Сенсорные факторы развития нервной системы у крыс с генетической предрасположенностью к абсансным приступам

Исследование выполнено на самцах крыс линии WAG/Rij (n=63), выращенных и содержавшихся в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (Москва, Россия).
Ограничение сенсорного притока в раннем онтогенезе. Крысы были разделены на четыре группы: две экспериментальные и две контрольные. Экспериментальные группы были подвергнуты ежедневному двустороннему состриганию вибрисс. Состригание проводилось в течение ПД1-8 в первой экспериментальной группе и в течение ПД9-16 во второй экспериментальной группе. В контрольных группах животные в те же периоды были подвергнуты процедуре имитации состригания вибрисс, в течение которой тупой стороной ножниц прикасались к зоне вибрисс.
Исследование динамики формирования опорных точек развития (ОТР). В течение ПД12-19 мы наблюдали за свободным поведением животных в открытом поле в течение 3 минут. Экспериментатор оценивал достижение той или иной ОТР с опорой на комплексные критерии, созданные на основании работ лаборатории Нейроонтогенеза и литературных данных. Были исследованы следующие ОТР: открытие глаз; ходьба; аутогруминг; вертикальная активность; манипуляторная активность передних конечностей.
Исследование исследовательской активности и тревожности было проведено в методиках «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) в возрасте 2 месяцев и «Открытое поле» (ОП) в возрасте 2.5 месяцев.
Исследование обучения в методике «ИнтеллиКейдж». «ИнтеллиКейдж» является автоматизированной системой оценки поведения и обучения животных. Обучение реализуется путем питьевого подкрепления определённых последовательностей действий внутри оперантных отсеков. Крыс в возрасте 4.5 месяцев помещали в установку «ИнтеллиКейдж» и содержали небольшими группами (по 3 или 4 животных) в течение 8 дней, и в течение этого периода они обучались получать доступ к питьевой воде, совершая тычки носом в специальной области внутри оперантных углов. Было выделено четыре поведенческие последовательности («Успешная», «Импульсивная», «Исследующая», «Проверяющая»), состоящих из следующих действий: заход,
тычок носом, питье и выход. В данной методике участвовали только крысы, подвергнутые состриганию вибрисс и имитации в период ПД9-ПД16.
Методика выработки условной реакции двустороннего избегания (УРДИ). Тест УРДИ проводился в челночной камере, которая состояла из двух отсеков с аркой между ними. Во время тестирования крысы обучались избегать электрического тока (0,5 мА, безусловный стимул), который следовал за предъявлением звукового тона (70 дБ, 5 с, условный стимул), перемещаясь в соседний (безопасный) отсек. Нами был установлен следующий критерий обучения: при выполнении 5 избеганий в 6 последовательных попытках животное считалось обучившимся и тестирования прекращалось.
Регистрация ЭЭГ проводилась в 5 и 7 месяцев. В возрасте 4.5 м каждому животному были вживлены винтовые электроды для регистрации ЭЭГ (два симметричных электрода над фронтальной областью, электрод над левой затылочной областью, референтный электрод над мозжечком). Регистрацию ЭЭГ проводили у свободно движущихся крыс минимум через 10 дней после операции. Минимальная продолжительность записи ЭЭГ составляла 20.6 ч, максимальная – 25.1 ч. Записи оцифровывались с частотой 400 Гц.
Автоматическое обнаружение пик-волновых разрядов (ПВР). ПВР определялись автоматически по активности правого фронтального отведения с использованием специального программного обеспечения. Алгоритм обнаружения использовал непрерывное вейвлетное преобразование. Результаты автоматического обнаружения были проверены экспертом и при необходимости скорректированы. На Рис. 1 изображён типичный зрелый ПВР и принцип автоматизированного обнаружения данной формы эпилептической активности.
Рисунок 1. Пример ПВР и принцип его обнаружения.
Статистика. Статистические методы были использованы в соответствии с характеристиками распределения данных и дисперсий сравниваемых групп. Тест Стьюдента использовался при сравнении групп с нормальным распределением и равными дисперсиями, при неравенстве дисперсией использовался тест Уэлча. При сравнении эффектов взаимодействия факторов использовался многофакторный анализ ANOVA c корректировкой Бонферрони при наличии множественных сравнений. При наличии нескольких замеров одного и того же параметра взаимодействие эффектов замера и экспериментальных факторов было проанализировано с помощью анализа ANOVA для повторных измерений. Корреляции Спирмена или Пирсона были вычислены в зависимости от характера распределения данных.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование влияния ограничения сенсорного притока от вибрисс в раннем онтогенезе на характеристики пик-волновых разрядов у взрослых животных.
