Влияние антропогенных факторов различной химической природы на процессы экзотрофии у рыб

Материалы и методы исследования
Работа проведена на 8 видах пресноводных костистых рыб (тип
Vertebrata, кл. Osteichthyes), относящихся к 3 семействам: сем. карповые
Cyprinidae: карп Cyprinus carpio L., серебряный карась Carassius auratus (L.),
плотва Rutilus rutilus (L.), лещ Abramis brama (L.), густера Blicca bjoerkna (L.),
сем. окуневые Percidae: окунь Perca fluviatilis L., судак Sander lucioperca (L.),
сем. щуковые Ecocidae: щука Esox lucius L. Большинство рыб отловлено в
Волжском плесе Рыбинского водохранилища, карп и карась выращены в прудах
экспериментальной базы «Сунога» ИБВВ РАН. Всего в экспериментах
исследовано 360 экз. рыб (табл. 1).
Таблица 1 – Количество рыб, использованных для решения различных задач
№Задача исследованияВид рыбЭкз.
1 Влияние тяжелых металлов (цинка, меди и ртути, 1 мМ в Карп20
расчете на металл), поступающих с пищей, на пищевое
поведение рыб
2 Накопление ртути в тканях рыбКарп20

3 Влияние тяжелых металлов (цинка, меди и ртути),Карп65
поступающих с пищей, на активность пептидаз кишечника
рыб
4 Влияние кристаллического фенола и его производных (4-Карп, лещ, плотва,185
хлорфенола, 4-нитрофенола и 2,4-динитрофенола), а такжегустера, карась, окунь,
аморфного фенола и его фракций (верхней и нижней) нащука, судак
активность пептидаз химуса и слизистой оболочки
кишечника у рыб разных видов, различающихся по
характеру питания.
5 Влияние гербицида Раундап (0,1–100 мкг/л) на активностьПлотва, карп, карась,70
пептидаз химуса и слизистой оболочки кишечника рыб,окунь, щука, судак,
различающихся по типу питания

1. Проведено три серии опытов по оценке влияния тяжелых металлов
(цинка, меди и ртути), поступающих с пищей, на пищевое поведение карпа и
одна серия по исследованию динамики накопления ртути. Влияния указанных в
таблице веществ на пищевое поведение рыб оценивали индивидуально по трем
параметрам: время нахождения рыб в стартовой камере (t1), латентное время
питания рыб (t2) – время, необходимое для достижения кормового пятна и
рацион (R) – количество личинок хирономид, потребленных за 3 мин.
наблюдения Kuz’mina, 2011). Концентрациию ртути в мышцах, кишечнике и
мозге определяли методом бесплазменной атомной абсорбции на анализаторе
ртути РА-915+ и приставке ПИРО-915+ с использованием программного
обеспечения RA915P (ООО «ЛЮМЕКС», Санкт-Петербург). Точность
аналитических методов измерения контролировали с использованием
сертифицированного биологического материала DORM-2 и DOLT-2 (Институт
химии окружающей среды, Оттава, Канада).
2. Проведено три серии опытов по оценке влияния тяжелых металлов
(цинка, меди и ртути) на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника и
химуса у карпа, шесть серий опытов по оценке влияния кристаллического
фенола и его производных (4-хлорфенола, 4-нитрофенола и 2,4-
динитрофенола), а также аморфного фенола и его фракций на активность
пептидаз слизистой оболочки кишечника и химуса у рыб разных видов и одна
серия опытов по оценке влияния гербицида Раундап на активность пептидаз
слизистой оболочки кишечника и химуса у рыб разных видов. Активность
пептидаз оценивали по увеличению концентрации тирозина с использованием
реактива Фолина-Чиокалтеу (преимущественно активность трипсина, КФ
3.4.21.4 (Kuz’mina V.V. et al., 2019).
Результаты представлены в виде средних значений и их ошибок (M ± m).
В случае нормального распределения (тест Шапиро–Уилка) при сравнении
результатов использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA
(LSD-тест или Tukey HSD). Если распределение отличалось от нормального,
использовали критерий Краскела–Уоллиса. Различия показателей считали
статистически значимыми при уровне значимости p ≤ 0,05, p ≤ 0,01 или
p ≤ 0,001.

III. Влияние поступающих с пищей тяжелых металлов на пищевое
поведение карпа
До начала экспериментов по оценке влияния цинка (Zn) и меди (Cu) на
пищевое поведение рыб за 2 мес. до проведения предварительных опытов в
корм молоди карпа вводили Zn (9,8 мг/кг корма) или Cu (9,5 мг/кг корма). За 2
нед. до начала экспериментов проводили предварительные опыты: рыб,
находящихся в стартовой камере, приучали находить и потреблять корм
(личинок хирономид) после поднятия фронтальной стенки камеры. Данные
ежедневных наблюдений усредняли по декадам. Показано, что в течение 1-й
декады от начала опыта время нахождения в стартовой камере (t1) у рыб,
получавших с кормом Zn, фактически не изменились, у рыб, получавших Cu –
увеличились почти на треть по сравнению с контролем (рис. 1).
Рисунок 1 – Влияние цинка и меди на различные аспекты пищевого поведения
молоди карпа
1-Время пребывания рыб в стартовой камере, t1,с; 2- Латентное время питания, t2,с; 3- Рацион R, экз. личинок
хирономид. Декады- 1;2;3;4;5;6. Примечание. Даны средние значения и ошибка среднего. N = 5., a – р ≤ 0,05, б
– р ≤ 0,01, в – р ≤ 0,001.

