Влияние интенсивной локомоции на поисковое поведение модельных беспозвоночных в новой среде: роль серотонина

Модельный объект прудовик Lymnaea stagnalis
В опытах использовали взрослых особей большого прудовика Lymnaea stagnalis (Gastropoda, Mollusca, Lophotrochozoa), которых содержали в аквариумах с дехлорированной водой при комнатной температуре, в качестве корма использовали
листья салата.
Поведенческие эксперименты на прудовике L. stagnalis
Для стимуляции интенсивной локомоции и исследования поведения прудовика на экспериментальной арене в ситуации выбора (неопределенности) использовались ранее описанные [Korshunova et al., 2016] и дополненные в данной работе поведенческие методики (Рис. 1). Прудовики помещались в открытый контейнер площадью (50х50 см) с низким содержанием аквариумной воды (2 мм) на два-четыре часа в зависимости от эксперимента. Такое количество воды вынуждало улитку к
передвижению, при этом, не давая животному высохнуть.
Оценка поведения на экспериментальной арене была произведена по четырём
основным параметрам: 1) время от посадки на арену до начала движения; 2) количество поворотов в первой фазе движения до выбора направления; 3) скорость движения в выбранном направлении; 4) время достижения границы арены. Построение треков и оценка скорости передвижения прудовиков осуществлялась с помощью программы EthoVision XT (Noldus, the Netherlands). Другие параметры поведения животных были обработаны вручную.
Рис. 1. Схема экспериментальной установки. А – экспериментальная арена вид сбоку. Б – трек демонстрирует две фазы поведения в ситуации выбора – повороты на месте и дальнейшее движение в выбранном направлении. Розовый прямоугольник справа обозначает светлую часть арены.
Фармакологические эксперименты на прудовике L. stagnalis
Улиток погружали в растворы 5-HT (0.1 мМ, 0,01 мМ, 0,001 мМ), 5-HTP (0.1 мМ) в 300 мл аквариумной воды на 2 часа. Часть животных инъецировали в область подошвы 100 мкл физиологического раствора (50 мM NaCl, 1.6 мM KCl, 4 мM CaCl2, 8 мM MgCl2, 10 мM Трис, pH7.6), содержащего кетансерин (0,02 мМ и 0,1 мМ), блокатор 5-HT рецепторов второго типа. Животных контрольной группы инкубировали в таком же объеме пресной воды, либо инъецировали физиологическим
раствором, соответственно.
Измерение содержания серотонина и его метаболитов в педальном и церебральном ганглии прудовика L. stagnalis
С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-РЭК; EICOM, Киото, Япония), была измерена концентрация: 1) серотонина; 2) предшественника серотонина 5-гидрокситриптофана и двух катаболитов: 3) N-ацетилсеротонина (Nac-5-НТ) и (4) 5- гидроксииндолуксусной кислоты (5-НІАА). Данные хроматографии проанализированы с помощью программного обеспечения PowerChrom (eDAQ Pty, Denistone East, NSW, Австралия).
Оценка электрической активности нейронов педального кластера прудовика L. stagnalis
В работе была применена стандартная электрофизиологическая процедура регистрации электрической активности идентифицированных нейронов моллюска [Dyakonova, Dyakonova, 2010; Dyakonova, et al., 2015]. Также сделаны записи электрической активности изолированных из ганглия клеток по методике, разработанной Дьяконовой Т.Л. [Дьяконова, 1989].
Модельный объект сверчок Gryllus bimaculatus
В экспериментах использовались взрослые самки и самцы сверчка G. bimaculatus DeGeer (Insecta, Arthropoda, Ecdysozoa) возрастом 2-3 недели после последней имагинальной линьки из колонии Института биологии развития им. Кольцова РАН. Животных кормили салатом, морковью, геркулесом, гамарусом и содержали при температуре 25-26 градусов по Цельсию, световом режиме 1212 и
свободном доступе к воде.
Поведенческие эксперименты: сверчок G. bimaculatus
Для стимуляции полета была использована ранее описанная методика [Hofmann, Stevenson, 2000]. Для исследования поискового поведения (фонотаксиса) у сверчка была сконструирована арена 1.5х1.5 м2, огражденная по периметру тканевыми стенками высотой 20 см. Колонка, транслирующая призывную песнь самца, была расположена за одной из стен. Животные после процедуры вызванного полета помещались в индивидуальные контейнеры на две минуты отдыха. Затем контейнер со сверчком перемещался на арену. Животные имели возможность свободно выходить из него. Призывный сигнал самца начинал транслироваться непосредственно перед помещением контейнера на арену. Контрольных животных перед посадкой на арену (в индивидуальных контейнерах) держали в руках (handling),
так же, как и при подготовке к полету.
Анализ поведения проводили по трем основным параметрам: а) количество
животных, достигших зоны у динамика; б) частота посещения зоны у динамика; в) процент времени, проведенного в зоне у динамика, от общего времени на арене после выхода из контейнера. Дополнительно были рассмотрены следующие параметры: г) средняя скорость передвижения сверчка по арене; д) «тяготение» к зоне у динамика или средняя дистанция от животного до зоны; е) время, затраченное от выхода из контейнера до достижения зоны у динамика; ж) время от посадки на арену до выхода из контейнера; з) частота преодоления препятствия (тряпичная стена) рядом с источником звука. Параметры «ж» и «з» рассчитаны вручную и учтены только в эксперименте с самками после полета. Для расчета других параметров была использована программа EthoVision XT.