Нами было выявлено, что 30.1% крыс линии WAG/Rij в виварии ИВНДиНФ РАН не демонстрирует выраженных ПВР во взрослом возрасте (бессимптомный фенотип). Сравнение количества животных в группах, подвергнутых состриганию вибрисс и имитации, не выявило значимых различий в соотношении симптомных и бессимптомных животных (Рис. 2). Обнаруженное нами отсутствие влияния ограничения сенсорного притока в раннем онтогенезе на наличие симптомного фенотипа свидетельствует в пользу генетической природы обнаруженного расщепления популяции на два фенотипа.
Нами было обнаружено, что состригание вибрисс влияло на динамку созревания ПВР у симптомных животных, приводя к отсутствию увеличения средней суммарной продолжительности ПВР в час у крыс, подвергнутых состриганию вибрисс, с пяти до семи месяцев, в то время, как у животных, подвергнутых имитации состригания, было обнаружено выраженное увеличение данного параметра (Рис. 2Б).
В возрасте 5 месяцев мы обнаружили значимый эффект фактора «период» на среднюю продолжительность ПВР в час; значимый эффект фактора «состригание» на среднее количество ПВР в час (Рис. 2В); значимый эффект
фактора «период» на среднюю длительность одного ПВР (Рис. 2Г). В возрасте 7 месяцев ни один из факторов не оказывал значимых эффектов на параметры пик- волновой активности. Попарное пост-хок сравнение исследованных групп с поправкой Бонферрони не обнаружило различий между группами ни по одному из параметров, что говорит об отсутствии специфичных для периода состригания эффектов исследованного воздействия. Согласно гипотезе, выдвинутой Лютйохан и ван Люйтелааром, за количеством ПВР и их средней длительностью лежат различные нейронные механизмы: количество ПВР определяется возбудимостью коры, средняя длительность разряда – вовлечением ретикулярного ядра таламуса (Lüttjohann and van Luijtelaar, 2015). Увеличение количества ПВР у крыс, повергнутых состриганию вибрисс, может быть объяснено влиянием данного воздействия на генетически предопределенный очаг в соматосенсорной коре. Различия в длительности ПВР у крыс, подвергнутым воздействиям (независимо от их типа) в течение ПД1-8 или ПД9-16 может быть объяснено менее специфичным эффектом на формирование мозга отлучением от кормящей матери.
Более выраженная эпилептическая активность в возрасте 5 месяцев и отсутствие дальнейшего ее развития у крыс, подвернутых состриганию вибрисс, может свидетельствовать о том, что генотип, определяющий наличие эпилептического фенотипа, также задает «потолок» развития ПВР, максимальную степень их развития, достижение которого происходит раньше при увеличении возбудимости соматосенсорной коры в результате неонатальной сенсорной депривации.