В дальнейшем у рыб обеих групп, несмотря на колебания показателя, как
правило, наблюдалось достоверное увеличение значений t1 по сравнении с
таковыми у рыб контрольной группы. Установлено, что в наибольшей степени
Zn и Cu влияют на латентное время питания рыб (t2) – время, необходимое для
достижения кормового пятна. Важно отметить, что величина t2 у рыб в течение
опыта значительно колебалась, но во все сроки наблюдения у рыб опытной
группы превышала таковую у рыб контрольной группы. При этом степень
увеличения показателя была значительно выше в случае Cu (в 7 раз, 5 декада),
чем в случае Zn (в 5 раз, 2 декада), а динамика показателя под влиянием Zn
была противоположной по сравнению с таковой Cu. Динамика потребления
корма под действием Zn и Cu также была различной. В течение 1 декады у рыб,
получавших с кормом Zn, рацион увеличился по сравнению с контролем почти
на 1/3, а затем последовательно снижался, начиная с третьей декады. У рыб,
получавших с пищей Cu, напротив, в течение 1 декады рацион уменьшился по
сравнению с контролем почти на 1/3, в течение 2 декады повысился, а затем
последовательно снижался до конца эксперимента. При этом амплитуда
колебаний величины R у рыб, получавших с пищей Zn, была меньшей по
сравнению с таковой контроля и с амплитудой колебания величины R у рыб,
получавших с пищей Cu.
У рыб, получавших с кормом ртуть (Hg), величина t1 увеличивалась
достоверно лишь в течение 15–28 сутки опыта – в 1,4 раза (табл. 2).
В наибольшей степени Hg, как и в случае биогенных металлов, влияет на
латентное время питания рыб. В течение первых 2 нед. у карпов опытной
группы показатель увеличился в 3,8 раза, 15–28 сут. – в 5,6 раза, в течение 29–
42 сут. опыта – в 5,0 раз по сравнению с контролем. Потребление рыбами
опытной группы корма в течение первого месяца практически не изменялось по
сравнению с контролем. Снижение величины показателя наблюдалось лишь в
конце эксперимента.
Таблица 2 – Влияние ртути на пищевое поведение карпа
Параметры пищевого поведения
Продолжительность
опытаВремя пребывания рыб Латентное времяРацион R, экз. личинок
в стартовой камере, t1, с питания, t2, схирономид
1,3±0,110,8±2,511,4±0,6
1–14 сут.
1,4±0,1(107,6)41,5±7,1** (384,3)12,7±1,0 (111,4)
1,2±0,18,7±0,613,2±0,6
15–28 сут.
1,7±0,2* (141,7)49,1±7,5** (564,4)12,7±1,0 (96,2)
1,2±0,17,0±0,317,1±0,5
29–42 сут.
1,3±0,1(108,3)35,3±5,4** (504,3)12,3±0,9** (71,9)
1,1±0,15,73±0,222,0±0,4
43–60 сут.1,3±0,1 (+18)17,3±4,2* (302)18,5±0,6 ** (84,1)
Примечание. Цифры над чертой – контроль, цифры под чертой – опыт. Даны средние значения и ошибка
среднего. Цифры в скобках – % от контроля, принятого за 100. * – р ≤ 0,01, ** р ≤ 0,001.

Поскольку в хронических экспериментах Hg, поступающая с пищей и
накапливающаяся в тканях, влияла на пищевое поведение рыб, ниже приведены
данные по динамике ее накопления в разных тканях карпа (табл. 3).
Как показывает таблица, концентрация Hg в мышцах на протяжении
всего опыта была выше, чем в других органах. При этом в течение опыта
концентрация Hg в мышцах увеличивалась в меньшей степени, чем в печени и
мозге. В течение первых двух недель эксперимента наблюдалось резкое
увеличение концентрация Hg во всех исследованных тканях. Важно отметить,
что к концу эксперимента концентрация Hg в мышцах увеличилась в 4,9 раза, в
печени – в 4,6 раза, в мозге – в 8 раз. Полученные данные свидетельствуют о
том, что Hg аккумулируется быстрее в мозге, чем в мышцах, что, по-видимому,
связано с высоким содержанием липидов в тканях мозга (Handy R.D., 2003;
Hosseini S.M. et al., 2013).
Таблица 3 – Динамика накопления ртути в различных органах у карпа, мг/кг
Концентрация ртути, мг/кг
Ткань (орган)
0 сут.14 сут.28 сут.42 сут.
0,14±0,020,37±0,030,55±0,040,68±0,04
Мышцы
(100)264,3392,9485,7
0,05±0,0050,22±0,010,30±0,030,40±0,04
Мозг
(100)440600800
0,08±0,0070,37±0,080,32±0,030,37±0,03
Печень
(100)462,5400462,5
Примечание. Цифры в скобках – % от контроля, принятого за 100.

Резюмируя результаты этих опытов, следует отметить, что тяжелые
металлы, поступающие с кормом, накапливаясь в тканях рыб, снижают
интенсивность питания карпов и увеличивает латентное время питания. В
наибольшей степени снижается скорость пищевой реакции рыб, в меньшей
степени – рацион и время нахождения в стартовой камере. При этом отмечено
резкое увеличение содержание Hg во всех органах, особенно в мозге.
