образцов
сыворотки крови больных различными формами сифилиса и здоровых инди-
видов.
Тр0277. Изучение антител против белка Тр0277 методом ИФА выявило
значительную долю результатов, которые в соответствии с использованными
критериями относились к «серой зоне» диагностического исследования, как в
группе больных сифилисом (38,5 %), так и в группе здоровых индивидов
(20,0 %). При этом положительный результат ИФА в группе больных сифи-
лисом был зафиксирован в 59,0 %, а отрицательный в группе здоровых инди-
видов – в 80,0 % случаев. Сыворотки крови больных боррелиозом были оце-
нены как «отрицательные» в 100,0 % случаев. Тестирование того же антигена
методом нРИФ характеризовало его специфичность значением 100,0 %, од-
нако чувствительность подобного исследования оказывалась существенно
ниже, варьируя в диапазоне 30,0-77,8% в зависимости от формы сифилиса.
Интегральная диагностическая эффективность использования рекомби-
нантного белка Тр0277 характеризовалась величиной 72,1%.
Тр0319. Исследование образцов сыворотки больных сифилисом в отно-
шении белка Тр0319 методом ИФА показало 59,7 % положительных резуль-
татов, и 19,5 % результатов «серой зоны». Отрицательный результат зафик-
сирован со 100% образцов сыворотки крови больных боррелиозом и 83,3 %
сыворотками здоровых индивидов. При проведении нРИФ специфичность
Тр0319 оказывалась достаточно высокой (97,8%), а чувствительность харак-
теризовалась значением 71,8% за счет относительно низкой чувствительно-
сти в группах больных первичным сифилисом (50,0%) и поздним скрытым
сифилиса (41,7%) при высоких значениях чувствительности 90,0 % и 95,8 %
в группах больных вторичным и ранним скрытым сифилисом, соответствен-
но. Интегральная оценка диагностической эффективности белка Тр0319 вы-
водила его на высокий уровень – 81,3 %.
Тр0453. Использование рекомбинантного белка Тр0453 в формате ИФА
обеспечило 92,0 % положительных результатов в группе больных сифили-
сом, а также 100,0 % и 83,0 % отрицательных результатов в группе больных
боррелиозом и у здоровых индивидов, соответственно. Специфичность дан-
ного антигена в нРИФ составила 100,0 %, а общая чувствительность 95,0 %
при 100 % значениях чувствительности в группах больных вторичным, ран-
ним скрытым и поздним скрытым сифилисом. В результате этого диагности-
ческая эффективность использования рекомбинантного белка Тр0453 для
трепонема-специфической серологической диагностики сифилиса характери-
зовалась наиболее высоким из зафиксированных значений – 96,8 %.
Тр0684. Результаты ИФА с белком Тр0684 оценивали как «положитель-
ные» 53,9 % образцов сыворотки больных сифилисом, а как «отрицательные»
только 30,0 % образцов здоровых индивидов. Согласующийся с этим резуль-
тат получен и при использовании белка Тр0684 при постановке нРИФ: зна-
чения чувствительности диагностического исследования в группах больных
сифилисом варьировали от 9,1 % до 28,6 % со средним значением 16,9 %.
Вследствие этого даже при 100 % специфичности интегральная диагностиче-
ская эффективность применения данного белка составила только 46,7%.
Тр0965. Исследование антител к белку Тр0965 методом ИФА в группе