Рисунок 2. Влияние экспериментальных процедур на параметры ПВР. А. Соотношение животных с симптомным и бессимптомным фенотипами в разных экспериментальных группах. Б. Динамика средней продолжительности ПВР в 5 и 7 месяцев. В. Количество ПВР в 5 месяцев. Г. Средняя длительность одного ПВР в 5 месяцев. «*» обозначает статистически значимые различия между крысами, подвергнутыми имитации состригания в возрасте 5 и 7 месяцев. Буква «П» обозначает статичестически значимый эффект фактора «период». Буква «С» обозначает статистически значимый эффект фактора «состригание» (p<0.05). 3.2. Исследование влияния ограничения сенсорного притока от вибрисс на раннее развитие поведения. Мы проанализировали, как воздействия в раннем онтогенезе влияют на разницу между сроками формирования данных ОТР и обнаружили, что у группы, повергнутой состриганию вибрисс с ПД9 по ПД16, появление зрелой ходьбы и открытие глаз происходило в один день, в то время, как состригание в первый период увеличивало количество дней между сроками их формирования (Рис. 3А). можно предположить, что именно в этот период негативные воздействия на вибротактильную систему могут вызвать компенсаторную перестройку связей между зрительным анализатором и моторными функциями. Недостаток сенсорного притока может быть компенсирован быстрым созреванием других незрелых сенсорных входов, то есть «актуализацией». Известно, что крысы, лишенные вибрисс, начинают более эффективно использовать визуальные сигналы (Schiffman et al., 1970). Также мы проанализировали, будут ли воздействия в раннем онтогенезе влиять на связи между общим физическим созреванием крысят и формированием ОТР. Нами было обнаружено, что состригание вибрисс во второй период приводило к уменьшению количества связей между сроками формирования ОТР и массой тела (1 корреляция) по сравнению с другими воздействиями (рис.3Б). При нормальном развитии общее физическое развитие связано с ОТР. Так дети, которые быстрее набирают вес, раньше начинают улыбаться, сидеть и ходить (Flensborg-Madsen and Mortensen, 2017), а у свинохвостых макак низкий вес при рождении является надежным предиктором задержки в развитии (Kroeker et al., 2007). Вероятно, ограничение сенсорного притока в период, когда крысята начинают активно использовать вибриссы при реализации моторных актов, ведет к реорганизации поведения, запуская механизмы, компенсирующие отсутствие необходимой афферентации, что может изменять связи между поведением и соматическим ростом. Рисунок 3. Влияние состригания вибрисс на ранее развитие. А. Число дней между сроками созревания ходьбы и открытия глаз. «*» обозначает статистически значимое различие между группами (p<0.05). Б. Корреляции между массой тела и сроками созревания ОТР. Сплошные линии отражают статистически значимые корреляции (p<0.05), пунктирные – незначимые. 3.3. Исследование влияния эпилептического фенотипа и ограничения сенсорного притока в раннем онтогенезе на тревожность Симптомные крысы меньше времени проводили в закрытых рукавах ПКЛ и двигались в них с большей средней скоростью, проводили больше времени в открытых рукавах и больше времени в центре ПКЛ, а также больше заходили в центр ОП в течение первых 5 минут и проводили в нем больше времени в течение вторых 5 минут (таблица 1). ФЕНОТИП ПРИПОДНЯТЫЙ КРЕСТООБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ ЗОНА Параметр Симптомный (n=34) Бессимптомный (n=14) Время 177.4±6.5 * 221.1±6.8 ЗАКРЫТЫЕ РУКАВА Заходы Средняя скорость Время Заходы Средняя скорость 12.4±0.6 4.5±0.1 * 40.6±5.5 * 17.3±0.8 2.5±0.1 ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ 12.4±1.3 3.7±0.2 19.3±2.9 15±1.2 2.6±0.1 1.9±0.5 ОТКРЫТЫЕ РУКАВА Заходы 5.5±0.6 3.5±0.6 Средняя скорость 3±0.2 3±0.3 Время 76.8±3.3 * 59.5±5.1 ЦЕНТР ЦЕНТР Заходы (0-5 мин) 3.5±0.4 * Время (5-10 мин) 9.2±1.3 * 4.4±1.4 Таблица 1. Влияние эпилептического фенотипа на поведенческие параметры в методиках «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Открытое поле». «*» обозначает значимые различия между фенотипами (p<0.05). Результаты нашего исследования свидетельствуют об увеличении исследования потенциально опасных зон (открытых рукавов ПКЛ и центральной зоны ОП) у симптомных самцов линии WAG/Rij по сравнению с бессимптомными. Одной из возможных интерпретаций данного результаты является наличие низкого уровня тревожности у симптомных крыс. Ранее было показано, что крысы линии WAG/Rij не отличаются по уровню тревожности от крыс линии Wistar в возрасте 6 месяцев (Sarkisova and Kulikov, 2006). Поскольку тестирование в методиках ПКЛ и ОП в рамках нашей работы было проведено в возрасте 2 и 2.5 месяцев, можно