Полученные данные свидетельствуют о том, что системы детоксикации печени
либо не способны существенно снижать ее концентрацию, либо существует
динамическое равновесие, при котором на исследованном отрезке времени
сохранялся установленный уровень металла.

IV. Влияние тяжелых металлов, поступающих с пищей, на
активность пептидаз кишечника карпа
Данные, касающиеся влияния Zn, поступающего с пищей, на активность
пептидаз слизистой оболочки кишечника рыб свидетельствуют о зависимости
эффекта от концентрации металла (рис. 2). У рыб 1-й группы, однократно
получавших пищу, содержащую Zn в концентрации 10 мг/кг, протеолитическая
активность слизистой оболочки кишечника и химуса не изменяется по
отношению к контролю. При увеличении дозы металла от 10 до 100 мг/кг
активность пептидаз резко снижается, от 100 до 200 мг/кг – достоверно не
изменяется.

Рисунок 2 – Влияние поступающего с пищей цинка на активность пептидаз
слизистой оболочки кишечника (а) и химуса (б) карпа.
Обозначения: по оси абсцисс концентрация металлов, мг/кг массы корма, по оси ординат: активность пептидаз,
мкмоль/(г·мин). 1 – контроль, 2 – 1 группа (однократное получение корма, содержавшего цинк), 3 – 2 группа
(двукратное получение корма, содержавшего цинк). * – различия между опытом и контролем статистически
значимы при p<0,05, ** – при p<0,01, *** – при p<0,001. Важно отметить, что у рыб 2-й группы, дважды получавшей Zn в концентрации 10 и 100 мг/кг, металл не вызывает достоверное снижение активности пептидаз слизистой оболочки, химуса – достоверно увеличение. Лишь максимальная концентрация Zn вызывает статистически значимое снижение уровня ферментативной активности, особенно в случае слизистой оболочки. Сравнение результатов исследования рыб двух групп, получавших одну или две порции Zn, позволило выявить статистически значимые различия в активности пептидаз только в случае химуса. Под влиянием ионов Cu активность пептидаз слизистой оболочки, как правило, снижается в меньшей степени по сравнению с таковой химуса (рис. 3). Как показывает рисунок, степень снижения активности пептидаз слизистой у рыб 1 группы, получавших пищу, содержащую металл в концентрации 10 и 50 мг/кг близка, снижение составило около 27 % по сравнению с контролем. Активность пептидаз химуса последовательно снижается по мере увеличения концентрации металла. При этом в случае слизистой увеличение концентрации Cu на порядок (от 10 до 100 мг/кг) не приводит к достоверному увеличению эффекта,вслучаехимусанаблюдаетсядостоверноеснижение протеолитической активности на 20 % по сравнению с таковой слизистой в обеих группах. Рисунок 3 - Влияние меди на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника (а) и химуса (б). Обозначения: по оси абсцисс: – концентрация металлов, мг/кг массы корма, по оси ординат: активность пептидаз, мкмоль/(г·мин). 1– контроль, 2 – 1 группа, 3 – 2 группа. * – различия между опытом и контролем статистически значимы при p<0,05, ** – при p<0,01, *** – при p<0,001. У рыб 2-й группы введение в корм Cu последовательно и достоверно снижает активность пептидаз, особенно в случае химуса. Наибольшее снижение уровня ферментативной активности слизистой (на 15,5 %) и химуса (на 34,5% по сравнению с контролем) наблюдается при максимальной концентрации Cu (100 мг/кг). Большее влияние Cu на активность пептидаз по сравнению с Zn хорошо согласуется с данными, полученными в условиях in vitro (Кузьмина В.В. и др., 2005; Kuzmina V.V., Ushakova N.V., 2013). Исследование влияния Hg, поступающей с пищей, на протеолитическую активность и ее накопление в слизистой оболочке кишечника карпа позволило выявить снижение активности пептидаз через 2 нед. на 38,5 % по сравнению с контролем, а также увеличение через 4 и 6 нед. в 1,3 и 1,5 раза соответственно (табл. 4). При этом отмечено резкое увеличение содержание Hg в слизистой оболочке кишечника (в 18,3 раза). Также заслуживает внимания тот факт, что в случае кишечника наблюдается последовательное увеличение ее концентрации. Таблица 4 - Динамика накопления ртути и активности пептидаз в слизистой оболочке кишечника карпа Сроки наблюдения, сут. 0142842 Содержание ртути, мг/кг 0,04±0,0040,53±0,060,57±0,040,73±0,04 100132514251825 Активность пептидаз, мкмоль/(г·мин) 6,57±0,084,04±0,09***8,28±0,16***10,03±0,20*** 10061,5126152,7 Примечание. Нижние цифры – % от контроля, принятого за 100. V. Влияние фенола и его производных на активность пептидаз кишечника рыб, различающихся по типу питании Поскольку работы, касающиеся влияния кристаллического фенола и его производных (4-хлорфенол, 4-нитрофенол, 2,4-динитрофенол) на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника рыб, отсутствовали, вначале было исследовано действие высокой концентрации (1,0 ммоль/л или 94,1 мг/л) на пептидазы кишечника бентофагов (лещ, густера, плотва, карась и окунь) с использованием в качестве субстрата казеина и гемоглобина. Опыты позволили выявить не только чувствительность пептидаз рыб к исследованным