Сульфатредуцирующие и нефтеокисляющие бактерии донных отложений северной части Японского моря
Введение ……………………………………………………………………………………………………….. 5
Обзор литературы ………………………………………………………………………………………… 12
Глава 1. Микробное разнообразие в донных отложениях морей и в местах нефте-
и газопроявлений …………………………………………………………………………………………. 12
1.1. Биоразнообразие микробных сообществ в морских донных отложениях….. 12
1.2. Биоразнообразие микробных сообществ нефтяных месторождений морей…. 13
1.3. Биоразнообразие микробных сообществ газогидратных залежей и зон
выходов флюидов в донных отложениях морей ……………………………………………… 16
1.4. Анаэробное окисление углеводородов. Роль сульфатредуцирующих бактерий
в морских экосистемах …………………………………………………………………………………. 19
1.5. Биоразнообразие микробных сообществ донных отложений морей Дальнего
Востока (Берингово, Охотское, Японское) и Японского моря в частности ……….. 21
Глава 2. Объекты исследования, материалы и методы …………………………………….. 26
2.1 Район исследования ………………………………………………………………………………… 26
2.1.1. Геолого-гидрогеохимическая характеристика северной части Японского
моря …………………………………………………………………………………………………………….. 26
2.1.2. Газогеохимические исследования донных отложений исследуемого района
(по отчетам экспедиций ТОИ ДВО РАН) ……………………………………………………….. 28
2.2. Материалы исследования ……………………………………………………………………….. 35
2.3. Методы исследования …………………………………………………………………………….. 37
2.3.1. Молекулярно-генетические методы ………………………………………………………. 37
2.3.1.1. Определение наличия функциональных генов методом вложенной ПЦР в
пробах донных отложений. Выделение суммарной ДНК из проб донных
отложений……………………………………………………………………………………………………. 37
2.3.1.2. Выделение хромосомной ДНК …………………………………………………………… 39
2.3.1.3. Высокопроизводительное секвенирование участка гена 16S рРНК……….. 39
2.3.1.4. Определение геномных последовательностей……………………………………… 40
2.3.1.5. Определение спектра плазмид ……………………………………………………………. 40
2.3.2. Микробиологические методы ……………………………………………………………….. 41
2.3.2.1. Приготовление питательных сред для культивирования ………………………. 41
2.3.2.2. Определение физиолого-биохимических свойств штаммов………………….. 42
2.3.2.3. Культивирование Desulfosporosinus sp. nov. ………………………………………… 44
2.3.2.4. Изучение субстратной специфичности Desulfosporosinus sp. nov. …………. 44
2.3.3. Химические методы …………………………………………………………………………….. 45
2.3.3.1. Определение степени биодеградации углеводородов флуориметрическим
и хромато-масс-спектрометрическим методами ……………………………………………… 45
2.3.3.2. Определение концентрации сероводорода ………………………………………….. 47
2.3.3.3. Определение сульфат-ионов в донных отложениях ……………………………… 47
2.3.3.4. Определение метиловых эфиров жирных кислот…………………………………. 49
2.3.3.5. Определение ионов двухвалентного железа ………………………………………… 49
2.3.3.6. Анализ дыхательных хинонов ……………………………………………………………. 49
2.3.3.7. Методика определения нитритов с реактивом Грисса ………………………….. 50
2.3.4. Микроскопические методы…………………………………………………………………… 50
2.3.5. Филогенетический анализ…………………………………………………………………….. 51
2.3.6. Статистическая обработка данных ………………………………………………………… 53
Глава 3. Результаты и обсуждение …………………………………………………………………. 54
3.1. Распределение функциональных биоиндикаторных генов аэробной и
анаэробной биодеградации углеводородов нефти в донных отложениях северной
части Японского моря …………………………………………………………………………………… 54
3.2. Таксономическое разнообразие и физиологические свойства
углеводородокисляющих бактерий, выделенных из верхней части окисленного
слоя донных отложений в районах присутствия и отсутствия газогидратов в
северной части Японского моря. ……………………………………………………………………. 56
3.2.1. Физиологические и биохимические свойства нефтеокисляющих штаммов,
выделенных из донных отложений северной части Японского моря. ……………….. 62
3.2.2. Обнаружение функциональных генов аэробной и анаэробной деградации
углеводородов в нефтеокисляющих штаммах, выделенных из донных отложений
северной части Японского моря …………………………………………………………………….. 67
3.3. Углеводородокисляющая активность бактерий, выделенных из верхней части
донных отложений северной части Японского моря ……………………………………….. 68
3.3.1. Особенности деструкции углеводородов выделенными штаммами в
аэробных и анаэробных условиях ………………………………………………………………….. 70
Глава 4. Выделение углеводородокисляющих сульфатредуцирующих бактерий из
донных отложений северной части Японского моря. Новый вид Desulfosporosinus
sp.nov. SRJS8 ……………………………………………………………………………………………….. 74
4.1. Выделение нового вида сульфатредуцирующей бактерии рода
Desulfosporosinus ………………………………………………………………………………………….. 74
4.2. Геносистематические характеристики штамма …………………………………………. 76
4.3. Морфология штамма Desulfosporosinus sp.nov.SRJS8 ……………………………….. 77
4.4. Особенности роста при различной температуре, солености и рН……………….. 78
4.5. Рост культур на различных субстратах …………………………………………………….. 78
4.6. Липидный анализ …………………………………………………………………………………… 80
4.7. Содержание менахинонов……………………………………………………………………….. 81
4.8. Оценка способности к биодеградации углеводородов Desulfosporosinus sp.
nov. SRJS8 ……………………………………………………………………………………………………. 82
Заключение ………………………………………………………………………………………………….. 84
Выводы ……………………………………………………………………………………………………….. 88
Список литературы ………………………………………………………………………………………. 90
Приложение 1 …………………………………………………………………………………………….. 105
Приложение 2 …………………………………………………………………………………………….. 106
Приложение 3 …………………………………………………………………………………………….. 136
Приложение 4 …………………………………………………………………………………………….. 137
Приложение 5 …………………………………………………………………………………………….. 138
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Район и объекты исследования
Район исследований расположен в северной части Японского моря и включает в себя
два полигона. Первый характеризуется наличием
газогидратов в пределах юго-западного склона о.