предположить, что до появления ПВР крысы линии WAG/Rij имеют сниженную тревожность, которая вместе с развитием ПВР повышается до уровня контрольной линии крыс. 3.4. Исследование влияния эпилептического фенотипа и ограничения сенсорного притока от вибрисс в раннем онтогенезе на обучение 3.4.1. Исследование обучения в экспериментальной парадигме, направленной на оценку импульсивности, в установке «ИнтеллиКейдж» В нашем исследовании мы определили четыре поведенческих последовательности у крыс WAG/Rij, которые составляли около 95% от всех зарегистрированных в ходе эксперимента: «Успешная», «Исследующая», «Проверяющая», «Импульсивная». Процент посещений, сопровождаемых «Успешной» последовательностью, увеличивался у всех крыс в течение эксперимента, что говорит об усвоении экспериментальной задачи и обучении (Рис. 4А). Нами было обнаружено, что животные с симптомным фенотипом показали более высокий процент посещений, сопровождаемых «Импульсивной» поведенческой последовательностью в ночную фазу восьмого дня эксперимента Различия между симптомным и бессимптомным фенотипом также проявились при переходе с ночной фазы шестого дня к дневной фазе седьмого дня, когда только бессимптомные крысы показали статистически значимое уменьшение процента «Импульсивной» поведенческой последовательности (Рис. 4Б). Ограничение сенсорного притока от вибрисс в раннем онтогенезе повлияло на исследовательское поведение в установке «ИнтеллиКейдж». Попарный t-тест выявил статически значимые отличия между крысами, повергнутыми состриганию вибрисс, и крысами, подвергнутыми имитации состригания, в проценте посещений, сопровождаемых «Исследующей» последовательностью в ночную фазу первого дня, ночную фазу второго дня и дневную фазу четвертого дня, то есть в первой половине эксперимента (Рис. 4В). Можно предположить, что невозможность использовать вибриссы в период созревания вибротактильной системы, когда они начинают участвовать в поведении, привела к меньшей опоре на данный сенсорный вход при исследовании пространства во взрослом возрасте. Данная интерпретация согласуется с литературными данными, указывающими на то, что ограничение сенсорного притока от вибрисс в чувствительный период созревания вибротактильной системы влияет на поведенческую стратегию, но не на общую эффективность выполнения задачи у взрослых животных (Kurzina et al., 2017; Papaioannou et al., 2013). Рисунок 4. Динамика поведенческих последовательностей. А. Динамика успешной последовательности у всех животных. Б. Динамика импульсивной последовательности у животных с разным эпилептическим фенотипом. В. Динамика исследующей последовательности у животных, подвергнутым состриганию вибрисс или имитации в течение ПД9-16. «*» обозначает различия между группами. «#» обозначает различие между последовательными фазами (p<0.05). 3.4.2. Исследование обучения в методике выработки условного рефлекса двустороннего избегания Нами было проанализировано три параметра, отражающие различные этапы обучения в методике УРДИ. Номер попытки достижения критерия является стандартным параметром, отражающим формирование устойчивой реакции избегания. Номер попытки первого избегания свидетельствует об обнаружении связи между условным и безусловным стимулами. Количество попыток до достижения критерия является признаком того, как быстро животное формирует устойчивую реакцию избегания после обнаружения связи между стимулами. Нами было обнаружено, что симптомные животные позже достигали критерия обучения за счет более позднего первого избегания, причем количество попыток от первого избегания до достижения критерия не отличалось между симптомными и бессимптомными животными (табл. 2) Нами было обнаружено, что крысы линии WAG/Rij, имеющие выраженные ПВР, позже формируют устойчивую реакцию избегания в результате более медленного обнаружения связи между условным и безусловным стимулами. Вероятно, что данный результат связан с нарушением управляющих функций, обеспечивающих выявление значимых параметров окружающей среды. Данное предположение согласуется с исследованиями на пациентах, имеющих абсансные приступы, в которых было показано, что дефицит управляющих функций наблюдается при выраженных ПВР (D’Agati et al., 2012; Vega et al., 2010; Wald et al., 2019). 