ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ МИКОБАКТЕРИИ: ОБЩАЯ 17 ХАРАКТЕРИСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Общая характеристика нетуберкулезных микобактерий, их 17 распространенность, клиническое значение и этиологическая роль при муковисцидозе
1.2. Особенности культивирования и идентификации нетуберкулезных 27 микобактерий у пациентов с муковисцидозом
1.3. MALDI-ToF масс-спектрометрия в идентификации нетуберкулезных 34 микобактерий и ее дополнительные возможности
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Дизайн исследования
2.2. Характеристика штаммов микроорганизмов, выделенных совместно с 40 представителями Mycobacterium abscessus complex
2.3. Методика выделения и первичной идентификации микроорганизмов 42 при посеве клинического материала
2.4. Методика идентификации выделенных штаммов с MALDI-ToF масс-спектрометрии
2.5. Метод ДНК-гибридизации для первичной нетуберкулезных микобактерий
использованием 42
идентификации
2.6.Методика обработки и анализа масс-спектров представителей 45 Mycobacterium abscessus complex, полученных с помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии
2.7. Методика секвенирования ДНК
2.8. Методика обработка результатов секвенирования ДНК 2.9. Методика оценки культуральных свойств
47 представителей
3
Mycobacterium abscessus complex
2.10. Методика проведения оценки продуктивности питательной среды
2.11. Методика определения сроков культивирования
2.12. Методы статистической обработки полученных результатов 49 ГЛАВА 3. АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ MYCOBACTERIUM 51 ABSCESSUS COMPLEX У ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОВ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В ПЕРИОД С 2017 ПО 2020 ГОДЫ
3.1. Распространенность Mycobacterium abscessus complex, выделенных из 52 клинического материала в период с 2017 по 2020 годы
3.2. Видовое разнообразие микроорганизмов, выделенных из клинического 60 материала у пациентов с муковисцидозом совместно с представителями Mycobacterium abscessus complex
3.3. Характеристика нетуберкулезных микобактерий от пациентов, 65 обследованных при подозрении на туберкулез легких
3.4. Резюме 66 ГЛАВА 4. АНАЛИЗ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ 70 ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ MYCOBACTERIUM ABSCESSUS COMPLEX ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ
4.1 Определение оптимальных сроков культивирования необходимых для 70 выделения представителей Mycobacterium abscessus complex изолированных от пациентов с муковисцидозом
4.2. Оценка культуральных свойств представителей Mycobacterium 78 abscessus complex выделенных на плотных питательных средах
4.3. Влияние органической соли железа на продуктивность питательных 83 сред для выделения Mycobacterium abscessus complex
4.4. Резюме 86 Г ЛАВА 5. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТЕЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ 89 ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ MYCOBACTERIUM ABSCESSUS COMPLEX С

4
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
5.1. Сравнение масс-спектров, полученных при идентификации MALDI- 91 ToF масс-спектрометрией представителей Mycobacterium abscessus complex, выращенных на различных питательных средах
5.2. Сравнительный анализ характеристик масс-спектров представителей 97 Mycobacterium abscessus complex, выращенных на различных питательных средах
5.3. Возможности использования MALDI-ToF масс-спектрометрии для 101 проведения типирования представителей Mycobacterium abscessus complex
и сравнение с результатами секвенирования ДНК
5.4. Резюме 103 ГЛАВА 6. АНАЛИЗ МАСС-СПЕКТРОВ ШТАММОВ 108 ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ MYCOBACTERIUM ABSCESSUS COMPLEX, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ИНФИЦИРОВАНИИ
6.1. Анализ значений составного индекса корреляции у пациентов с 109 повторными высевами Mycobacterium abscessus complex
6.2. Оценка диагностической значимости показателей составного индекса 121 корреляции для двух последовательно выделенных штаммов Mycobacterium abscessus complex при прогнозировании риска развития микобактериоза у пациентов с муковисцидозом
6.3. Резюме 123 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126 ВЫВОДЫ 139 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 140 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 141 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 142