Сахалин и второй расположен ближе к Центральной
котловинеЯпонскогоморя(районсеверного
замыкания Центральной котловины). В этой части
отмечены аномально высокие концентрации метана в
газосодержащих слоях шельфовых районов (рис. 1).
Севернаячасть Японскогоморя,включающая
южную часть Татарского пролива, находится в
районетрансформногосочленениянастыке
тектонических литосферных плит – Амурской и
Охотской. По границам плит проходят региональные
зоны глубинных разломов, образуются впадины с
накоплением мощной толщи осадков, в которыхРисунок 1. Карта расположения станций и
образовались нефтегазовые залежи (Обжиров и др., распределения содержания метана в донных
отложениях северной части Японского моря.
2019).Условное разделение районов исследования:
В работе использовали верхнюю часть 1- газогидратный район; 2 – негазогидратный
район.
восстановленного слоя донных отложений северной части Японского моря, отобранную на
глубине 5-30 см от поверхности дна с 23 станций в ходе двух рейсов: «Академик Опарин», 2017
(OP54); НИС «Академик М.А. Лаврентьев», 2018 (LV81).
Объектами исследования служили накопительные и чистые культуры аэробных и
анаэробных нефтеокисляющих и сульфатредуцирующих бактерий, выделенных из
образцов донных отложений исследуемых районов.
Методы исследования
Выделение суммарной ДНК из образцов донных отложений и хромосомной ДНК
чистых культур проводили модифицированным методом Мармура (Marmur, 1961). При
определении наличия функциональных генов в донных отложениях применяли
вложенную ПЦР для уменьшения числа побочных продуктов реакции (Dtprime-5, ДНК-
Технология). На первом этапе использовали высококонсервативный участок 16S рРНК
бактерийиархейV3-V4(5’–CCTACGGGNGGCWGCAG-3’,3’–
GACTACHVGGGTATCTAATCC – 5’) (Система праймеров Zymo Research). В качестве
второй пары использовали праймеры для биоиндикации аэробной деструкции линейных
углеводородовalkBB(5’–GGTACGGSCAYTTCTACRTCGA-3’;3’–
CGGRTTCGCGTGRTGRT – 5’) (Tourova et al., 2018); анаэробной деструкции линейных
углеводородовmasD(5’–GGHMCVTDBGTVTGGAC-3’;3’–
RTCRTCRTTDCCCCAYTTNGG – 5’) (Gittel et al., 2015), анаэробной деструкции
ароматических углеводородов bssA (5’ – ACGACGGYGGCATTTCTC – 3’, 3’ –
GCATGATSGGYACCGACA – 5’) (Winderl et al., 2007); и сульфатредуцирующих бактерий
dsrB (5’ – CAACATCGTTCATACCCAGGG – 3’, 3’ – GTGTAGCAGTTACCGCA – 5’)
(Корнеева, 2015; Priha et al., 2013).
Секвенирование ДНК нефтеокисляющих штаммов проводилось в компании ООО
«Синтол», г. Москва по методу Сэнгера с использованием набора BigDye v3.1. на
генетическом анализаторе ABI 3130xl (ThermoFisher Scientific). При секвенировании
использовалиуниверсальныебактериальныепраймеры11F(5’-
AGTTTGATCATGGCTCAG – 3’) – 1100R (5’- GGGTTGCGCTCGTTG – 3’) (Seki et al.,
2015). Полученные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК (длина прочтения
800 нуклеотидов) выравнивали в программах Bioedit Version 7.0.4. и ClustalW (Thompson
et al., 1994); наличие химер проверяли в программе Pintal (Ashelford et al., 2005).
Выровненные последовательности сравнивали с хранящимися в мировой базе данных
NCBIданнымисиспользованиемпрограммыBLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Последовательности идентифицировали до вида
илироданауровнесходствабольше98%.Секвенированиеполногогенома
сульфатредуцирующей бактерии проводили в Межинститутском Центре коллективного
пользования «Геном» ИМБ РАН на Illumina NovaSeq. Для анализа генома использовали
технологию:Синтезбиблиотек2*100kitKAPABiosystemsвсоответствиис
рекомендациями производителя. Выделение ДНК осуществлялось колоночным методом с
осаждением на силикагель, используя Fast spin DNA kit производства MP.
Длясозданиянакопительныхкультурнефтеокисляющихмикроорганизмов
использовали морскую аммонийную среду 1313 (Marine ammonium mineral salts), морскую
минеральную среду (Marine salt medium), среду Ворошиловой-Диановой в модификации с
содержанием соли 35‰. Во все среды в качестве источника углерода добавляли 2%
стерильной нефти марки ESPO.
Для создания накопительных культур сульфатредуцирующих микроорганизмов
использовали среды DSMZ: 63 (Desulfovibrio (Postgate) medium) и 195с (Desulfobacter
medium), при анаэробном культивировании в пробирках Хангейта 1-1,5 месяца. Для
получения чистой культуры сульфатредуцирующих бактерий производили рассев на
плотные модифицированные среды 63 и 195c. Чашки инкубировали в анаэростатах,
продутых азотом для удаления кислорода из газовой фазы.
Культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных изолятов
изучали по общепринятым методикам (Лабинская, 2005; Нетрусов, 2005).
Определение спектра плазмид проводили по методу Kado и Liu (1981).
Углеводородокисляющую активность определяли с помощью спектрофлуориметра
«Флюорат-02-Панорама».Уточнениепроцессовутилизацииуглеводородовнефти
проводили на хромато-масс-спектрометре Shimadzu GCMS 2010 Ultra на базе ТОИ ДВО
РАН. Обработка и запись параметров велась в режиме реального времени с
использованием программного обеспечения Weather Link. Степень преобладания молекул
с нечетным числом атомов углерода можно оценить с помощью индекса CPI –
коэффициента нечетности, который представляет собой весовое отношение нечетных
гомологов к четным. Коэффициент нечетности CPI рассчитывали по формуле (Zhanga et
al., 1998).