15.7±1.2 12.4±2.1 Таблица 2. Влияние эпилептического фенотипа на параметры обучения. «*» обозначает статистически значимые различия между фенотипами (p<0.05) Параметр Симптомный Бессимптомный фенотип (n=43) фенотип (n=15) Номер попытки достижения критерия 26.0±1.2 * 19.8±2.0 Количество попыток от первого избегания до достижения критерия Номер попытки первого избегания 11.1±1.1 * 7.7±2.0 Крысы, подвергнутые воздействию в первый период (независимо от типа воздействия) позже достигали критерия обучения за счет большего количества попыток между первым избеганием и достижением критерия рис. 5Б). Предполагается, что сниженная способность к обучению реакции избегания у крыс, подвергнутых раннему хэндлингу, может быть связана со сниженной эмоциональной реактивностью, вызванной уменьшением активации гипоталамо- гипофизарно-надпочечниковой оси (Plotsky and Meaney, 1993) и увеличением экспрессии рецепторов ГАМКа в миндалине (Caldji et al., 2000). Рисунок 5. Влияние периода воздействия на параметры усвоения условной реакции двустороннего избегания. А. Номер попытки достижения критерия. Б. Количество попыток между первым избеганием и достижением критерия. В. Номер попытки первого избегания. Буква «П» обозначает статистически значимый эффект фактора «период» (p<0.05). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Крысы линии WAG/Rij генетически предрасположены к развитию пик- волновой активности, в поведении сопровождаемой замираниями, что соответствует клинической картине абсансных приступов у человека, обнаруживаемых при генерализованных формах эпилепсии и иных неврологических заболеваниях. Нами было обнаружено, что 30.1% крыс линии WAG/Rij не демонстрирует выраженных ПВР, при этом ограничение сенсорного притока от вибрисс в раннем онтогенезе не влияло на соотношение животных с симптомным и бессимптомным фенотипом. Состригание вибрисс вне зависимости от периода состригания вибрисс увеличивало количество ПВР у симптомных животных, а воздействия в период появления вибротактильных движений (ПД9- 16) вне зависимости от типа воздействия увеличивали длительность разрядов, что свидетельствует о различных механизмах, определяющих данные характеристики ПВР. Сравнение крыс с симптомным и бессимптомным фенотипами позволило нам обнаружить поведенческие особенности животных, имеющих выраженные ПВР. Крысы с симптомным фенотипом демонстрировали сниженную тревожность, что проявилось в большем времени, проведенном в «опасных» зонах методик «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Открытое поле», а также сниженную способность к обучению в методиках «ИнтеллиКейдж» и УРДИ, связанную с нарушениями внимания. Обнаруженные особенности обучения соответствует данным о когнитивных нарушениях у пациентов, имеющих абсансные приступы. Ограничение сенсорного притока от вибрисс в раннем онтогенезе влияло на поведение животных, причем нами были обнаружены как специфичные для каждого из сензитивных периодов эффекты, так и вызванные самой процедурой состригания без влияния периода. Сближение сроков созревания ходьбы и открытия глаз у крыс, подвергнутых состриганию вибрисс с ПД9 по ПД16, вероятно, отражает реорганизацию функциональной системы, обеспечивающей ходьбу, с большей опорой на зрительную информацию. Кратковременные отлучения от матери, сопровождавшие экспериментальные процедуры, в период с ПД1 по ПД8 вели к более медленному усвоению реакции избегания по сравнению с отлучениями с ПД9 по ПД16. ВЫВОДЫ 1. Ограничение сенсорного притока у крыс линии WAG/Rij в раннем онтогенезе ведет к усилению пик-волновой активности в возрасте 5 месяцев и, вероятно, ведет к ее более раннему созреванию по сравнению с имитацией состригания. 2. Сензитивные периоды созревания вибротактильной системы не являются специфичными для развития пик-волновой активности. 3. Характеристики пик-волновой активности в период созревания чувствительны к различным параметрам воздействий в раннем онтогенезе. Ограничение сенсорного притока от вибрисс ведет к увеличению числа пик- волновых разрядов, а период воздействия вне зависимости от типа влияет на среднюю длительность разрядов. 4. Ограничение сенсорного притока от вибрисс с первого по восьмой и с девятого по шестнадцатый день разнонаправленно влияет на сроки открытия глаз. Состригание вибрисс во второй период ведет к сближению сроков открытия глаз и формирования ходьбы и исчезновению связи между сроками созревания опорных точек развития и набором массы тела. 5. Крысы линии WAG/Rij с симптомным фенотипом демонстрируют изменения исследовательского поведения, указывающие на сниженный уровень тревожности, в период, предшествующий развитию пик-волновых разрядов. 6. Крысы линии WAG/Rij с симптомным фенотипом демонстрируют сниженную способность к обучению, вызванную нарушением внимания. 7. Воздействия с первого по восьмой постнатальный день вне зависимости от типа ведут к более медленному формированию условной реакции избегания по сравнению с воздействиями с девятого по шестнадцатый день.