больных сифилисом оценивало 94,0 % образцов как «положительные», а
100,0 % и 87,5 % в группах больных боррелиозом и здоровых индивидов как
«отрицательные». Однако, по результатам нРИФ чувствительность диагно-
стического исследования с использованием данного антигена составила всего
10,8 %, а специфичность – 80,4 %, что приводило к наименьшим из зарегист-
рированных значений интегральной диагностической эффективности –
35,7%.
Тр1038. Исследование антител к белку Тр1038 методом ИФА в группе
больных сифилисом позволило получить положительный результат в 76,2 %,
в то время как аналогичное исследование в группах больных боррелиозом и
здоровых индивидов давало отрицательный результат в 100,0 % случаев. Од-
нако, по результатам нРИФ на фоне 100,0 % специфичности использования
белка Тр1038, значения чувствительности диагностического исследования в
группах пациентов с различными формами сифилиса распределились в диа-
пазоне от 9,1 % до 22,2 % со средним значением 15,1 %, эффективность ди-
агностического использования белка Тр1038 составила 47,5%.
Обобщающий анализ серореактивности синтезированных de novo ре-
комбинантных белков T. pallidum в сравнении с коммерчески доступными
рекомбинантными белками (Таблица 3) позволил ранжировать их по общей
диагностической эффективности в ряду: Тр0453 (96,8 %) → Тр17 (93,6 %) →
Тр15 (81,8 %) → Тр0319 (81,3 %) → Тр47 (74,8 %) → ТmpA (72,7 %) →
Тр0277 (72,1 %) → Тр1038 (47,5%) → Тр0684 (46,7%) → Тр0965 (35,7%).
Таким образом, три из шести полученных рекомбинантных белков
(Тр0277, Тр0319 и Тр0453) продемонстрировали показатели чувствительно-
сти и специфичности, сопоставимые с таковыми у традиционно используе-
мых рекомбинантных белков, что характеризует их как новые «кандидатные»
антигены для совершенствования специфической серологической диагности-
ки сифилиса и определяет целесообразность их включения в состав расши-
ренной панели диагностических антигенов T. pallidum. При этом наиболее
высокие значения чувствительности и специфичности белка Тр0453 под-
тверждают целесообразность диагностического использования белков на-
ружной мембраны T. pallidum, количество которых, однако, чрезвычайно не-
многочисленно. Высокие значения диагностической эффективности белка
Тр0319 соответствуют представлениям о высокой иммуногенности и имму-
нореактивности липопротеинов цитоплазматической мембраны T. pallidum.
В свою очередь продемонстрированные диагностические характеристи-
ки белка Тр0277 свидетельствуют о возможность использования для заяв-
ленных целей нелипидированных антигенов иной клеточной локализации. На
этом фоне белки Тр0684, Тр0965 и Тр1038 характеризовались сниженными
значениями общей диагностической эффективности, что ограничивает их
применение для заявленной цели. Однако, обеспечиваемые при этом высокая
специфичность и положительная предсказательная ценность диагностическо-
го исследования, сохраняют перспективу использования названных белков
для иных целей, в частности – для вероятностной лабораторной дифферен-
циации скрытых форм сифилиса.
Таблица 3 – Диагностические характеристики рекомбинантных белков T. pallidum при их использовании в качестве
антигенов для серологической диагностики сифилиса