Образование сероводорода, образованного сульфатредуцирующими бактериями
определяли по методу Cline (1961).
Определениесульфатов-ионоввпробахдонныхотложенийпроводили
комплексонометрическим методом (Аринушкина, 1970).
Анализ жирнокислотного состава клеток проводили на газовом хромато-масс-
спектрометре 7890B+5977B (AgilentTechnologies, USA) в автоматическом режиме на базе
ИБФМ РАН, г. Пущино.
Визуализацию морфологии чистых культур проводили с помощью светового
микроскопа Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия) с фазовым контрастом; а также в
высоком разрешении с использованием сканирующих электронных микроскопов Evo 40 и
SIGMA 300VP (CarlZeissAG, Германия) на базе отделения электронной микроскопии
«Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского» ДВО РАН.
Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей и
построение дендрограмм проводили с использованием пакетов программ MEGAX
(Tamura et al., 2013) и с использованием пакета программ «Robust Phylogenetic analysis»,
представленного на сайте http://www.phylogeny.fr/.
Разнообразие выделенных штаммов определяли посредством расчета индексов:
Шеннона по численности (H) и доминирования Симпсона (C) (Одум, 1986). Для оценки
сходства и отличия таксономического состава по видам в исследуемых районах был
рассчитанкоэффициентЖаккара.Дляотражениясходствиразличиймежду
газогидратным и негазогидратным районами строили диаграмму Венна.
Статистическуюобработкурезультатовпроводилисиспользованием
программного пакета Microsoft Excel 2010 и ArcGIS 10.4 с использованием Geostatistical
Analyst modul, с использованием языка программирования R в IDE RStudio 3.3.1
(https://cran.r-project.org/bin/windows/base/old/3.1.1/). Различия считали достоверными при
уровне значимости p˂0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Распределениефункциональныхбиоиндикаторныхгеноваэробнойи
анаэробной биодеградации углеводородов нефти в донных отложениях северной
части Японского моря. В результате исследований образцов суммарной ДНК из донных
отложений было выявлено, что гены аэробной деструкции линейных углеводородов
(alkBВ) встречаются в пробах донных отложений обоих районов исследования (9
станций).Геныанаэробнойдеструкции,кодирующиеα-субъединицу
бензилсукцинатсинтетазы (bssA), как и гены masD, характерны для обоих районов
исследования, но в газогидратном районе их встречаемость выше.
Таксономическое разнообразие нефтеокисляющих бактерий, выделенных из
донных отложений северной части Японского моря. Из 23 проб восстановленного слоя
донных отложений северной части Японского моря, было создано 69 накопительных
культур. Путем выделения чистых культур была создана рабочая коллекция из 55
штаммов, обладающих способностью к окислению углеводородов.
По результатам секвенирования гена 16S рРНК (рис.2) выделенные бактериальные
культуры принадлежали к филумам: Proteobacteria (Gammaproteobacteria), Firmicutes,
Actinobacteria. Все исследуемые штаммы на основании данных полифазной таксономии
были идентифицированы до рода или вида.
Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа
последовательностей фрагментов гена 16S рРНК бактерий, выделенных из донных
отложений северной части Японского моря. Длина масштабной линейки: 1 замена на 100
нуклеотидов.
В районе газогидратной залежи было выделено 37 штаммов, отнесенных к 9 родам,
а в районе отсутствия газогидратов почти в 2 раза меньше (18, отнесенных к 8 родам).
Индексы разнообразия Шеннона и Симпсона показали, что исследуемые районы
отличаются незначительным микробным разнообразием (Таблица 1). В районе
обнаружения газогидратов преобладают представители рода Pseudomonas, а во втором –
Psychrobacter.
Таблица 1. Значения основных индексов разнообразия в исследуемых районах
северной части Японского моря
Район / индексГазогидратный районНегазогидратный район
Индекс разнообразия Шеннона1,8481,875
Индекс разнообразия Симпсона0,1910,179
При сравнении количества видов газогидратного и негазогидратного районов
коэффициент сходства Жаккара достаточно низкий (0,17), что говорит о большой разнице
в таксономическом составе на уровне видов. Также в районе обнаружения газогидратов
культивируемые нефтеокисляющие бактерии отличались большей долей характерных
только для этого полигона родов и видов, чем в районе с высокими концентрациями
метана.
Наибольшее число общих видов для двух исследованных районов относится к
филумуGammaproteobacteria.ПредставителиродовBacillus,Pseudomonas,
Stenotrophomonas, Psychrobacter встречались в обоих районах исследования.
Представители семейств Nocardiaceae (4 штамма Rhodococcus sp.) и Nocardioidaceae
(1 штамм Nocardioides sp.) встречались только в газогидратном районе.
Физиолого-биохимические свойства нефтеокисляющих штаммов, выделенных
из донных отложений северной части Японского моря. При исследовании физиолого-
биохимических свойств было установлено, что выделенные из района, где газогидраты не
обнаружены бактериальные культуры, потребляют меньшее разнообразие субстратных
источников, чем микроорганизмы, выделенные из района, где отмечено присутствие
газогидратов.
Приоценке корреляции физиолого-биохимическихсвойств исследованных
бактерий с содержанием метана в образцах донных отложений было показано (рис. 3), что
способность к усвоению сахаров не коррелировала с максимальными значениями метана;
также наличие фермента эстеразы слабо или совсем не коррелировало с содержанием
метана.
Но отмечается корреляция между способностью к деструкции карбоновых кислот и
их производных и отсутствием газогидратов (рис. 3 А, Б). Наибольшее число штаммов,
использующих в качестве субстрата лактат и не способных к утилизации пальмиата,
сукцината, оксалата и цитрата, выделены из негазогидратного района.