Для достижения поставленной цели в период с 2017 по 2020 год нами было проведено
исследование 5547 образцов клинического материала, полученного от 1148 пациентов с МВ из
различных регионов Российской Федерации. От 21 пациента с МВ были выделены 56 штаммов
представителей MABSc, 1 штамм изолирован из объекта окружающей среды пациента с МВ.
Параллельно с этим в тот же период был исследован материал от 1707 пациентов при подозрении
на туберкулез, в 15 образцах от 13 пациентов были выделены НТМ по культуральным свойствам
схожим с представителями MABSc.
Всего за период с 2017 по 2020 год совместно со штаммами MABSc было выделено 223
штаммов различных МО. Первичный посев материала, полученного от пациентов с МВ,
выполнялся в соответствии с методиками, описанными в руководстве по микробиологической
диагностике инфекций дыхательных путей у пациентов с МВ и авторской методикой [15]. Для
повышения вероятности обнаружения MABSc посев клинического материала от пациентов с МВ
дополнительно осуществлялся согласно Патенту РФ № 2711957 [23]. Первичный посев
клинического материала при обследовании на туберкулез был проведен в соответствии с
Приказом № 109 МЗ РФ от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных
мероприятий в Российской Федерации» (с изменениями от 5 июня 2017 года). Дизайн
исследования представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 – Дизайн исследования
Для идентификации выделенных МО использовался метод MALDI-ToF MS. Сравнение
полученных масс-спектров проходило со спектрами стандартной библиотеки компании Bruker
Daltonik GmbH и дополнительной библиотеки, содержащей спектры НТМ (Mycobacteria Library
версия 4.0) [1,6,27]. При отборе колоний для нанесения на мишень были разработаны и
использованы устройства для сбора колоний [18,19]. Для идентификации НТМ также был
использован метод ДНК-гибридизации на ДНК-стрипах Hain Lifescience GmbH (Германия)
[7,12,13].
После получения масс-спектров методом MALDI-ToF масс-спектрометрии, проводили их
анализ с использованием программного обеспечения flexAnalisis 3.0 (Bruker Daltonik GmbH,
Германия) и алгоритма детекции пиков Centroid. Вычисления базовой линии проводилось
методом TopHat, сглаживание спектров реализовывали по алгоритму SavitzkyGolay с массой 5
m/z за один цикл. Сравнение белковых профилей визуализировали с использованием программы
MALDI Biotyper 3.0 Offline Classification (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Дополнительно был
проведен расчет ССI – методом BioTyper Composite Correlation Standart Method.
В качестве молекулярных маркеров для подвидовой идентификации штаммов MABSc были
использованы фрагменты генов rpoB и hsp65 длиной 752 п.н. и 441 п.н., соответственно.
Хроматограммы секвенирования анализировались с помощью программного обеспечения Unipro
UGENE (http://ugene.net), на основании чего были получены нуклеотидные последовательности
штаммов представителей MABSc. Для проведения сравнительного анализа нуклеотидные
последовательности фрагментов генов rpoB и hsp65 M.abscessus заимствовались из базы данных
GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).Филогенетическийанализпроводилсяс
использованием алгоритма Neighbor Joining. Выравнивание нуклеотидных последовательностей
проводилось с использованием программного обеспечения MEGA X, алгоритм Muscle.
Для оценки культуральных свойств представителей MABSc на плотных питательных
средах использовали инокулюм с концентрацией клеток 103 КОЕ/мл, что соответствовало 100
клеткам в 0,1 мл. Подготовку инокулюма проводили в соответствии с клиническими
рекомендациями «Внутрилабораторный контроль качества питательных сред для клинических
микробиологических исследований», (2014). Критерий продуктивности рассчитывался исходя из
количества клеток, которые дали видимый рост, выраженный в процентах в трех группах: менее
50%, 50-69%, 70% и более. При культивировании части посевов использовали разработанные
нами флаконы и чашки с двухпозиционной резьбой [9,10,11].
Статистическую обработку результатов проводили с учетом распространенности МО в
зависимости от вида клинического материала, количества представителей MABSc в зависимости
от региона, видового разнообразия МО, выделенных совместно с MABSc; возраста и пола
пациентов, сроков культивирования, R или S формы колоний, продуктивности в зависимости от
среды, уровня коэффициента совпадения Score в зависимости от среды и количества пиков.
Группировку данных и вычисления проводили с использованием пакета программ м Microsoft
Excel® 2013. Статистический анализ проводили с использованием программы StatTech v. 2.1.0
(ООО “Статтех”, Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В период с 2017 по 2020 годы было исследовано 5547 образцов клинического материала,
собранных от 1148 пациентов с МВ из различных регионов РФ. Образцы биоматериала были
представлены свободно отделяемой мокротой (52,1%), МЗСГ (30,0%) и отделяемым со слизистой
оболочки носа (17,9%). За анализируемый период из биологического материала, представленного
преимущественно мокротой 52 образца (93,0%), а также 3 образцами (5,3%) МЗСГ и одним
образцом (1,7%) материала из носовой полости, от 21 пациента с МВ было выделено 56 штаммов
MABSc. При оценке региональной инфицированности в ФО РФ, были получены следующие
результаты (доля инфицированных): представители MABSc изолированы из посевов
биоматериала от пациентов из ЦФО – 4 больных с высевами представителей MABSc (2,8%), из
ЮФО – 6 пациентов (3,5%), из ПФО – 7 больных (2,0%), из УФО – 4 пациента (4,1%). Из всех
областей, включенных в ФО, лидирующую позицию по количеству пациентов с МВ, от которых
были выделены MABSc занимает, Ростовская область – 4 пациента (6,3%) (рисунок 2).

Ростовская обл.
5%
Тюменская обл.
5%
19%Московская обл.
5%
Самарская обл
5%
Республика Татарстан
5%Республика Башкортостан
Республика Крым
5%14%
Республика Марий Эл
5%Свердловская обл.
5%Волгоградская обл.
9%
Воронежская обл.
9%
9%Липецкая обл.
Пермский край