фенолам, но и видоспецифичность их эффектов. Минимальный эффект был выявлен при исследовании активности пептидаз по казеину у плотвы, максимальный – у карася: под влиянием фенола активность снижалась на 2,5 и 69,2 %, под влиянием 2,4-динитрофенола – на 26,8 и 70,5% у первого и второго вида соответственно. Поскольку влияние фенолов на активность пептидаз у рыб разных видов по гемоглобину принципиально не отличалось от такового по казеину, в дальнейшем в качестве субстрата использовали лишь казеин. Влияние различных концентраций кристаллического фенола и его производных (0,06–0,5 ммоль/л) на активность пептидаз слизистой оболочка кишечника и химуса у бентофагов. Исследование влияния фенола и его производных в концентрациях, встречающихся в водоемах Европы (47,1 мг/л и ниже) на активность кишечных пептидаз подтвердило видоспецифичность их эффектов. Так, у леща фенол достоверно снижает активность пептидаз слизистой оболочки (табл.5). Таблица 5 - Влияние фенола и его производных на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника бентофагов, мкмоль/(г.мин) ГустераЛещ Концентрация,2,4-2,4- 4-Хлор-4-Нитро-4-Хлор- 4-Нитро- ммоль/лФенолДинитро-ФенолДинитро- фенолфенолфенолфенол фенолфенол Слизистая 06,5±0,15,3±0,16,7±0,26,7±0,26,1±0,16,1±0,15,1±0,15,1±0,1 100100100100100100100100 0,065,8±0,1б4,7±0,1б6,6±0,65,8±0,1б 4,4±0,2в 4,3±0,1в4,2±0,2а4,0±0,1в -10,8-11,4-1,5-13,5-27,9-29,6-17,7-21,6 вбаавбв 0,134,7±0,14,4±0,16,0±0,16,1±0,13,9±0,14,8±0,13,6±0,13,4±0,1в -27,7-17,0-10,1-9,1-36,1-21,4-29,5-33,4 ввавбв 0,254,8±0,14,1±0,16,6±0,26,1±0,14,5±0,15,3±0,13,6±0,13,3±0,1в -26,2-22,7-1,5-9,1-26,7-13,2-29,5-35,3 0,54,9±0,1в4,1±0,1в7,2±0,26,7±0,25,3±0,1б 3,7±0,1в3,7±0,1б3,5±0,2в -24,7-22,7+7,40-13,2-39,4-27,5-31,4 Примечание. Над чертой: «а» - различия между опытом и контролем статистически значимы при p<0,05, «б»- при p<0,01, «в» - при p< 0,001. Под чертой изменение активности пептидаз, в % от контроля, принятого за 100. При исследовании густеры отмечены меньшие эффекты. Низкие концентрации фенола не влияют на активность пептидаз химуса и лишь концентрациях 0,25 и 0,5 ммоль/л в ряде случаев статистически значимо (р ≤ 0,001) снижают уровень ферментативной активности. Под влиянием 4- хлорфенола степень уменьшения активности пептидаз у обоих видов рыб близка таковой фенола, особенно при концентрациях 0,25 и 0,5 ммоль/л. Влияние 4-хлорфенола на пептидазы химуса выражено слабее, однако отмечается тенденция усиления ингибиторного эффекта по мере увеличения его концентрации, особенно в случае ферментов леща. Негативные эффекты 4- нитрофенола и особенно 2,4-динитрофенола на активность пептидаз слизистой оболочки леща выражены сильнее по сравнению с таковыми фенола и 4- хлорфенола. При исследовании химуса леща обнаружено более значительное ингибирующее влияние 4-нитрофенола по сравнению с 2,4-динитрофенолом. В отличие от леща, у густеры 4-нитрофенол в 2-х более высоких концентрациях оказывает больший эффект на пептидазы химуса, чем на ферменты слизистой оболочки. Важно отметить, что у рыб этого вида 2,4-динитрофенол не влияет на уровень ферментативной активности ни слизистой, ни химуса (в гастроэнтерологии эффекты, не превышающие 15 %, не считаются значимыми). Влияние кристаллического фенола и его производных (0,06–0,5 ммоль/л) на активность пептидаз слизистой оболочка кишечника и химуса у типичных и факультативных ихтиофагов. Полученные данные свидетельствуют о большей вариабельности активности пептидаз слизистой оболочки у типичных ихтиофагов по сравнению с таковой бентофагов. Активность пептидаз слизистой оболочки у контрольных особей судака превышает таковую у щуки в 2–2,5 раза (табл. 6). Однако значительное изменение активности пептидаз под действием фенола и его производных наблюдается лишь у щуки. Под действием фенола отмечено статистически значисое (р ≤ 0,01 и р ≤ 0,001) уменьшение ферментативной активности слизистой оболочки во всем диапазоне исследованных концентраций. 4- хлорфенол оказывает эффект, сопоставимый с таковым фенола, а 2,4- динитрофенол и особенно 4-нитрофенол вызывают менее выраженный эффект. Таблица 6 - Влияние фенола и его производных на активность пепетидаз слизистой оболочки кишечника ихтиофагов, мкмоль/(г.мин) КонцентрацияЩукаСудак Фенолов,Фенол4-Хлор-4-2,4-Фенол4-Хлор-4-2,4- ммоль/лфенолНитро-Динитро-фенолНитро-Динитро- фенолфенолфенолфенол 03,8±0,2 3,7±0,24,1±0,14,0±0,28,5±0,29,1±0,28,8±0,18,8±0,1 100100100100100100100100 абаава 0,063,0±0,1 2,9±0,24,0±0,23,4±0,18,1±0,19,7±0,28,4±0,19,5±0,2а -21,1-21,7-2,5-15,0-4,7+6,5-4,6+7,9 бваа 0,132,3±0,3 2,1±0,13,5±0,24,4±0,28,3±0,18,8±0,18,1±0,28,4±0,2 -39,5-43,3-14,7+10,0-2,4-3,3-8,0-4,6 0,252,3±0,1б 1,7±0,1в 3,4±0,1б3,1±0,1б8,8±0,29,0±0,29,9±0,3а8,7±0,1 -39,5-54,1-17,1-22,5+3,5-1,1+12,5-1,2 0,50,8±0,1в 0,9±0,1в 3,4±0,2а2,3±0,1в9,0±0,1а8,5±0,1в8,4±0,28,9±0,1 -78,4-75,7-17,1-42,5+5,9-6,6-4,6+1,1 Примечание. Над чертой: «а» - различия между опытом и контролем статистически значимы при p<0,05, «б»- при