А
Б
Рисунок 3, А, Б. Графики корплот корреляции способности к утилизации карбоновых кислот
с содержанием метана в донных отложениях. Обозначения: 1 – пальмитиновая кислота, 2 –
щавелевая кислота, 3 – янтарная кислота, 4 – лимонная кислота, 5 – малоновая кислота, 6 –
салициловая кислота, 7 – молочная кислота. Карта с обозначением станций, на которых
выделены нефтеокисляющие штаммы, способные к утилизации лактата. А (1)–
газогидратный район; Б (2) – негазогидратный район
Изучениеплазмидногопрофиляисследованныхштаммовпоказало,что
большинство (49 %) нефтеокисляющих штаммов содержали одну легкую (~ 18 МДа)
плазмиду. В то же время, на трех станциях: ОР54-29 GC, ОР54-41 GC, ОР54-59 GC,
расположенных в районе газогидратных залежей, обнаружены нефтеокисляющие
бактерии, имеющие в клетках по две плазмиды (19 и 30 МДа; 20 и 30 МДа). Плазмиды
молекулярными массами 20 и 30 МДа встречались в штаммах родов Stenotrophomonas,
Bacillus, Psychrobacter.
Обнаружение функциональных генов аэробной и анаэробной деградации
углеводородов в нефтеокисляющих штаммах, выделенных из донных отложений
северной части Японского моря. В 18 из 55 исследованных штаммов были
зафиксированы функциональные гены alkBB и/или bssA, отвечающие за аэробную и
анаэробную биодеградацию углеводородов, соответственно. Наибольшее количество
штаммов с alkBB встречали в газогидратном районе. У двух штаммов – Psychrobacter
piscatorii POI185 и Stenotrophomonas sp. POI LV81-23/149-3(1) в этом же районе было
обнаружено два гена одновременно – alkBB и bssA. Ген bssA кодирует фермент
бензилсукцинатсинтетазу А, который участвует в процессе анаэробного окисления
ароматических углеводородов.
Углеводородокисляющая активность бактерий, выделенных из верхней части
донных отложений северной части Японского моря. Оценку способности к
биодеградацииуглеводородовуисследуемыхштаммовпроводилиспомощью
флуориметрического анализа. Отбирали штаммы, у которых способность к биодеградации
углеводородов за 7 суток ≥ 60%. Из 55 штаммов были отобраны 8: 4 из газогидратного
района (Nesterenkonia lutea POI OP54-19/165, Pseudomonas sp. POI OP54-59/92-1-2,
Nocardioides dokdonensis POI OP54-35/al26-1, Promicromonospora xylanilytica POI OP54-
28/53-1) и 4 из района с аномальным содержанием метана (Micrococcus sp. POI LV81-57/al
379-1, Stenotrophomonas rhizophila POI LV81-28/173-3(3), Robertmurraya (Bacillus)
kyonggiensis POI87, Psychrobacter piscatorii POI185). К уникальным для района выделения
были отнесены N. lutea POI OP54-19/165, N. dokdonensis POI OP54-35/al26-1 (таблица 2).
Таблица2.Показателибиодеструкцииуглеводородовисследуемыми
штаммами в аэробных условиях
Убыль
Степень
углеводородов+⋯+
деструкции
Штаммв % отCPI+⋯+
насыщенных
исходного
УВ
количества*
Сырая нефть (исходные
0.901.239.24
показатели)
Газогидратный район
Nesterenkonia lutea POI OP54-
3.1459.881.273.63
19/165
Pseudomonas sp. POI OP54-
3.0660.101.222.61
59/92-1-2
Nocardioides dokdonensis POI
6.2172.691.132.50
OP54-35/al26-1
Promicromonospora
5.5871.831.222.71
xylanilytica POI OP54-28/53-1
Негазогидратный район
Micrococcus sp. POI LV81-
6.2779.571.233.76
57/al 379-1
Stenotrophomonas rhizophila
5.8373.851.203.71
POI LV81-28/173-3(3)
Robertmurraya (Bacillus)
9.0484.661.169.14
kyonggiensis POI87
Psychrobacter piscatorii
14.4789.830.997.98
POI185
* Данные, полученные с помощью флуориметрического анализа
Наибольшая степень (89,82%) биодеградации углеводородов нефти отмечалась для
P. piscatorii POI185 (выделен в негазогидратном районе). А наименьший показатель
(59,8%) был характерен для N. lutea POI OP54-19/165, изолированного в районе
обнаружения газогидратов.
Степень деструкции насыщенных углеводородов штаммами, рассчитанная по
отношению суммы фитана и пристана к соответствующим алканам, а также суммарная
убыль нефтепродуктов (таблица 2), были ниже для штаммов из газогидратного района по
сравнению с культурами из аномальных газовых полей континентального склона. Для
последних также отмечалось более существенное (от 1,23 до показателей близких к 1)
снижение показателя CPI (степени преобладания углеводородов с нечетным числом
атомов С).
При анализе убыли индивидуальных углеводородов нефти все штаммы,
выделенные в газогидратном районе, практически не были способны к биодеградации
углеводородов с длиной цепи С20 и С21. Убыль таких углеводородов в культуральной
среде составляла от 28,37 до 1,32%. В негазогидратном районе этот же показатель
варьировался от 55,72 до 90,46%.
Способность выделенных культур к биодеградации нефти в аэробных и
анаэробных условиях. Выделенные штаммы культивировали в анаэробных условиях на
среде Ворошиловой-Диановой (соленость 35‰), с содержанием 2% нефти в качестве
единственного источника углерода. Из всех выделенных штаммов способностью к
деградации углеводородов в аэробных и анаэробных условиях обладали 38 штаммов
родов Pseudomonas, Bacillus, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Rhodococcus, Micrococcus,
Robertmurraya, Peribacillus, Promicromonospora. В аэробных и анаэробных условиях
деградация линейных углеводородов нефти происходила по-разному (рис. 4).