Рисунок 2 – Субъекты РФ, в которых зарегистрированы пациенты с высевами MABSc
(указаны доли от общего количества MABSc, выделенных от пациентов с МВ)
При исследовании практически во всех образцах материала от пациентов с МВ,
исследованных культуральным способом совместно с MABSc, был получен рост сопутствующей
микрофлоры. Всего было выделено 223 штамма различных МО, большая часть которых имеет
клиническое значение у пациентов с МВ. Чаще всего были выделены грамположительные МО,
затем НФГОБ и дрожжеподобные грибы. В целом среди всех результатов микробиологического
исследования в 82,1% случаев MABSc были выделены с клинически значимой для пациентов с
МВ микрофлорой [1,27]. По этой причине подбор оптимальных селективных питательных сред
и их использование для выделения MABSc является актуальным, а сопутствующая микрофлора
может подавлять рост MABSc, что в результате влияет на качество диагностики микобактериозов
[4].
В нашем исследовании среди 56 штаммов, выделенных от пациентов с МВ, рост 43 (76,8%)
штаммов был выявлен в период до 14 суток, что соответствует общепринятым срокам, однако
рост 13 (23,2%) штаммов регистрировался после 14 суток. Анализируя полученные данные,
можно сделать заключение о том, что вне зависимости от информации из анамнеза о предыдущих
высевах НТМ культивирование посевов на селективной среде для выделения ВСС от пациентов
с МВ целесообразно проводить до 28 суток. Увеличение сроков выявления роста связано с рядом
причин, в том числе доступностью и составом компонентов в питательной среде, а также
применением антимикробной химиотерапии у пациентов с МВ [2,21].
Помимоэтого,пересевчистойкультурыпредставителейMABScнаплотные
агаризированные питательные среды позволил нам оценить диссоциацию по культуральным
свойствам MABSc при развитии микобактериозов у пациентов с МВ [22]. При культивировании
на хромогенной среде были выявлены несколько морфотипов MABSc: 30 штаммов (46,9%) росли
в форме S колоний, 11 штаммов (17,2%) в R форме колоний и 23 штамма (35,9%) при
культивировании давали рост как в S, так и в R форме (рисунок 3,4,5). Таким образом, только
при оценке типа колоний штаммов MABSc, выросших на универсальной хромогенной среде
были выявлены статистически значимые различия в зависимости от показателя формы
инфекционного процесса (p<0,001). Рисунок 3 – Вариант S формы колоний представителей MABSc, выделенных на универсальной хромогенной среде и среде для выделения BCC Рисунок 4 – Вариант R формы колоний представителей MABSc, выделенных на универсальной хромогенной среде и среде для выделения BCC Рисунок 5 – Вариант R и S формы колоний представителей MABSc, выделенных на универсальной хромогенной среде и среде для выделения BCC Количество штаммов в S форме, выделенных от пациентов с хроническим инфицированием до появления клинических проявлений, достоверно выше, чем от хронически инфицированных пациентов с клиническими проявлениями, и от пациентов с однократным высевом. У пациентов с хроническим инфицированием с клиническими проявлениями было обнаружено достоверно больше штаммов, которые растут в R форме. При этом у пациентов, обследованных однократно не зарегистрирован рост колоний в R форме, все штаммы давали рост в виде либо S колоний, либо в S и R форме одновременно. Для определения оптимальной концентрации железа с целью повышения продуктивности питательной среды нами были проанализированы несколько вариантов питательной среды для выделения BCC с различными концентрациями соли железа. После процедур культивирования статистически достоверные различия были получены для штаммов, выросших на среде для выделения BCC с концентрацией органической соли железа (III) гидроксида полимальтозата 240 мг. Результаты продуктивности среды для выделения BCC с концентрацией соли железа 240 мг были сопоставимы с продуктивностью универсальной хромогенной среды, что делает ее приемлемой при исследовании материала от пациентов с МВ [2]. Далее в исследовании были получены спектры с 64 штаммов представителей MABSc, из которых 8 штаммов были выделены от пациентов при обследовании на туберкулез. Идентификация выделенных штаммов проводилась с использованием метода расширенного прямого нанесения. Первым этапом этого раздела исследования было проведение сравнения результатов идентификации MABSc, выращенных на среде для выделения BCC с использованием основной библиотеки масс-спектрометра, с библиотекой дополнительных спектров НТМ (Mycobacteria Library версия 4.0, Bruker Daltonik GmbH, Германия). Вне зависимости от использованной библиотеки результат видовой идентификации был ограничен всего двумя штаммами из 64, что составило 3,1%. Для видовой идентификации при использовании среды для выделения ВСС было необходимо использовать метод экстракции муравьиной кислотой, что требует гораздо больше времени в пробоподготовке. Данный метод значительно ограничен в рутинной микробиологической практике [6,7,8]. При использовании специализированной библиотеки для штаммов MABSc, рост которых получен на универсальной хромогенной среде, видовая идентификация была получена в отношении 38 культур (59,4%). Таким образом, метод расширенного прямого нанесения оказался приемлемым при использовании универсальной хромогенной среды для получения результатов видовой идентификации. Результаты статистического анализа показали, что несмотря на то, что у штаммов, выращенных на разработанной нами среде, было получено достоверно большее количество пиков, чем со среды для выделения BCC, значения Score оказались сопоставимы и достоверных различий в результате идентификации выявлено не было. Согласно проведенным исследованиям разработанная нами среда для выделения представителей MABSc из клинического материала от пациентов с МВ показала более высокие показатели Score, полученные при идентификации с использованием библиотеки Mycobacteria Library версия 4.0 MALDI-ToF масс-спектрометра, что подтверждает ее использование при диагностике микобактериозов у пациентов с МВ. При этом после первичного посева исследуемого материала и выделения на разработанной нами среде представителей MABSc с последующей их идентификацией, необходимо проводить пересев микобактерий на хромогенную среду для оценки культуральных свойств и повышения качества видовой идентификации. При хроническом инфицировании с клиническими проявлениями было обнаружено достоверно больше штаммов, которые растут в R форме. Эти данные свидетельствуют о том, что при длительном инфицировании популяция штаммов MABSc становится более однородной по культуральным свойствам, при этом получение только R колоний на универсальной хромогенной среде достоверно связано с переходом хронического инфицирования в обострение с появлением клиническихилирентгенологическихсимптомов микобактериоза.