ТmpA*
Тр0277

Тр0319

Тр0453

Тр0684

Тр0965

Тр1038
Диагностические

Тр15*

Тр17*

Тр47*
характеристики

Специфичность (%)
Общая100,097,8100,0100,080,4100,0100,097,897,897,8
Чувствительность (%)
Общая56,471,895,016,910,815,171,191,360,857,3
Первичный сифилис30,050,075,09,120,09,145,560,033,345,5
Вторичный сифилис77,890,0100,017,628,622,289,5100,075,085,7
Ранний скрытый сифилис75,095,8100,028,64,215,881,087,576,271,4
Поздний скрытый сифилис34,641,7100,010,73,412,060,0100,045,822,7
Положительная предсказательная ценность (%)
Общая100,098,2100,0100,050,0100,0100,098,697,897,7
Отрицательная предсказательная ценность (%)
Общая56,466,791,740,233,342,167,286,360,358,4
Диагностическая эффективность (%)
Общая72,181,396,846,735,747,581,893,674,872,7
Примечание – * коммерческие рекомбинантные белки, используемые в рамках регламентированных лабораторных
исследований для специфической серологической диагностики сифилиса
Печать иммуночипов, содержащих расширенную панель антигенов
T. pallidum, а также маркирующие и контрольные реагенты, предназначен-
ные для оценки корректности его диагностического использования, проведе-
на на поверхности стеклянных слайдов с силановым покрытием с примене-
нием технологии сополимеризационной иммобилизации (Рисунок 2).
Принципиальная схема расположения ячеек на рабочей поверхности
иммуночипа представлена на рисунке 2, А. Центральная группа ячеек (выде-
лена серым) содержит рекомбинантные антигены T. pallidum в четырех про-
ворностях каждый, что при проведении исследования позволяет рассчиты-
вать усредненное значение флуоресцентного сигнала. Боковые группы ячеек
содержат маркирующие (Cy5) и контрольные материалы.
Полученная экспериментальная серия иммуночипов была тестирована
на серии образцов сыворотки здоровых индивидов, что позволило опреде-
лить пороговые уровни флуоресценции (ФЛпорог) для каждого использованно-
го рекомбинантного антигена T. pallidum.
В примере (Рисунок 2, Б) результата исследования на иммуночипе об-
разца сыворотки здорового индивида детектируется флуоресценция марки-
рующих (Cy5) и контрольных (IgG, анти-IgG) ячеек; антитела к рекомби-
нантным антигенам T. pallidum не обнаружены.
АБВ

Рисунок 2 – Схема печати иммуночипа с использованием расширенной пане-
ли рекомбинантных антигенов T pallidum (А) и примеры полученных с его
использованием распределений флуоресценции при тестировании образцов
сыворотки здорового индивида (Б) и пациента больного сифилисом (В)
В дальнейшем те же иммуночипы были использованы для исследования
иммунореактивности индивидуальных образцов сыворотки крови больных
сифилисом, пример которого представлен на рисунке 2 В с положительным
результатом взаимодействия антител с антигенами Тр15, Тр17, Тр47, ТmpA,
Tp0277, Тр0319 и Тр0453, а также с флуоресценцией маркирующих (Cy5) и
контрольных (IgG, анти-IgG) ячеек.
Определение алгоритма интерпретации результатов исследования
на иммуночипе для серологического скрининга на сифилис. Использова-
ние алгоритма линейного дискриминантного анализа позволило представить
результаты исследования на иммуночипе в виде уравнения общего вида:
D = a1(ФЛTp15) + a2(ФЛTp17) + … + an(ФЛTpN) + b, (1)
где D – значение дискриминантной функции; ФЛTp15 -…-ФЛTpN – независи-
мые переменные, соответствующие интенсивности флуоресценции (о.е.) в
ячейке с определенным антигеном; a1–an – коэффициенты уравнения, прини-
мающие значения от –0,00025 до 0,041 и характеризующие вклад каждой из
независимых переменных в дискриминацию групп здоровых и больных си-
филисом; b – поправочная константа.
Достигнутое распределение дискриминантной функции D в группах
больных сифилисом и здоровых индивидов оказалось близким к нормально-
му, но существенно различалось по своему диапазону (Рисунок 3).