Robertmurraya kyonggiensis POI 87Psycrobacter piscatorii POI 185
снижение количества углеводородов в %
снижение количества углеводородов в
9090
8080
7070
6060
% от исходного
от исходного
5050
4040
3030
10
91011121314151617Pr18 Ph 1920210
91011121314151617Pr18 Ph 192021
Длина углеводородной цепи
Длина углеводородной цепи
аэробная средаанаэробная среда
аэробная средаанаэробная среда
АБ
Рисунок 4. Степень биодеградации углеводородов нефти клетками R. kyonggiensis POI87 (А) и P.
piscatorii POI185 (Б) в аэробных и анаэробных условиях
Например, в аэробных условиях культуры Robertmurraya kyonggiensis POI87, как и
Psychrobacter piscatorii POI185, в наибольшей степени окисляли длинноцепочечные (С17-
С21) н-алканы, а также пристан и фитан. В анаэробных условиях, наоборот, интенсивнее
происходило окисление низкомолекулярных (С9-С13) углеводородов, их утилизация составила
более 30%. Увеличение длины цепи приводило к резкому снижению скорости утилизации. В
анаэробных условиях P. piscatorii в наибольшей степени (практически на 100%) окислял н-
нонан.
Выделение углеводородокисляющих сульфатредуцирующих бактерий из донных
отложений северной части Японского моря. Описание штамма Desulfosporosinus sp.
SRJS8 с нефтеокисляющей активностью. Гены – индикаторы сульфатредуцирующих
микроорганизмов (dsrB) зафиксированы в донных отложениях обоих районов исследования, на
станциях, находящихся на континентальном склоне (OP54-20а GC, LV81-30 GC, LV81-31GC).
Для выделения и идентификации углеводородокисляющих сульфатредуцирующих
микроорганизмов были созданы накопительные культуры на анаэробно приготовленных
средах. В накопительных культурах фиксировали образование сероводорода в качестве
индикатора процесса сульфатредукции. По нашим данным у 17% накопительных культур было
зарегистрировано интенсивное образование сероводорода. При этом станции, на которых был
зафиксированданныйпроцесс,располагалисьвдольконтинентальногосклонаи
характеризовались пониженными концентрациями сульфатов в донных отложениях и
присутствием биоиндикаторного гена dsrB.
Для получения чистых культур из накопительных культур, положительных на
образование сероводорода, производили высев на плотные агаризованные среды того же
состава.
Из донных отложений станции OP54-20а GC с глубины 592 метра от поверхности моря
выделена чистая культура сульфатредуцирующих бактерий, по совокупности культурально-
морфологическихифизиолого-биохимическихпризнаковпредварительно
идентифицированная как Desulfosporosinus sp. SRJS8 (рис. 5).
Рисунок 5. Морфология Desulfosporosinus sp. SRJS8; Б – образование эндоспоры
(Сканирующий электронный микроскоп, увеличение 28,5* и 30,9). Длина масштабной
линейки – 200 µm
На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S
рРНК (1628 п.о.) (рис. 6) ближайшим соседом изолята Desulfosporosinus sp. SRJS8 с 98,5%
сходства является D. lacus STP 12T (AJ582757) – бактерия, выделенная из донных отложений оз.
Штехлин, Германия (Ramamoorthy et al., 2006).
SRJS8 (MT740695)
Desulfosporosinus lacus STP12T (AJ582757)
Desulfosporosinus burensis BSREI1T (JF810424)
Desulfosporosinus fructosivorans 63.6FT (KX822015)
Desulfosporosinus hippei 343T (Y11571)
66Desulfosporosinus meridiei S10T (AF076527)
Desulfosporosinus nitroreducens 59.4BT (KX822013)
90Desulfotomaculum auripigmentum OREX-4T (AJ493051)
Desulfosporosinus orientis Singapore IT (CP003108:920262-921897)
Desulfosporosinus youngiae JW/YJL-B18T (DQ117470)
Desulfosporosinus acididurans M1T (EU180237)
84Desulfosporosinus acidophilus SJ4T (FJ951625)
Peptococcus niger ATCC 27731T (AB644260)
0.02
Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных
последовательностей гена 16S рРНК, показывающее положение штамма SRJS8 среди
ближайших гомологов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках.
Дендрограмма построена с использованием метода «neibour-joining». Длина масштабной
линейки: 2 замены на 1000 нуклеотидов. Данные «bootstrap»-анализа (выраженные в
процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления
Полученная нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма SRJS8 была
депонирована в GenBank под номером MT740695.2, а также во Всероссийской коллекции
микроорганизмов (ВКР) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером В-3540.
По данным фенотипического анализа, результатам гомологии гена 16S рРНК и
сравнениягеномных характеристик: данных ДНК-ДНК гибридизации (dDDH) и средней
идентичности нуклеотидов (ANI) выделенный штамм SRJS8 был отнесен к новому виду рода
Desulfosporosinus (Таблица 3) и назван Desulfosporosinus sp. SRJS8.
Таблица3.Степеньсходствагенетическиххарактеристикштамма
Desulfosporosinus sp. SRJS8 с его близкородственным видом Desulfosporosinus lacus
Вид№ штамма в NCBIANI (%)dDDH (%)
Desulfosporosinus sp. SRJS8JAJDOO010000000
Desulfosporosinus lacus STP 12T NZ_FQXJ0100000086,757,4
(DSM 15449T)
Изучение профилей жирных кислот выделенного штамма Desulfosporosinus sp. SRJS8
показало, что доминирующими жирными кислотами являются C16:1, C16:0, iC15:0, C14:0. У
референс-штамма преобладающими жирными кислотами в клетках являются: С16:1cis9, С16:0,
С18:1cis11, С16:1cis7. Различия в жирнокислотном составе липидов штамма SRJS8 с
близкородственнымштаммомDesulfosporosinuslacusможетбытьдоказательством
принадлежности Desulfosporosinus sp. SRJS8 к новому виду.
При оценке способности к деградации углеводородов Desulfosporosinus sp. SRJS8 и
референс-штамма D. lacus STP 12T (DSM 15449T) было выявлено, что оба штамма способны к
окислению углеводородов нефти. При этом отмечено, что SRJS8 обладал более выраженной
способностью к биодеградации нефти в анаэробных условиях по сравнению с референтным
штаммом D. lacus, в большей степени окисляя низкомолекулярные (н-нонан), средне – (С16-С21)
и менее – длинноцепочечные (С28-С31) н-алканы (рис. 7). Менее всего штамм использовал
генэйкозан (˂20% потребления).