Однакоданныео диссоциации микроорганизмов по культуральным свойствам затруднительно использовать для проведения прогностических исследований, в связи с чем нами был предложен способ прогнозирования развития микобактериоза по данным анализа масс-спектров, полученных со штаммов, последовательно выделенных от пациентов с хроническим высевом MABSc [24,25]. После проведения анализа масс-спектров и построения CCI матриц были выявлены достоверные различия между значениями CCI индекса для пар последовательно выделенных штаммов MABSc от пациентов с хроническим высевом без клинической картины микобактериоза и с развитием клинической и/или рентгенологической картины микобактериоза. Результаты приведены в таблице 1. Таблица 1 – Значения CCI индекса от клинических и/или рентгенологических признаков микобактериоза Клинические и/илиЗначение CCI индекса для последовательно рентгенологические признакивыделенных штаммовp микобактериозаM ± SD95% ДИn Отсутствие0,672 ± 0,1440,561 – 0,7829 0,010* Наличие0,789 ± 0,0980,749 – 0,82826 * – различия показателей статистически значимы p<0,05 M – средняя арифметическая величина; SD – стандартное отклонение; ДИ – доверительный интервал границ 95%; n – количество штаммов На основе полученных данных проведен ROC-анализ, по результатам которого определены значения CCI индекса для последовательно выделенных штаммов MABSc которые могут быть использованы для дополнительного микробиологического критерия в оценке риска развития клинической картины микобактериоза у пациентов с МВ. Пороговое значение показателя CCI индекс в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 0,603. Чувствительность и специфичность модели составили 100,0% и 44,4%, соответственно. Полученная модель была статистически значимой (р=0,045). На основании полученных результатов проведенного исследования был предложен алгоритм микробиологической диагностики у пациентов с МВ, направленный на улучшение выделения и идентификации быстрорастущих НТМ, который представлен на рисунке 6. Рисунок 6 – Алгоритм микробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных нетуберкулезными микобактериями, у пациентов с муковисцидозом В случае повторного высева MABSc у пациентов с МВ и расчете CCI индекса при его значении <0,603 – микробиологическое обследование проводится в 1 раз в 3 месяца в соответствии с рекомендациями, так как риск развития клинической картины микобактериоза низкий. В случае значения CCI индекса ≥0,603 необходим регулярный микробиологический мониторинг не реже одного раз в месяц с определением культуральных свойств штаммов MABSc, выделенных на универсальной хромогенной среде, содержащей триптофан и хромогены для выявления глюкуронидаз и галактозидаз, и расчетом CCI индекса для последовательно выделенных штаммов в качестве дополнительного критерия оценки риска развития клинической картины микобактериоза. Использование предложенного алгоритма позволит оптимизировать микробиологическую диагностику инфекционных осложнений, вызванных нетуберкулезными микобактериями, у пациентов с муковисцидозом. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Такимобразом,предлагаемыевариантыпооптимизациимикробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных нетуберкулезными микобактериями, у пациентовсмуковисцидозом,которыевключаютпролонгированноедо28суток культивирование с использованием разработанной нами среды с добавлением железа (III) гидроксида полимальтозата, последующий пересев отдельных колоний на универсальную хромогенную среду с идентификацией и оценкой RS диссоциации, а также анализ CCI индекса дляпоследовательновыделенныхштаммовНТМпозволяетулучшитьдиагностику микобактериозов у пациентов с МВ. Перспективы дальнейшей разработки темы: Дальнейшее развитие работы планируется в следующих направлениях: 1. Проведение исследований, направленных на выделение представителей MABSc из клинического материала пациентов с МВ с последующим анализом культуральных особенностей и проведением исследований, направленных на определение белковых профилей микобактерий. 2. Пополнение коллекции представителей MABSc, выделенных от пациентов с МВ, а также дальнейшее проведение оценки гетерогенности выделенных штаммов с определением чувствительности к антимикробным химиопрепаратам колоний разных морфотипов. 3. Оценка возможности использования предложенного алгоритма для оптимизации микробиологической диагностики микобактериозов у пациентов с другими нозологическими формами. Выводы 1. Распространенность представителей Mycobacterium abscessus complex среди пациентов с муковисцидозом, включенных в исследование составила 1,8%. Доля пациентов, от которых были выделены Mycobacterium abscessus complex, по Федеральным округам варьировала от 2,0% до 4,1%. 2. Увеличение сроков культивирования до 28 суток позволило дополнительно выявить рост 13 (23,2%) штаммов Mycobacterium abscessus complex. Последующая процедура пересева микобактерий со среды для выделения Burkholderia cepacia complex на универсальную хромогенную среду, содержащую триптофан и хромогены для выявления глюкуронидаз и галактозидаз, повысила достоверность результатов выявления R и S диссоциации штаммов Mycobacterium abscessus complex. 3. Использование разработанной среды с добавлением железа (III) гидроксида полимальтозата позволило повысить ее продуктивность для выделения Mycobacterium abscessus complex. 4. Результаты видовой идентификации методом MALDI-ToF масс-спектрометрией с прямым расширенным нанесением при использовании среды для выделения Burkholderia cepacia complex оказались неприемлемыми, при этом до вида было идентифицировано 3,1% выделенных штаммов. При использовании универсальной хромогенной среды, содержащей триптофан и хромогены для выявления глюкуронидаз и галактозидаз, до вида было идентифицировано 59,4% штаммов Mycobacterium abscessus complex. 5. Составной индекс корреляции при анализе масс-спектров для пар последовательно выделенных штаммов Mycobacterium abscessus complex от пациентов с хроническим инфицированием может быть использован в качестве дополнительного микробиологического критерия в оценке риска развития клинической картины микобактериоза у пациентов с муковисцидозом. Практические рекомендации Для повышения вероятности выделения Mycobacterium abscessus complex из клинического материала от пациентов с муковисцидозом в микробиологических лабораториях необходимо проводить пролонгированное культивирование посевов до 28 суток на искусственной питательной среде для выделения Burkholderia cepacia complex, содержащей 240 мг железа (III) гидроксида полимальтозата. Выделенные при первичном посеве штаммы Mycobacterium abscessus complex целесообразно дополнительно пересевать на универсальную хромогенную среду, содержащую триптофан и хромогены для выявления глюкуронидаз и галактозидаз, для получения достоверных результатов о R и S диссоциации и проведения видовой идентификации методом MALDI-ToF масс-спектрометрии с прямым расширенным нанесением. Для оптимизации микробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных нетуберкулезными микобактериями, у пациентов с муковисцидозом целесообразно использовать предлагаемый алгоритм с расчетом составного индекса корреляции для пар последовательно выделенных штаммов Mycobacterium abscessus complex от пациентов с хроническим инфицированием в качестве дополнительного микробиологического критерия в оценке риска развития клинической картины микобактериоза.