p<0,01, «в» - при p< 0,001. Под чертой изменение активности пептидаз, в % от контроля, принятого за 100. У судака активность пептидаз под влиянием кристаллического фенола и его производных в ряде случаев достоверно изменялась, причем помимо ингибирования наблюдалась стимуляция пептидаз. Однако, как указывалось выше, в гастроэнтерологии модификаторные эффекты, не превышающие 15%, не принято рассматривать, как значимые. Влияние кристаллического фенола и его производных на активность пептидаз химуса у этих видов рыб выражено слабее по сравнению с таковым слизистой оболочки. Последнее в равной мере относится к влиянию кристаллического фенола и его производных на активность пептидаз химуса и слизистой оболочки у ихтиофага- факультативного бентофага окуня. Вследствие этого заслуживает внимания лишь снижение уровня ферментативной активности химуса у окуня под влиянием 4-хлорфенола в концентрации 0,5 ммоль/л (почти на 17%). Влияние аморфного фенола на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника и химуса у рыб разных видов. Степень влияния аморфного фенола на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника и химуса у разных видов рыб различна. Аморфный фенол во всех исследованных концентрациях значительно ингибирует активность пептидаз у плотвы (максимум на 56,3%). На ферменты карася, густеры, карпа, окуня и судака аморфный фенол оказывает стимулирующий эффект, наиболее значительный у судака (максимум на 55,6%). При исследовании леща выявлена смена эффекта: при меньших концентрациях аморфного фенола (0,03–0,13 ммоль/л) наблюдается ингибирование, максимум на 39,1%, при максимальной концентрации  ярко выраженная стимуляция, максимум на 65,7%. В случае химуса, как правило, характер влияния аморфного фенола на активность пептидаз у бентофагов сохраняется. Особо следует отметить значительный стимулирующий эффект при всех концентрациях аморфного фенола на пептидазы химуса у окуня, а также ингибирующий – у судака. Влияние различных фракций аморфного фенола на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника и химуса у бентофага карпа и ихтиофага судака. При переходе аморфного фенола в жидкое состояние образуются две четко различимые фракции: небольшая верхняя и в 4–5 раз большая по объему нижняя фракция. Влияние аморфного фенола, содержащегося в этих фракциях на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника и химуса было изучен на примере типичного бентофага карпа и типичного ихтиофага судака. Опыты показали, что верхняя фракция аморфного фенола сходным образом влияет на пептидазы слизистой оболочки кишечника и химуса у карпа: при низких концентрациях наблюдается ингибирующий эффект, при более высоких – стимулирующий, особенно в случае химуса. У судака в случае слизистой оболочки доминирует значительный, в случае химуса меньший по величине ингибирующий эффект, который в диапазоне концентраций 0,03 – 0,25 мг/л, сменяется стимуляцией. Нижняя фракция аморфного фенола у обоих видов рыб в большинстве случаев оказывает ингибирующее действие на активность пептидаз, особенно при низких концентрациях токсиканта. VI. Влияние гербицида Раундап на активность пептидаз кишечника рыб с разным типом питания Типичные и факультативные бентофаги. У рыб, рассматриваемых в качестве контроля, наименьшая активность пептидаз слизистой оболочки кишечника отмечена у плотвы  4,11±0,11 мкмоль/(г.мин). У карася активность пептидаз была ниже, чем у карпа и густеры 5,15±0,06, 7,49±0,26 и 8,27±0,11 мкмоль/(г.мин) соответственно. Данные, касающиеся влияния Раундапа на активность пептидаз свидетельствуют о зависимости эффекта не только от концентрации препарата, но и от видовых особенностей рыб (рис. 4). 1234567 ** *** ** ***** *** *** *** *** 5********* *** ****** ** *** *** *** ГустераПлотваКарпКарась Рисунок 4 - Влияние Раундапа на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника бнтофагов. Обозначения: Здесь, а также и на рис. 5 и 6 по оси абсцисс – концентрация раундапа: 1 – 0; 2 − 0,1, 3 − 1, 4 − 10, 5 – 25, 6 – 50, 7 – 100 мкг/л. По оси ординат − активность пептидаз, мкмоль/(г.мин). Различия по сравнению с контролем статистически значимы при: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Максимальное снижение активности пептидаз слизистой по сравнению с контролем у всех видов рыб наблюдается при концентрации Раундапа – 100 мкг/л. При этой концентрации минимальное снижение ферментативной активности отмечено у карпа – до 5,82±0,10, максимальное – у густеры – до 4,0±0,11 мкмоль/(г.мин), на 22 и 52% соответственно. У плотвы активность пептидаз по сравнению с контролем уменьшается на 38% – до 2,55±0,06 мкмоль/(г.мин). Также важно отметить, что у густеры первое достоверное снижения показателя наблюдается при концентрации препарата 50 мкг/л ,у плотвы – 1,0 мкг/л, у карпа – 10 мкг/л препарата. Кроме того, следует подчеркнуть, что у карпа ингибирующий эффект Раундапа в концентрациях 25 и 50 мкг/л статистически значим при р ≤ 0,05, в концентрациях 50 и 100 мкг/л – при р≤ 0,01, в то время как у густеры лишь в концентрации 0,1 мг/л – при р ≤ 0,05, в остальных случаях – при р ≤ 0,001. У карася под влиянием Раундапа уровень активности пептидаз слизистой оболочки кишечника последовательно снижается от 4,56±0,06 до 3,23±0,15 мкмоль/(г.