Desulfosporosinus sp. SRJS8
Desulfosporosinus lacus STP 12T (DSM 15449T)
Убыль углеводородов % от исходного
70
30
Декан (С10)
Додекан (С12)
Гексадекан (С16)
Генэйкозан (С21)
Пентадекан (С15)
Гептадекан (С17)
Октадекан (С18)
Нонадекан (С19)
Эйкозан (С20)
Тридекан (С13)
Тетрадекан (С14)
Нонан (С9)
Фитан
Ундекан (С11)
Пристан
Р
Рисунок 7. Степень биодеградации углеводородов нефти исследованными штаммами
Desulfosporosinus sp.SRJS8 и D. lacus STP 12T (DSM 15449T)
По данным литературы, (Rueter et al., 1994; Kniemeyer et al., 2007; Widdel et al., 2010)
сульфатредуцирующие бактерии – обитатели естественных нефте – и газопроявлений Мирового
океана, способны к окислению углеводородов нефти (в том числе алканов и ароматических
соединений) в бескислородныхусловиях.В настоящейработе впервые показана
нефтеокисляющая способность представителей рода Desulfosporosinus.
Заключение. В работе проведено сравнение биоразнообразия и физиологических
свойств культивируемой аэробной, факультативно-анаэробной и анаэробной нефтеокисляющей
микробиоты. В результате исследований образцов суммарной ДНК из донных отложений
газогидратного и негазогидратного районов было выявлено, что в районе активных газо-
флюидных потоков над аномальными газовыми полями гены анаэробной деградации
углеводородов встречались чаще, чем в районе, где газогидраты обнаружены не были.
Показано, что в исследованных образцах донных отложений обоих районов
доминируют представители родов Pseudomonas, Psychrobacter и Stenotrophomonas. В
газогидратномрайонепреобладаютпредставителиродаPseudomonas(31%),ав
негазогидратном – Psychrobacter (28%). Представители родов Bacillus, Pseudomonas,
Stenotrophomonas, Psychrobacter встречались в обоих районах исследования. Выявлена
приуроченность представителей семейств Nocardiaceae и Nocardioidaceae к районам
обнаружения газогидратов. Выявлена корреляция между способностью к деструкции
карбоновых кислот и их производных и отсутствием газогидратов. Показано, что гены
аэробнойдеструкциии/илигены,отвечающиезабиодеградациюароматических
углеводородов, встречались у штаммов, выделенных в газогидратном районе. Степень
деструкции насыщенных углеводородов была ниже для штаммов из газогидратного района по
сравнению с культурами, выделенными из района, где газогидраты обнаружены не были. Для
штаммов, выделенных из негазогидратного района, отмечалось более существенное (от
1,23 до показателей близких к 1) снижение показателя CPI.
Впервые для 38 штаммов бактерий родов Stenotrophomonas, Psychrobacter, Micrococcus,
Robertmurraya, Peribacillus, Promicromonospora показана способность окислять углеводороды
нефти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Установлено, что в газогидратном районе
62% уникальных для этого района штаммов обладали способностью к окислению
углеводородов в аэробных и анаэробных условиях. В негазогидратном районе этой
способностью обладало 50% уникальных штаммов. В аэробных и анаэробных условиях
деградация линейных углеводородов нефти происходила по-разному. В аэробных условиях
культуры Robertmurraya kyonggiensis POI87 и Psychrobacter piscatorii POI185 в наибольшей
степени окисляли углеводороды длинноцепочечные (С17 – С21) н-алканы, а также фитан и
пристан.Ванаэробныхусловиях,наоборот,интенсивнеепроисходилоокисление
низкомолекулярных (С9 – С13) углеводородов, их утилизация составила более 30%.
В условиях полного отсутствия кислорода деструкция углеводородов осуществляется
сульфатредуцирующимибактериями.Длявыделенияиидентификации
углеводородокисляющихсульфатредуцирующихмикроорганизмовбылосоздано46
накопительных культур на анаэробно приготовленных средах. Из донных отложений северной
части Японского моря в районе обнаружения газогидратов выделена чистая культура
сульфатредуцирующихбактерийпосовокупностикультурально-морфологическихи
физиолого-биохимических признаков предварительно отнесенная к новому виду рода
Desulfosporosinus. По данным фенотипического анализа, результатам гомологии гена 16S рРНК
и сравнения геномных характеристик: данных ДНК-ДНК гибридизации (dDDH) и средней
идентичности нуклеотидов (ANI) выделенный штамм SRJS8 был отнесен к новому виду и
назван Desulfosporosinus sp. SRJS8.
В нашей работе впервые показана нефтеокисляющая способность представителей рода
Desulfosporosinus. Показано, что Desulfosporosinus sp. SRJS8 обладал более выраженной
способностью к биодеградации нефти в анаэробных условиях по сравнению с референтным
штаммом.
ВЫВОДЫ
1.Оценка встречаемости генов-биоиндикаторов деструкции углеводородов с помощью
«вложенной» (nested) ПЦР в пробах донных отложений показала, что в газогидратном районе
северной части Японского моря преобладали гены анаэробной деструкции: bssA и masD, а в
негазогидратном районе – alkBB.
2.Из донных отложений 23 станций северной части Японского моря было выделено 55
штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, которые были отнесены к родам Pseudomonas,
Psychrobacter,Stenotrophomonas,Bacillus,Rhodococcus,Micrococcus,Nesterenkonia,
Brevibacillus, Promicromonospora, Peribacillus, Robertmurraya, Curtobacterium, Nocardioides.
Представители семейств Nocardiaceae и Nocardioidaceae обнаружены только в газогидратном
районе.
3.Исследование физиолого-биохимических свойств штаммов нефтеокисляющих бактерий
показало, что бактерии, выделенные из района залежей газогидратов, обладали способностью
ферментировать большее разнообразие углеводных субстратов, чем культуры, выделенные из
негазогидратного района. Отмечена корреляция между способностью к деструкции карбоновых
кислот и их производных и отсутствием газогидратов в донных отложениях. Показано, что 5 из
55 исследуемых штаммов имели 2 плазмиды с молекулярными массами 20 и 30 МДа. Данные
штаммы были обнаружены на станциях, расположенных в районе залежей газогидратов.