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Нетуберкулезные микобактерии (НТМ) представляют собой распространенную в окружающей среде группу микроорганизмов (МО), которая зачастую может стать причиной хронического инфицирования у пациентов с сопутствующими структурными изменениями дыхательных путей, такими как, например, при муковисцидозе (МВ). Поражение легких, вызванное НТМ, может представлять серьезную проблему, определяющую течение и исход основного заболевания у пациентов с МВ, с точки зрения развития инфекционных осложнений [52, 72, 115].
В настоящее время в мире во многих профильных центрах, занимающихся диагностикой и лечением пациентов с МВ, специалисты сталкиваются с самой распространенной группой быстрорастущих НТМ, встречающейся у пациентов с МВ, – представителями Mycobacterium abscessus complex (MABSc). В связи с морфологическими особенностями MABSc, обеспечивающими их устойчивость ко многим дезинфектантам, существует определенный риск распространения данной группы МО среди госпитализированных и амбулаторных пациентов, а экологические особенности этой группы микроорганизмов играют особую роль в проведении эпидемиологических исследований [77, 157].
Инфицирование МО часто связано с возрастом пациентов с МВ: по данным литературы, чем старше пациент, тем больше вероятность выделения у него НТМ из клинического материала. У 10-летних детей НТМ встречаются в 10% случаев, а у взрослых пациентов старше 40 лет – в более чем 30% случаев. У более 50% пациентов, у которых МВ был диагностирован во взрослом возрасте, НТМ колонизируют дыхательные пути. Наблюдается тенденция преобладания того или иного вида НТМ в зависимости от возраста пациента с МВ: Mycobacterium avium complex чаще выделяется от пациентов старше 25 лет, в то время как инфицирование бактериями MABSc характерно почти для всех возрастных групп
[8, 41, 100].
Также стоит отметить, что согласно данным некоторых исследований,
весомое количество случаев инфицирования микобактериями приходится на пациентов, которые находятся в возрасте 11-15 лет. У таких пациентов заболевание протекает тяжелее, а смертность выше, чем у инфицированных представителей более старшей возрастной группы, что связано с прогрессирующими темпами снижения функциональности легких [8].
За последние 40 лет было зафиксировано увеличение частоты распространения MABSc, выделенных из мокроты пациентов с МВ. Кроме того, относительная частота обнаружения бактерий MABSc в клиническом материале, собранном от пациентов с МВ, за последнее время значительно возросла как в США, так и в Европе, что скорее говорит о реальном изменении уровня инфицированности НТМ [85, 106].
НТМ могут вызвать прогрессирующее воспалительное поражение легких – заболевание, которое называется микобактериозом и характеризуется наличием специфических микробиологических, клинических и рентгенологических признаков. В свою очередь, в последнее время было доказано, что НТМ могут присутствовать в легких пациента с МВ временно, нерегулярно или постоянно, не вызывая при этом развитие микобактериоза и представляя собой бессимптомную инфекцию, обнаружение и диагностика которой в этом случае сопряжена со значительными трудностями. В связи с этим совершенствование и оптимизация микробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных НТМ у пациентов с МВ, играет важную роль в постановке диагноза микобактериоза, что ведет к определенной тактике антимикробной химиотерапии этой инфекции, а также к возможному уменьшению вероятности ее распространения [45, 57]. Цель исследования
Оптимизация методов выделения и идентификации быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий для улучшения микробиологической диагностики инфекционных осложнений у пациентов с муковисцидозом.
Задачи исследования
1. Проанализировать распространенность нетуберкулезных микобактерий в клиническом материале от пациентов с муковисцидозом.
2. Выявить особенности культуральных свойств Mycobacterium abscessus complex, определить оптимальные сроки культивирования и возможность использования искусственной питательной среды с ростовой добавкой.
3. Оценить возможность идентификации с использованием MALDI-ToF масс- спектрометрии Mycobacterium abscessus complex, выращенных на различных питательных средах.
4. Провести анализ масс-спектров штаммов Mycobacterium abscessus complex, выделенных от пациентов с хроническим инфицированием, и определить дополнительный микробиологический критерий в оценке риска развития клинической картины микобактериоза у пациентов с муковисцидозом.
Методология и методы диссертационного исследования
Исследования, направленные на оценку культуральных свойств МО, их идентификация методом MALDI-ToF масс-спектрометрией, анализ полученных масс-спектров проводились на базе кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (зав. каф. – з.д.н. РФ, д.м.н., проф. А.В. Жестков). Методологический принцип исследовательской работы заключался в комплексном подходе оценки распространенности, особенностей культивирования и идентификации, анализа масс-спектров представителей
MABSc, выделенных из клинического материала от пациентов с МВ.
Первичный посев клинического материала от пациентов с МВ проводился на базе микробиологического отдела КДЛ Клиник ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (зав.лаб. – д.м.н., доцент О.А. Гусякова). Первичный посев клинического материала от пациентов, обследованных при подозрении на туберкулез, отбор культур, в которых были выявлены представители MABSc, и их идентификация с использованием метода ДНК-гибридизации проводились на базе бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер им. Н.В. Постникова» (зав. – врач-бактериолог высшей категории Т.П. Персиянцева). Подготовка к секвенированию и анализ хроматограмм проводились в отделе НТР ООО “ТестГен” (директор по науке – к.б.н., Д.А. Викторов). Секвенирование проводилось в ООО “Синтол” (г. Москва), куда направлялись подготовленные для секвенирования образцы (генеральный
директор – А.В. Кузубов).
В период с 2017 по 2020 год нами было проведено исследование 5547