мин), на 11,5% и 37,3 соответственно. При исследовании влияния Раундапа на активность пептидаз химуса у рыб разных видов выявлены менее значительные изменения уровня ферментативной активности (рис. 5). Уровень активности пептидаз химуса у карпа и плотвы в контроле был близким: 7,85±0,11 и 7,85±0,15 мкмоль/(г.мин), у густеры выше – 11,13±0,3 мкмоль/(г.мин). Рисунок 5 - Влияние Раундапа на активность пептидаз химуса у бентофагов. Минимальное снижение ферментативной активности также отмечено у карпа – до 6,24±0,11, максимальное – у плотвы – до 3,69±0,28 мкмоль/(г.мин), на 21 и 53% соответственно. У густеры по сравнению с контролем активность пептидаз уменьшается на 35% – до 7,28±0,20 мкмоль/(г.мин). При этом у густеры первое достоверное снижения показателя наблюдается при концентрации препарата 50, плотвы и карпа – при 0,1 мкг/л. При исследовании химуса у густеры и карпа зона значимых различий шире и наблюдается при концентрациях Раундапа 0,1–100 мкг/л, у плотвы – лишь при 50 и 100 мкг/л. Типичные и факультативные ихтиофаги. Активность пептидаз слизистой оболочки кишечника у контрольных рыб разных видов значительно различается: у щуки соответствует 2,99±0,21, у окуня – 5,15±0,06, у судака – 9,52±0,33 мкмоль/(г.мин). При этом характер влияния гербицида на уровень ферментативной активности слизистой у рыб этих видов также различен (рис. 6). 1234567 * *** ** ** *** 6*** *** * Рисунок0 6 - Влияние Раундапа на активность пептидаз слизистой оболочки Судак кишечника и у ихтиофагов.ОкуньЩука Как показывает рисунок, у судака, начиная с концентрации Раундапа 0,1 мкг/л, наблюдается последовательное увеличение ингибиторного влияния на активность пептидаз слизистой оболочки кишечника (от 14 до 50%). При концентрации Раундапа 100 мг/л уровень активности пептидаз у судака в 2 раза ниже сравнению с контролем – 4,78±0,17 мкмоль/(г.мин). Однако у окуня и щуки при концентрации препарата 0,1 мкг/л отмечается статистически значимая стимуляция: +47,6 и +24,4% соответственно. Затем наблюдается возвращение к норме и лишь при более высоких концентрациях Раундапа – смена эффекта. Уровень активности пептидаз химуса в контроле у щуки и судака выше, чем таковой в слизистой оболочке: 15,19±0,24 и 14,14±0,22 мкмоль/(г.мин) соответственно. Характер влияния Раундапа на активность пептидаз химуса у рыб этих видов близок. В обоих случаях наблюдается последовательное увеличение ингибиторного эффекта. Однако у щуки первое достоверное снижение показателя по сравнению с контролем наблюдается при концентрации препарата 1,0, у судака – 10 мг/л. При концентрации Раундапа 100 мкг/л уровень ферментативной активности у щуки снижается до 9,56±0,23, у судака – до 7,07±0,17 мкмоль/(г.мин), на 37 и 50% соответственно. Заключение В работе впервые в единых методических условиях получены и проанализированы данные, касающиеся влияния антропогенных факторов различной химической природы на различные этапы экзотрофии рыб. Это, прежде всего, относится к изучению влияния тяжелых металлов на пищевое поведениеА.О., Морси А.М.Х., 1998; Handy,2003; Grippo M.A., 2003; Gupta P, Neera S., 2006; Касумян А.О., 2011; Kasumyan A.O., 2012; Касумян А.О. и др., 2013; Webb J.F. et al., 2008; Schulz-Mirbach T., 2013;Schwalbe M.A., Webb J.F., 2014), то в данной работе металлы поступали в организм рыб с пищей. В первом случае их негативное действие на пищевое поведение было преимущественнообусловленовлияниемнасенсорныесистемы, характеристики которых существенно изменялись. При этом влияние тяжелых металлов на активность пищеварительных ферментов изучалось в условиях in vitro (Кузьмина В.В. и др., 2005; Голованова И.Л. и др., 2004, 2014, 2015; Kuz’mina V.V., Ushakova N.V., 2010, 2013). В данной работе исследовано действие тяжелых металлов, содержавшихся в пище и воздействовавших на пищевое поведение рыб после их проникновения через эпителиальный барьер пищеварительного тракта. Показано, что хроническое поступление исследованных металлов с пищей может приводить к снижению двигательной активности и количества потребляемого корма у молоди карпа, а, следовательно, и к снижению эффективности питания рыб. Также показано, что латентное время питания рыб увеличивается под действием меди и ртути в большей степени, чем под действие цинка. При этом биогенные металлы (цинк и медь), поступающие с пищей, вызывают меньшее снижение активности пищеварительных пептидаз по сравнению с металлами, растворенными в воде. Вместе с тем полученные результаты свидетельствуют о том, что тяжелые металлы, поступающие с пищей, также негативно влияют как на начальное, так и на центральное звено экзотрофии. Ранее влияние фенола на активность пищеварительных ферментов у рыб не