4.Изучение наличия функциональных генов аэробной и анаэробной деструкции штаммов
показало, что с наибольшей частотой в изолятах встречались гены аэробной деструкции
углеводородов alkBB и гены bssA, ответственные за анаэробную деструкцию ароматических
углеводородов. Показано, что наибольшее количество штаммов с alkBB встречались в
газогидратном районе.
5.Степень биодеградации углеводородов у штаммов, выделенных из донных отложений в
районе, где газогидраты обнаружены не были, выше, чем у штаммов, выделенных в
газогидратном районе. Наибольшие различия наблюдаются при утилизации углеводородов с
длиной цепи выше С19.
6.38 штаммов родов Pseudomonas, Bacillus, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Rhodococcus,
Micrococcus, Robertmurraya, Peribacillus, Promicromonospora обладали способностью к
деградации углеводородов в аэробных и анаэробных условиях. Все исследуемые штаммы
родов Pseudomonas, Bacillus обладали способностью к деструкции углеводородов в аэробных и
анаэробных условиях. Частота встречаемости штаммов, способных к окислению углеводородов
в аэробных и анаэробных условиях, в обоих районах приблизительно одинакова.
7.Анаэробные накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий, в которых
зарегистрировано образование сероводорода, получены из проб донных отложений станций,
расположенныхвдольконтинентальногосклона,отличающихсяпониженными
концентрациями сульфатов и присутствием биоиндикаторного гена сульфатредукции dsrB.
8.Из донных отложений в районе газогидратных залежей выделена культура
сульфатредуцирующих бактерий, способная к анаэробной деградации нефти и предварительно
отнесенная на основании полифазной таксономии к новому виду рода Desulfosporosinus.
Глубоководные донные отложения морей составляют большую часть
поверхности Земли и представляют собой сложные системы, в которых
происходит взаимодействие геологических, гидрогеологических, физико-
химических и биологических процессов (Köster, Meyer-Reil, 2001). Морские
отложения играют важную роль в круговороте веществ, в частности, в глобальном
круговороте углерода и сопряженных с ним циклов (Kirkpatrick et al., 2019).
Микроорганизмы, способные к использованию углеводородов в качестве
единственного источника углерода, являются неотъемлемой частью морской
среды (Bian et al., 2015). В отношении к микробиологическому сообществу
естественные газо – и нефтепроявления в морях могут рассматриваться как
источники углерода и энергии для жизнедеятельности микроорганизмов.
Естественные газо – и нефтепроявления в морях – это сложное
геологическое явление, которое оказывает ведущее средообразующее действие на
формирование микробиомов морских донных отложений. В первую очередь, на
бактерии, способные к окислению метана и других углеводородов и сопряженных
с ними в биогеохимических циклах сульфатредукторов (Беляев, 1981; Леин,
Иванов, 2009). Сообщества микроорганизмов, встречающиеся в таких районах,
обладают специфическими функциями и жестко структурированы как по глубине,
так и по мере удаленности от сипа (от англ. seep – просачивание). Высокая
экологическая пластичность и биоразнообразие углеводородокисляющих
бактерий позволяют предположить возможность переключения их, в зависимости
от условий, на потребление метана и других углеводородов (Ehrlich et al., 2015).
Газогидраты – сравнительно новый тип углеводородной залежи, в котором,
по оценкам специалистов, сосредоточены большие объемы газа (Обжиров и др.,
2015). Они образуются в условиях благоприятного сочетания низких температур и
высокого давления в морских донных отложениях при высоких концентрациях
природного газа в пористой и трещиноватой осадочной среде и на поверхности
дна. Существуют единичные сообщения о филумах некультивируемых
микроорганизмов, обнаруживаемых только в районах открытия газогидратов
(Lanoil et al., 2001; Case et al., 2015). В районах газо-флюидных потоков на дне
океана характерно одновременное действие множества факторов, и только
использование методов биоиндикации позволяет оценить их суммарное
воздействие на экосистему.
Основными методами в области биоиндикации в настоящее время являются
фиксирование изменения свойств культивируемых форм биоиндикаторных групп
бактерий и обнаружение функциональных генов, участвующих в биодеградации
углеводородов.
Существует большое количество работ по изучению аэробного и
анаэробного окисления углеводородов микроорганизмами, выделенными из
нефтяных и газовых месторождений морей. По данным литературы, наиболее
часто из нефтяных месторождений выделяют бактерии, относящиеся к типу
Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria (Li et al., 2007; Silva et al., 2013).
Углеводороды интенсивнее поддаются деструкции микроорганизмами в
присутствии кислорода (Назина и др., 2020); однако в местах нефте- и
газопроявлений доминирует анаэробная деструкция углеводородов (Adams et al.,
2013; Singh et al., 2017). По сообщению ряда авторов, основную роль в анаэробной
деструкции органического вещества играют сульфатредуцирующие бактерии
(Kniemeyer et al., 2007, Spiegelman et al., 2015).
На дальневосточные моря оказывают влияние нефтяные загрязняющие
вещества как техногенного, так и природного происхождения (Журавель и др.,
2004; Бузолева и др., 2008; Шакиров и др., 2019). Тем не менее, в литературе мало
данных, касающихся исследований микробных сообществ, связанных с
деструкцией углеводородов нефти в донных отложениях. Чаще всего в донных
отложениях исследуется микробное разнообразие в целом на основе изучения
генетического материала и проводятся работы по исследованию микробиоты
поверхностных вод (Бузолева и др., 2008) с целью выделения штаммов,
использование которых возможно в биоремедиации в случае техногенного
загрязнения углеводородами.
Северная часть Японского моря представляет особый интерес для
исследования из-за особенностей геологического строения и как район
обнаружения газогидратов в пределах юго-западного склона о. Сахалин (Шакиров
и др., 2019). В районе северного замыкания глубоководной Центральной
котловины Японского моря газогидраты еще не установлены, но отмечаются
аномально высокие концентрации метана в газосодержащих слоях и
сейсмические признаки газогидратоносных отложений (Шакиров и др., 2019).