образцов клинического материала, полученного от 1148 пациентов с МВ из различных регионов России. Всего от 21 пациента с МВ были выделены 56 штаммов представителей MABSc. В тот же период был исследован материал от 1707 пациентов при подозрении на туберкулез, в 515 образцах от 404 пациентов был выявлен рост микрофлоры с культуральными свойствами, характерными для НТМ. В 15 образцах от 13 пациентов были выделены НТМ по культуральным свойствам схожим с представителями MABSc.
Для выделенных штаммов было проведено определение оптимальных сроков культивирования, необходимых для выделения представителей MABSc из клинического материала от пациентов с МВ. Проведена оценка культуральных свойств представителей MABSc, выращенных на плотных питательных средах; дополнительно проведен анализ масс-спетктров с расчетом составного индекса корреляци. Установлены возможности идентификации MABSc и их оценка при культивировании штаммов MABSc на различных питательных средах путем сравнения масс-спектров, полученных при идентификации методом MALDI-ToF масс-спектрометрии. Дополнительно проведен анализ масс-спектров штаммов
MABSc, выделенных от пациентов с МВ, при хроническом инфицировании.
Все культуры выделенных микроорганизмов были идентифицированы с использованием метода MALDI-ToF масс-спектрометрии. У всех штаммов НТМ был проведен анализ масс-спектров, полученных при MALDI-ToF масс- спектрометрии с использованием программ flexAnalysis 3.0 и MALDI Biotyper 3.0
Offline Classification (Bruker Daltonik GmbH, Германия).
Проведена статистическая обработка результатов с учетом
распространенности МО в зависимости от вида клинического материала, количества представителей MABSc в зависимости от региона, видового разнообразия МО, выделенных совместно с MABSc, возраста и пола пациентов, сроков культивирования, R или S формы колоний, продуктивности и уровня коэффициента совпадения Score в зависимости от среды, а также количества пиков в зависимости от среды. Группировку данных и вычисления проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel® 2013. Статистический анализ проводили с использованием программы StatTech v. 2.1.0 (ООО “Статтех”, Россия).
Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых более 50). Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1 – Q3). Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, при условии равенства дисперсий выполнялось с помощью t-
критерия Стьюдента.
Для оценки статистической значимости влияния хромогенной среды на
показатели Score в зависимости от используемой библиотеки масс-спектров проводили расчет p-value для U-критерия Манна-Уитни, для которого были установлены статистически значимые различия (p<0,05). Сравнение трех и более групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью критерия Краскела-Уоллиса, связь между признаками статистически расценивали как значимую при уровне значимости (p<0,05). При оценке типа колоний в зависимости от показателя формы инфекционного процесса, анализе продуктивности в зависимости от среды, анализе показателя «продуктивность» в зависимости от показателя «среда/концентрация железа» использовали метод Хи-квадрат Пирсона, для которого были установлены статистически значимые различия (p<0,05). Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью точного критерия Фишера (при значениях явления менее 10). Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода, применялся метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определялось по наивысшему значению индекса Юдена. В работе проводился биоинформационный анализ масс-спектров выделенных культур с использованием программных пакетов flexAnalysis 3.0 и MALDI Biotyper 3.0 Offline Classification на базе MALDI-ToF масс-спектрометра Microflex LT (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Достоверность полученных результатов достигнута за счет применения в качестве методологической и теоретической базы фундаментальных трудов в области микробиологии; соответствия результатов современному уровню методик проведения исследований. Основные положения диссертации обсуждены на XIX Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии и клинической микробиологии (Москва, 2017), Российско-Китайском конгрессе по медицинской микробиологии, эпидемиологии и клинической микологии (XX Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2017), 38-м Ежегодном конгрессе Европейского общества микобактериологии (Шибенки, 2017), III Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2017), 24-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2017), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы пульмонологии детского возраста и взрослых пациентов с муковисцидозом» (Севастополь, 2017), Межрегиональной научно- практической конференции «Актуальные вопросы пульмонологии детского возраста и взрослых пациентов с муковисцидозом» (Сыктывкар, 2018), 29-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Амстердам, 2019), Научно-практической конференции «Муковисцидоз сегодня: от ребенка к взрослому» (Чебоксары, 2019), Всероссийском Конгрессе по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXIII Кашкинские чтения) (Санкт- Петербург, 2020), IV всероссийской молодёжной научной школе-конференции с международным участием «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2021), Всероссийской научно- практической конференции с международным участием «Новые технологии в развитии фтизиатрии и инфекционных заболеваний» (Москва, 2021). Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку научной гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования, формулировка цели и задач, разработка дизайна исследования проводились совместно с научным руководителем: д.м.н., доцентом А.В. Ляминым. Экспериментальные исследования, анализ полученных данных, их интерпретация, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях и конгрессах проводились совместно с сотрудниками кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (зав. каф. – з.д.н. РФ, д.м.н., профессор А.В. Жестков), бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер им. Н.В. Постникова» (зав. – врач- бактериолог высшей категории Т.П. Персиянцева), отдела НТР ООО "ТестГен" (директор по науке – к.б.н., Д.А. Викторов). Секвенирование проводилось в ООО "Синтол" (г. Москва), куда направлялись подготовленные для секвенирования образцы (генеральный директор – А.