Рисунок 3 – Распределения значений линейной дискриминантной функции D
(по оси абсцисс) по результатам анализа образцов сыворотки крови на имму-
ночипах с расширенной панелью антигенов T. pallidum в группах больных
сифилисом (серые столбики) и здоровых индивидов (черные столбики). С –
порог отсечения.
В группе здоровых индивидов значения D варьировали в диапазоне от –
2,03 до –0,88, что исключало получение ложноположительных результатов и
обеспечивало 100,0 % специфичность проведенного исследования. Значения
дискриминантной функции в группе больных сифилисом распределялись в
более широком диапазоне (от -1,97 до +5,01), а установленный «порог отсе-
чения» C ≥ – 0,6 позволял правильно идентифицировать 80 из 85 тестирован-
ных образцов сыворотки, что соответствовало чувствительности 94,1%.
Использование результатов исследования на иммуночипе для веро-
ятностной дифференциации скрытых форм сифилиса. С применением
данных исследования образцов сыворотки крови, полученных от пациентов с
ранним и поздним скрытым сифилисом, а также образцов сыворотки крови
здоровых индивидов был проведен дополнительный дискриминантный ана-
лиз, ориентированный на вероятностную дифференциацию сравниваемых
групп. По его результатам наиболее высокое значение статистического пока-
зателя «лямбды Уилкса», характеризующего потенциальный вклад опреде-
ленного антигена в дифференциацию скрытых форм сифилиса, было проде-
монстрировано для синтезированного de novo белка Тр0319 (F-удаление пе-
ременной 22,85; P < 0,001). Также статистически значимым являлось исполь- зование двух «иммунодоминантных» антигенов Тр15 и Тр17 (значения F- фактора 8,77 и 8,08 соответственно; P < 0,001). При этом их совместное ис- пользование обеспечивало значительную степень совпадения результатов серологического и клинического исследования, что, однако, обеспечивало эффективность проводимой дифференциации на уровне только 70,8 % для раннего скрытого и 65,5 % для позднего скрытого сифилиса. С целью повышения эффективности дифференциации скрытых форм сифилиса была проверена гипотеза о возможности её по результатам иссле- дования на иммуночипе с добавлением в панель дополнительных антигенов и определением в сыворотке крови двух классов иммуноглобулинов (IgG и IgM). В расширенную панель рекомбинантных антигенов T. pallidum были добавлены два экспериментальных коммерческих белка, а именно Тр0163 (липопротеин в составе АТФ-связывающего транспортного комплекса на внутренней мембране) и Тр0971 (лактоферрин-связывающий, Zn2+ связы- вающий липо-протеин внутренней мембраны) (Cusabio, Китай). Опублико- ванные исследования [Brinkman M.B. et al., 2006] характеризуют данные бел- ки как наиболее серореактивные при скрытых формах сифилиса, что дало основание для их включения в разработанную панель антигенов. В свою оче- редь определение антител классов IgG и IgM проводилось с использованием специфичных к ним коньюгатов, меченых флуорофорами Су5 и Су3, соот- ветственно, что позволяло выполнять анализ последовательно на одном и том же иммуночипе. В результате анализа было получено однозначное (100%) распределе- ние здоровых индивидов в одну группу (Рисунок 4). Рисунок 4 – Результаты исследования на иммуночипе иммуноглобулинов IgG и IgM к расширенной панели рекомбинантных антигенов T. pallidum в сыво- ротке крови больных скрытыми формами сифилиса и здоровых индивидов по данным дискриминантного анализа в двух проекциях (Корень 1, Корень 2) Группы раннего скрытого и позднего скрытого сифилиса были диффе- ренцированы с эффективностью 88,9% и 94,4%, соответственно. Наибольшее значение для дифференциации имели данные определения антител класса IgG против антигенов Тр15, Тр17, Тр0163, Тр0277, Тр0319, Тр0453 и Тр0971 (p<0,00001), выраженный иммунный ответ на которые был характерен для случаев раннего скрытого сифилиса. Дополнительный вклад в дифференциа- цию вносили единичные высокие уровни антител класса IgМ некоторым на- званным антигенам, в первую очередь к Тр0277 и Тр0453 (p<0,001). В свою очередь особенностью иммунного ответа при позднем скрытом сифилисе яв- лялось обнаружение антител только к одному из используемых антигенов – Tp17, а также полным отсутствием иммунореактивных антител класса IgМ. Тем самым полученные данные свидетельствуют о существовании раз- вернутого иммунного ответа на множество антигенов T.pallidum с различной клеточной локализацией при раннем скрытом сифилисе и его существенном «угасании» при поздним скрытом сифилисе, что может объясняться проис- ходящим переходом возбудителя в иммунологически привилегированные органы и ткани, исключающим его контакт с эффекторами иммунной систе- мы. Указанное обстоятельство определяет возможность нового подхода к ла- бораторной дифференциации скрытых форм сифилиса, основанного на ха- рактеристике спектра антител к расширенной панели антигенов T.pallidum. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследование новых рекомбинантных белков T. pallidum различной кле- точной локализации в качестве антигенов для серологической диагностики сифилиса свидетельствует о целесообразности использования для этих целей периплазматического белка Tp0277, липопротеина цитоплазматической мем- браны Tр0319 и белка наружной мембраны Tр0453. Формирование с их уча- стием расширенной панели антигенов, включающей новые и традиционно используемые «иммунодоминантные» белки T. pallidum, и её практическое использование на основе технологии белковых биочипов (иммуночипов) по- зволило повысить чувствительность трепонема-специфической серологиче- ской диагностики сифилиса, а также подойти к решению принципиально но- вой задачи, связанной с вероятностной дифференциацией ранней скрытой и поздней скрытой форм данного заболевания. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Применение тест-систем с расширенной панелью антигенов T. pallidum (Тр15, Тр17, TmpA, Тр47, Тр0277, Тр0319, Тр0453) в формате иммуночипа рекомендуется для скрининга на сифилис с силу удобства применения и вы- сокой чувствительности и специфичности проводимого серологического ис- следования, а также для уточнения противоречивых результатов других се- рологических тестов с ограниченным количеством используемых диагности- ческих антигенов (Тр15, Тр17, TmpA, Тр47). Вместе с этим применение тест- систем с расширенной панелью антигенов T. pallidum (Тр15, Тр17, TmpA, Тр47, Тр0163, Тр0277, Тр0319, Тр0453, Тр0684, Тр0965, Тр0971, Тр1038) в формате иммуночипа рекомендуется применять для вероятностной диффе- ренциации скрытых форм сифилиса по результатам анализа данных сероло- гического исследования с помощью линейного дискриминантного анализа с целью дальнейшего уточнения схем лечения и ведения пациентов с бессим- птомным течением данного заболевания. ВЫВОДЫ 1. Биоинформатический анализ позволил выявить наиболее иммунореак- тивные компоненты протеома T. pallidum, для которых по результатам иссле- дования сайтов липидирования, трансмембранных участков и сигнальных регионов в структуре пептидной цепи спрогнозирована клеточная локализа- ция и определена перспектива использования белков Tp0277, Tр0319, Tр0684, Tр0965, Tр0453 и Tр1038 в качестве кандидатных антигенов для со- вершенствования специфической серологической диагностики сифилиса. 2. Клонирование генов tp0277, tр0319, tр0453, tр0684, tр0965 и tр1038 в векторе рЕТ28а(+) позволило создать экспрессионные системы для целевых белков T. pallidum, а трансформация ими компетентных клеток E. coli BL- 21(DE3) привела к созданию эффективных штаммов-продуцентов, обеспечи- вающих получение гомогенных фракций целевых белков. 3. В результате экспериментального исследования антител к полученным рекомбинантным белкам T. pallidum в образцах сыворотки крови больных сифилисом и здоровых индивидов констатирована высокая чувствительность и специфичность иммунологических реакций с использованием рекомби- нантных белков Tp0277, Tр0319 и Tр0453, сопоставимая с таковыми у ре- комбинантных белков Тр15, Тр17, Тр47, ТmpA, используемых в рамках рег- ламентированных лабораторных исследований для специфической серологи- ческой диагностики сифилиса, в то время как белки Тр0684, Тр0965 и Tр1038 характеризовались сниженной диагностической эффективностью. 4. Определение антител к расширенной панели антигенов T. pallidum, реализованной в формате белкового чипа (иммуночипа), а также использова- ние соответствующего алгоритма интерпретации результатов исследования на иммуночипе обеспечило 94,1 % чувствительность и 100% специфичность серологического скрининга на сифилис, а также сформировало возможность с эффективностью 88,9% и 94,4%, осуществлять вероятностную дифферен- циацию ранних и поздних скрытых форм данного заболевания.