исследовалось. В работе впервые показано, что в условиях in vitro кристаллический фенол и его производные (4-хлорфенол, 4-нитрофенол, 2,4- динитрофенол) значительно (до 70–75 %) снижают активность пептидаз кишечника у рыб разных видов. При этом ферменты, функционирующие в составе слизистой оболочки кишечника чувствительнее к их действию по сравнению с ферментами химуса. Кристаллический фенол и его производные в концентрациях, встречающихся в водоемах Европы (47.1 мг/л и ниже), как правило, значительно снижают активность пептидаз у леща, густеры и, особенно, щуки, но фактически не влияют на активность пептидаз у судака и окуня. В ряде случаев фенол и его производные в низких концентрациях вызывают незначительное увеличение уровня ферментативной активности. Степень их воздействия также зависит от локализации фермента (слизистая оболочка или химус). Полученные данные позволили предположить, что наличие фенола и его производных в воде и пище рыб в концентрациях, встречающихся в природе, могут снижать активность пептидаз кишечника у представителей сем. карповых Cyprinidae и щуковых Esocidae, в то время как пептидазы представителей сем. окуневых Percidae относительно устойчивы к действию фенолов. Предполагается, что в условиях in vivo фенол и его производные помимо прямого влияния могут оказывать опосредованное действие на активность пептидаз кишечника рыб. Также до последнего времени не было сведений о влиянии на процессы пищеварения аморфного фенола. Особого внимания заслуживает тот факт, что аморфный фенол и фракции, образующиеся при его переходе в жидкое состояние, лишь в низких концентрациях оказывают ингибирующее влияние на активность пептидаз. Поскольку верхняя фракция аморфного фенола образует пленку на поверхности воды, можно ожидать отрицательных последствий для развития кормовой базы молоди рыб, особенно личинок. Раундап также оказывают ингибирующий эффект на активность пептидаз слизистой оболочки и химуса у большинства исследованных видов рыб. Однако степень его воздействия на ферменты тех же видов рыб отличается от таковой фенола. Если в случае фенола наименее устойчивыми оказались ферменты типичного ихтиофага щуки, то в случае Раундапа – типичного бентофага густеры. Важно отметить, что опыты, проведенные в условиях in vitro, позволили установить прямое действие фенола и Раундапа на молекулы пептидаз. Показано, что Раундап и, особенно фенолы, как правило, снижают активность пептидаз слизистой оболочки кишечника у рыб. Сопоставление полученных данных в первую очередь свидетельствует о том, что Раундап оказывает ингибирующий эффект на пептидазы исследованных видов рыб в значительно меньших концентрациях, чем фенол и его производные. Вместе с тем ранее было показано, что особенностью Раундапа является относительная независимость его эффектов от концентрации в диапазоне от 1·10–13 мкг/л до 1 мг/л (Голованова И.Л. и др., 2016; Аминов А.И., 2018). Устойчивость пептидаз к фенолу и Раундапу у рыб, различающихся по таксономии и типу питания, различна: в первом случае наименее устойчивы ферменты типичного ихтиофага щуки, во втором – типичного бентофага густеры. систематического положения вида и типа питания рыб по сравнению с таковой фенола. В условиях in vivo помимо прямого действия возможно опосредованное действие фенола и Раундапа на активность пептидаз. Анализ имеющихся данных позволяет предположить, что важную роль в различиях играют особенности структуры белковых глобул ферментов, характерные для представителей разных семейств. По всей вероятности, разная степень влияния фенола и гербицида Раундап на пептидазы рыб разных видов обусловлена их воздействием на различающиеся по аминокислотному составу регуляторные сайты. При этом фенолы и Раундап могут изменять конформацию активных центров пептидаз, в результате чего снижается эффективность взаимодействия ферментов и субстратов. Таким образом, тяжелые металлы, поступающие с пищей, негативно влияют как на начальное, так и на центральное звено экзотрофии. Кристаллический фенол и его производные (4-хлорфенол, 4-нитрофенол, 2,4- динитрофенол), аморфный фенол и фракции, образующиеся при его переходе в жидкое состояние, а также гербицид Раундап значительно снижают активность пептидаз кишечника у рыб разных видов в условиях in vitro. Снижение активности пептидаз ухудшают усвоение белковых компонентов объектов питания рыб, что может снижать их размерно-весовые характеристики и темп роста. Выводы 1. Антропогенные факторы различной химической природы, являющиеся одними из наиболее приоритетных загрязнителей водных экосистем, исследуемые в работе - тяжелые металлы (цинк, медь, ртуть), кристаллический фенол и его производные (4-хлорфенол, 4-нитрофенол, 2,4-динитрофенол) и аморфный фенол, гербицид Раундап оказывают существенное негативное влияние на звенья процесса экзотрофии у рыб разных видов с различным типом питания. Тяжелые металлы (цинк, медь, ртуть), поступающие с пищей тормозят пищевое поведение и снижают