В. Кузубов). Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, статистическая обработка первичных данных, написание и оформление рукописи диссертации проведены лично диссертантом. Положения, выносимые на защиту 1. Распространенность представителей Mycobacterium abscessus complex среди пациентов с муковисцидозом включенных в исследование составила 1,8%, при этом доля пациентов, от которых были выделены Mycobacterium abscessus complex по Федеральным округам варьировала от 2,0% до 4,1%. В большинстве случаев Mycobacterium abscessus complex были выделены с другими клинически значимыми микроорганизмами. 2. При регулярном исследовании клинического материала от пациентов с муковисцидозом необходима продленная инкубация первичных посевов до 28 суток. Добавление железа (III) гидроксида полимальтозата повышает продуктивность среды для выделения Burkholderia cepacia complex в отношении штаммов Mycobacterium abscessus complex. 3. Использование универсальной хромогенной среды, содержащей триптофан и хромогены для выявления глюкуронидаз и галактозидаз, позволяет выявлять диссоциацию Mycobacterium abscessus complex по культуральным свойствам и повышает качество видовой идентификации с использованием MALDI-ToF масс- спектрометрии методом расширенного прямого нанесения. 4. Анализ масс-спектров штаммов Mycobacterium abscessus complex, выделенных от пациентов с муковисцидозом, может быть использован при прогнозировании развития микобактериоза в случае повторных высевов нетуберкулезных микобактерий. Научная новизна Впервые проведен анализ распространенности представителей MABSc, выделенных из клинического материала у пациентов с МВ в Российской Федерации, с использованием агаризованных питательных сред. Установлен материал, из которого наиболее часто были выделены представители MABSc. Проведено исследование распространенности MABSc отдельно по субъектам РФ, выявлены максимальные и минимальные показатели распространенности среди них. Проведена оценка видового состава МО, выделенных совместно с MABSc, а также доля пациентов, у которых были выделены MABSc, среди пациентов, обследованных на туберкулез. Впервые проведено исследование по установлению оптимальных сроков культивирования необходимых для выделения представителей MABSc, изолированных от пациентов с МВ. Проведена оценка культуральных свойств MABSc, выделенных на плотных питательных средах, и зависимости формы колонии от формы инфекционного процесса у пациентов с МВ. Впервые проведено исследование, направленное на установление влияния органической соли железа на продуктивность питательных сред, для выделения MABSc из клинического материала от пациентов с МВ. Установлено, что среда для выделения BCC с добавкой, содержащей железа (III) гидроксид полимальтозат, обладает высокой продуктивностью и может быть использована для выделения MABSc у пациентов с МВ. Впервые проведена оценка возможности идентификации с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии представителей MABSc, выделенных от пациентов с МВ, выращенных на различных питательных средах. Проведены оценка возможности использования MALDI-ToF масс- спектрометрии для проведения типирования представителей MABSc, выделенных на различных питательных средах, и сравнение полученных результатов с результатами секвенирования. Впервые проведен анализ масс-спектров штаммов представителей MABSc, выделенных от пациентов с МВ, при хроническом инфицировании. Значение коэффициента корреляции при сравнении масс-спектров двух последовательно выделенных штаммов MABSc может быть использовано при прогнозировании развития микобактериоза в случае повторных высевов нетуберкулезных микобактерий. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость исследования заключается в оптимизации методов выделения и идентификации быстрорастущих НТМ для улучшения микробиологической диагностики инфекционных осложнений у пациентов с МВ на примере MABSc. Определены оптимальные сроки культивирования, необходимые для выделения представителей MABSc из клинического материала от пациентов с МВ. Предложенные комбинации использования среды для выделения BCC и универсальной хромогенной среды при регулярном микробиологическом исследовании материала от пациентов с МВ позволяют выявлять диссоциацию MABSc по культуральным свойствам при развитии микобактериозов у пациентов с МВ. Введение добавки, содержащей органическую соль железа, позволяет повысить продуктивность среды для выделения BCC в отношении MABSc. Анализ масс-спектров штаммов MABSc, выделенных от пациентов с МВ, может быть использован при прогнозировании развития микобактериоза в случае повторных высевов нетуберкулезных микобактерий. Практическое значение состоит в том, что для выделения MABSc необходимо проведение пролонгированного культивирования первичных посевов клинического материала от пациентов с МВ (Патенты РФ No 2668406, Патенты РФ No 2711957). Для проведения длительной инкубации в течение 28 суток необходимо использование специальной лабораторной посуды (Патент РФ No 173302, Патент РФ No 175134, Патент РФ No 175863). Для повышения качества идентификации представителей MABSc необходимо использовать дополнительные инструменты, которые позволяют получать необходимое количество колоний для идентификации методом MALDI-ToF масс- спектрометрии (Патент РФ No 187404, Патент РФ No 187421). Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской деятельности кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии; детских инфекций; фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Результаты диссертационной работы используются в практической деятельности микробиологического отдела клинико-диагностической лаборатории КДЛ Клиник ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самарского областного центра по лечению муковисцидоза, расположенного на базе инфекционного отделения государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Самарская областная детская клиническая больница им. Н.Н. Ивановой» Министерства здравоохранения Самарской области, бактериологической лаборатории государственного бюджетного учреждения здравоохранения Самарской области «Тольяттинская городская клиническая больница No 5».