Разные условия в районах обнаружения и отсутствия газогидратов влияют на
формирование микробиомов морских донных отложений. Обнаружение различий
в культивируемом углеводородокисляющем микробиоме в районах присутствия и
отсутствия газогидратов имеет большие перспективы в их использовании в
качестве биоиндикаторов и для понимания микробных процессов, происходящих
в донных отложениях.
Цель работы: исследование разнообразия культивируемых
нефтеокисляющих и сульфатредуцирующих микроорганизмов и их
физиологических свойств в верхней части восстановленного слоя донных
отложений северной части Японского моря газогидратного и негазогидратного
районов.
Основные задачи исследования:
1. Оценить встречаемость генов-биоиндикаторов деструкции углеводородов
с помощью вложенной ПЦР с праймерами, специфичными на функциональные
гены, отвечающие за аэробное и анаэробное окисление углеводородов, в
газогидратном районе и в районе, где газогидраты обнаружены не были.
2. Получить накопительные культуры нефтеокисляющих микроорганизмов;
провести сравнительный анализ видового, физиологического и плазмидного
разнообразия культивируемых нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных
из верхней части донных отложений северной части Японского моря в
зависимости от присутствия газогидратов.
3. Изучить наличие функциональных генов аэробной и анаэробной
деструкции углеводородов в выделенных штаммах, культивируемых
нефтеокисляющих микроорганизмов.
4. Выявить способность выделенных штаммов утилизировать углеводороды
в аэробных и анаэробных условиях.
5. Оценить встречаемость генов dsrB в донных отложениях исследуемых
районов. Получить накопительные культуры сульфатредуцирующих
микроорганизмов, способных к деструкции углеводородов. Дать полное описание
чистой культуры, способной одновременно и к окислению углеводородов, и к
восстановлению сульфатов.
Научная новизна. Впервые проведено сравнение культивируемой
нефтеокисляющей микробиоты в донных отложениях в зависимости от
присутствия газогидратов. Выявлена приуроченность представителей семейства
Nocardiaceae филума Actinobacteria к районам обнаружения газогидратов. Создана
коллекция штаммов, способных к биодеградации нефти, выделенных из
аномальных газовых полей в донных отложениях северной части Японского моря.
Впервые для 38 выделенных бактерий родов Stenotrophomonas, Psychrobacter,
Micrococcus, Robertmurraya, Peribacillus, Promicromonospora показана
способность окислять углеводороды нефти как в аэробных, так и в анаэробных
условиях. Из донных отложений северной части Японского моря выделен новый
вид сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfosporosinus. Впервые у
представителя рода Desulfosporosinus отмечена способность к деградации
углеводородов.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в рамках
темы Госзадания: 2019-2023, 0211-2021-0012 «Исследование состояния и
изменений природной среды на основе комплексного анализа и моделирования
гидрометеорологических, геохимических, геологических процессов и ресурсов
Мирового океана», № гос. рег. АААА-А19-119122090009-2; при финансовой
поддержке гранта РФФИ № 19-34-50075 «Сульфатредуцирующие и
нефтеокисляющие бактерии донных отложений Японского моря и Татарского
пролива» (руководитель д.б.н., заведующая лабораторией анаэробных
микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени
Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) Щербакова В.А.), в
рамках программы академической мобильности «Всероссийский конкурс
молодежных проектов стратегии социально-экономического развития «России –
2035»; в составе рабочей группы по газогидратам и потокам метана в Индо-
Тихоокеанском регионе в Подкомиссии МОК по западной части Тихого океана
Юнеско (WG007 IOCWESTAC), а также в рамках проекта, входящего в
Десятилетие Наук об Океане под названием «Geosystems and mineral resources in
the transition «Continent-Ocean» Zones and open ocean, (GEOMIR, Id 164), 2021-
2030 (рук. д.г.-м.н. Шакиров Р.Б.).
Практическая значимость. Выделенные виды микроорганизмов могут
быть использованы в биоремедиационных мероприятиях. Нефтеокисляющие
бактерии представителей семейства Nocardiaceae могут выступать в роли
биоиндикаторов газогидратов. Выделенные и описанные в работе новые штаммы
микроорганизмов помещены в российскую (ВКМ) и зарубежную (NCBI)
коллекции микроорганизмов и доступны для научной общественности как
объекты для дальнейших исследований.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Видовое разнообразие, физиологические свойства и способность к
биодеградации углеводородов, культивируемых нефтеокисляющих бактерий,
выделенных из донных отложений в районе обнаружения газогидратов, имели
существенные различия с микроорганизмами, выделенными в районе, где
газогидраты не были обнаружены.
2. Представители родов Pseudomonas, Bacillus, Stenotrophomonas,
Psychrobacter, Rhodococcus, Micrococcus, Robertmurraya, Peribacillus,
Promicromonospora обладали способностью окислять нефть в аэробных и
анаэробных условиях.
3. Новый вид культивируемой сульфатредуцирующей бактерии, отнесенный
к роду Desulfosporosinus, способный к окислению углеводородов в анаэробных
условиях, выделен в районе залежей газогидратов.
Личный вклад автора. Разработка методов и экспериментальные
исследования, представленные в диссертации, проводились как лично автором,
так и при непосредственном участии автора. Автор принимал активное участие в
постановке научных задач, морских экспедициях, обработке экспериментальной
информации, обсуждениях и опубликовании результатов.
Достоверность полученных результатов подтверждается:
использованием современных средств регистрации и методов обработки
результатов; воспроизводимостью полученных результатов при повторении
условий экспериментов и сравнением результатов с данными других
исследований.
Апробация работы. Материалы работы представлены на российских и
международной конференциях: «Всероссийская научная конференция с
международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты
биоинформатики, биотехнологии и недропользования» (Пермь, ПГНИУ, 2021),
«IX конференция молодых ученых «Океанологические исследования-2021»
(Владивосток,
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.8 (373 отзыва)
4.9 (35 отзывов)
4.8 (211 отзывов)
5 (285 отзывов)
5 (428 отзывов)
4.8 (9 отзывов)
5 (14 отзывов)
5 (9 отзывов)
4.9 (298 отзывов)