активность пептидаз химуса и слизистой оболочки кишечника рыб; фенол и его производные и гербицид Раундап в условиях in vitro, в основном, снижают активность протеолитических ферментов, а в низких концентрациях могут вызывать стимулирующий эффект. Величина и направленность эффектов исследуемых химических веществ зависят от их концентрации, кратности поступления в организм (тяжелые металлы), локализации пищеварительных ферментов и вида рыб. 2. Длительное (в течение 60-ти суток) потребление с кормом рыбами (молодью карпа) цинка и, особенно, меди и ртути оказывает существенное негативное влияние на различные компоненты пищевого поведения. Под действием меди наблюдается наиболее заметное увеличение времени пребывания рыб в стартовой камере (t1), которое достигает максимальных значений, почти вдвое превышающих уровень контроля, на 20-30 сутки наблюдений: влияние цинка и ртути на t1 значительно менее выражено, достоверное его увеличение наблюдается лишь во второй-третьей декадах наблюдений. Латентное время питания рыб увеличивается в большей степени, а потребление пищи – снижается в равной мере под влиянием меди и ртути и не изменяется или даже увеличивается (1 декада) под влиянием цинка. Характер влияния каждого из тяжелых металлов на различные компоненты пищедобывательного поведения у рыб, очевидно, является отражением изменений тех или иных нейрофизиологических механизмов, лежащих в его основе. 3. Характер и направленность влияния тяжелых металлов, поступающих с пищей, на протеолитическую активность слизистой оболочки и химуса кишечника карпа зависит от их концентрации, кратности применения и локализации пептидаз. Медь оказывает наиболее значимое негативное влияние на активность пептидаз, снижая ее во всех случаях, в то время как цинк в малой дозе способен стимулировать активность ферментов химуса. Повторное потребление рыбами цинка и меди с кормом спустя сутки после первого в большинстве случаев вызывает более слабый эффект в отношении активности пептидаз по сравнению с первым, что может свидетельствовать о наличии адаптационно-компенсаторных механизмов, способствующих снижению повреждающего воздействия токсических веществ на ферментные системы кишечника. Ртуть в концентрациях, встречающихся в организме объектов питания рыб, спустя 2 недели наблюдений снижает активность пептидаз в слизистой оболочке кишечника почти на 40 %, а спустя 4 и 6 недель – увеличивает ее в 1,3 и 1,5 раза по сравнению с контролем соответственно, что сопровождается резким увеличением содержания ртути в слизистой оболочке кишечника. 4. В условиях in vitro кристаллический фенол и его производные в концентрациях 0,060,5 ммоль/л, как правило, значительно и в неодинаковой степени снижают активность пептидаз у представителей сем. Cyprinidae (максимум на 43% у леща) и Esocidae (максимум на 70,5% у щуки), но слабо влияют на активность пептидаз у представителей сем. Percidae, причем, в низких концентрациях фенол и его производные иногда вызывают незначительное увеличение ферментативной активности. В отличие от этого, аморфный фенол, как правило, снижает активность пептидаз лишь в низких концентрациях (0,030,13 ммоль/л), а в более высоких (0,250,5 ммоль/л) - оказывает стимулирующий эффект. Степень воздействия аморфного фенола в условиях in vitro на активность пептидаз зависит от его фракции, концентрации и локализации фермента. 5. Гербицид Раундап в условиях in vitro оказывает ингибирующий эффект на активность пептидаз слизистой оболочки и химуса кишечника у исследованных видов рыб (густера,плотва, карп,карась, окунь, судак,щука). В низких концентрациях (<50 мкг/л) Раундап достоверно снижает активность пищеварительных пептидаз у большинства, а в более высоких (50−100 мкг/л) – существенно подавляет протеолитическую активность у всех исследованных видов рыб. В случае пептидаз слизистой оболочки кишечника наиболее устойчивы к Раундапу ферменты карпа, щуки и окуня, в случае пептидаз химуса – карпа, густеры и щуки. Величина эффекта Раундапа зависит от его концентрации и локализации ферментов. 6. Тяжелые металлы (цинк, медь, ртуть), поступающие с пищей, негативно влияют как на начальное (пищевое поведение), так и на центральное звено (ферментативная активность кишечника) экзотрофии. Кристаллический фенол и его производные (4-хлорфенол, 4-нитрофенол, 2,4-динитрофенол), аморфный фенол и фракции, образующиеся при его переходе в жидкое состояние, а также гербицид Раундап значительно снижают активность пептидаз кишечника у рыб разных видов в условиях in vitro, что ухудшает усвоение белковых компонентов объектов питания рыб и может существенно снижать их размерно-весовые характеристики и темп роста. Полученные данные необходимо учитывать при разработке рациональных условий питания рыб в современных экологических условиях, они могут найти применение для прогнозирования последствий загрязнения водоемов и водотоков токсическими веществами для их рыбного населения и с целью разработки превентивных мер.