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Публикации автора в научных журналах

Железо как эссенциальный фактор роста микобактерий

А.В. Лямин, А.В.Халиулин, Д.Д. Исматуллин, А.В. Козлов, О.А. Балдина // Известия Самарского научногоцентра Российской академии наук. – 2– Т. – №5(2). – С. 320

✍️ Журнал

ИЗВЕСТИЯ САМАРСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Нетуберкулезные микобактерии: современные возможности видовой идентификации

А.В. Лямин, А.М Ковалев, А.В. Жестков, О.В. Кондратенко, Д.Д.Исматуллин // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2– Т.

👀 Область наук

✍️ Журнал

КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ

#RSCI

#Scopus

#ВАК РФ

#РИНЦ

Микобактериозы у пациентов с муковисцидозом: причина или следствие микроэкологических изменений в бронхолегочной системе

А.В. Козлов, А.В. Лямин, О.В.Кондратенко, О.А. Гусякова, А.В. Жестков, Д.Д. Исматуллин, А.В. Халиулин //Астраханский медицинский журнал. – 2– №– С. 57

👀 Область наук

✍️ Журнал

АСТРАХАНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ

#ВАК РФ

#РИНЦ

Обзор международных клинических рекомендаций по терапии инфекций легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями

А.В. Жестков, А.В. Лямин, Д.Д.Исматуллин Жестков А.В., Мартинович А.А., Хайкина Е.В. // Клиническая микробиологияи антимикробная химиотерапия. – 2– Т. – №– С. 66

👀 Область наук

✍️ Журнал

КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ

#RSCI

#Scopus

#ВАК РФ

#РИНЦ

Идентификация нетуберкулезных микобактерий, выделенных из клинического материала методом MALDI-ToF масс-спектрометрии

Д.Д. Исматуллин, А.В.Лямин, А.В. Жестков, А.М. Ковалев, Л.А. Барышникова, Т.П. Персиянцева// Проблемымедицинской микологии. – 2– Т.- №– Тезисы докладов Всероссийской научно-практическойконференциипомедицинскоймикробиологии,эпидемиологиииклинической микологии (XX Кашкинские чтения). – СПб. – С.

👀 Область наук

✍️ Журнал

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ

#ВАК РФ

#РИНЦ

Лабораторная диагностика микобактериозов

А.В. Лямин, А.В. Жестков,Д.Д. Исматуллин, А.М. Ковалев // Вестник современной клинической медицины. – 2–Т. – № – С. 29

👀 Область наук

✍️ Журнал

ВЕСТНИК СОВРЕМЕННОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

#Scopus

#ВАК РФ

#РИНЦ

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Здравствуйте! Опыт написания работ более 12 лет. За это время были успешно защищены более 2 500 написанных мною магистерских диссертаций, дипломов, курсовых работ. Явл... Читать все

Здравствуйте! Опыт написания работ более 12 лет. За это время были успешно защищены более 2 500 написанных мною магистерских диссертаций, дипломов, курсовых работ. Являюсь действующим преподавателем одного из ВУЗов.

#Кандидатские #Магистерские

177 Выполненных работ

Выполняю различные работы на заказ с 2014 года. В основном, курсовые проекты, дипломные и выпускные квалификационные работы бакалавриата, специалитета. Имею опыт напис... Читать все

Выполняю различные работы на заказ с 2014 года. В основном, курсовые проекты, дипломные и выпускные квалификационные работы бакалавриата, специалитета. Имею опыт написания магистерских диссертаций. Направление - связь, телекоммуникации, информационная безопасность, информационные технологии, экономика. Пишу научные статьи уровня ВАК и РИНЦ. Работаю техническим директором интернет-провайдера, имею опыт работы ведущим сотрудником отдела информационной безопасности филиала одного из крупнейших банков. Образование - высшее профессиональное (в 2006 году окончил военную Академию связи в г. Санкт-Петербурге), послевузовское профессиональное (в 2018 году окончил аспирантуру Уральского федерального университета). Защитил диссертацию на соискание степени "кандидат технических наук" в 2020 году. В качестве хобби преподаю. Дисциплины - сети ЭВМ и телекоммуникации, информационная безопасность объектов критической информационной инфраструктуры.

#Кандидатские #Магистерские

33 Выполненных работы

Работаю в сфере метрологического обеспечения. Защищаю кандидатскую диссертацию. Основной профиль: Метрология, стандартизация и сертификация. Оптико-электронное прибост... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

10 Выполненных работ

Преподаватель одного из лучших ВУЗов страны, научный работник, редактор научного журнала, общественный деятель. Пишу все виды работ - от эссе до докторской диссертации... Читать все

Преподаватель одного из лучших ВУЗов страны, научный работник, редактор научного журнала, общественный деятель. Пишу все виды работ - от эссе до докторской диссертации. Опыт работы 7 лет. Всегда на связи и готова прийти на помощь. Вместе удовлетворим самого требовательного научного руководителя. Возможно полное сопровождение: от статуса студента до получения научной степени.

#Кандидатские #Магистерские

47 Выполненных работ

Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на напис... Читать все

Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на написании курсовых и дипломных работ, а также диссертационных исследований.

#Кандидатские #Магистерские

158 Выполненных работ

Большой опыт работы. Кандидаты химических, биологических, технических, экономических, юридических, философских наук. Участие в НИОКР, Только актуальная литература (пос... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

551 Выполненная работа

Наличие красного диплома УрГЮУ по специальности юрист. Опыт работы в профессии - сфера банкротства. Уровень выполняемых работ - до магистерских диссертаций. Написан... Читать все

Наличие красного диплома УрГЮУ по специальности юрист. Опыт работы в профессии - сфера банкротства. Уровень выполняемых работ - до магистерских диссертаций. Написание письменных работ для меня в удовольствие.Всегда качественно.

#Кандидатские #Магистерские

60 Выполненных работ

Кандидат технических наук. Специализируюсь на выполнении работ по метрологии и стандартизации

#Кандидатские #Магистерские

836 Выполненных работ

Опыт в написании студенческих работ (дипломные работы, магистерские диссертации, повышение уникальности текста, курсовые работы, научные статьи и т.д.) по экономическо... Читать все

Опыт в написании студенческих работ (дипломные работы, магистерские диссертации, повышение уникальности текста, курсовые работы, научные статьи и т.д.) по экономическому и гуманитарному направлениях свыше 8 лет на различных площадках.

#Кандидатские #Магистерские

224 Выполненных работы