Фармакологические эксперименты: сверчок G. bimaculatus Животные были инъецированы в область абдомена между 3 и 4 брюшными сегментами следующими веществами 1) 5-гидрокситриптофан (5-HTP): 1мМ, 10 мМ или 20 мМ в 100 мкл физиологического раствора; 2) альфа-метилтриптофан (AMTP), синтетическая аминокислота, ложный предшественник серотонина: 1,5 мг по 40 мкл за 3-4 суток до эксперимента. Контрольные группы получили инъекции
соответствующего объема физиологического раствора.
Статистический анализ результатов
Достоверность различий двух независимых групп проверяли непараметрическим U-критерием Манна-Уитни, парный тест Вилкоксона использовали для зависимых переменных. Для множественных сравнений использовали тест Краскела-Уоллиса с последующим применением коррекции для парных сравнений. Расчеты были произведены с помощью программы STATISTICA (Statsoft Inc.) и программы R [R Core Team, 2018, http://www.R-project.org/.].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние интенсивной локомоции на поведение моллюска Lymnaea
stagnalis в новой среде: участие серотонина Отставленные во времени поведенческие эффекты интенсивной
локомоции у Lymnaea stagnalis
Предшествующая двигательная активность в течение двух часов существенно
влияет на структуру поведения прудовика в новой среде, на сухой поверхности в 8

градиенте освещения [Korshunova et al., 2016]. В этом поведении отчетливо выделяются две фазы. Первая – это медленное вращение с частой сменой направления движения. Вторая – интенсивное движение в выбранном направлении (к свету или в тень). О том, что первая фаза отражает стадию неопределенности в выборе животного, свидетельствовал тот факт, что при уменьшении различий во внешней среде (на симметрично освещенной арене) длительность вращения возрастала, принятие решения затруднялось. Бо́льшая часть прудовиков (75%) выбирает движение к светлой половине арены, что может объясняться наличием фототаксиса у данного вида [Ваколюк, Жуков, 2000], однако примерно 25% выбирают темную сторону арены [Vorontsov, Dyakonova, 2017]. Ранее было показано, что предшествующая двигательная активность не только увеличивает скорость передвижения на сухой арене, но и снижает количество поворотов в первой фазе поведения, облегчая переход к принятию решения и движению в выбранном направлении [Korshunova et al., 2016]. Кроме того, у улиток сокращался латентный период первого движения на арене. При этом выбор света или тени оставался неизменным, а время достижения цели (границы арены) достоверно сокращалось.
Известно, что у позвоночных двигательная нагрузка характеризуется как быстрым, так и отставленным влиянием на когнитивные функции и поведение, причем это влияние различно. Насколько продолжительны эффекты интенсивной локомоции у моллюска и насколько сходны изменения в поведении непосредственно после и спустя определенное время после интенсивной локомоции, оставалось неизвестным. Мы проверили их сохранность через временной интервал, соответствующий длительности самой нагрузки, а именно через 2 часа отдыха в воде после наземной локомоции (ИЛ+О, n=31). Влияние нагрузки и отдыха оценивали по сравнению с двумя контролями: животными, (1) взятыми из разводного аквариума (КД, n=30) и (2) находившимися в новом контейнере в течение 2 часов, для контроля влияния новых условий среды на поведение прудовиков (КН, n=30).
Анализ поведения на арене показал, что различия по времени от посадки на арену до начала движения отсутствуют (критерий Краскела-Уоллиса: H = 0,28, p = 0,8), однако улитки экспериментальной группы совершали меньше поворотов до принятия решения о направлении движения (тест Краскела-Уоллиса: H (2, 91) = 13,01, p = 0,001, (рис. 2)) и имели более высокую скорость передвижения по сравнению с контрольной группой из аквариума (тест Краскела-Уоллиса: H (2, 91) = 7,5, p = 0,02). Также животные экспериментальной группы показали более быстрый набор скорости (z = 2,18; p < 0,03; U-критерий Манна-Уитни) по сравнению с группой из аквариума. Животные экспериментальной группы достигали границу арены быстрее, чем контрольные улитки из аквариума (критерий Краскела-Уоллиса: H (2, 91) = 9,1, p = 0,01). В дополнительной серии опытов сравнивались только две группы: прудовики после нагрузки и двухчасового отдыха (n = 62) и контрольные животные, содержавшиеся в новом контейнере (n = 65). Как и в первой серии, животные после локомоторной нагрузки и отдыха делали меньше поворотов перед началом движения в выбранном направлении (181 ± 17 градусов против 258 ± 22 в контроле, U-критерий Манна-Уитни, p=0,005). Рис. 2. Отставленные во времени поведенческие эффекты интенсивной локомоции. А – время от посадки на арену до начала движения. Б - количество поворотов до начала движения в выбранном направлении. В - скорость передвижения. Г - количество времени от начала движения до достижения границы арены. ИЛ+О – интенсивная локомоция, затем 2 часа «отдыха»; КД – контроль из разводного аквариума; КН – контроль из «нового» контейнера. Достоверность различий оценивали с помощью критерия множественных сравнений Краскела-Уоллиса с последующими апостериорными тестами. Все значения даны как медианы с нижним и верхним квартилями. * означает p <0,05. Влияние стрессового воздействия, не связанного с локомоцией, на поведение улиток в ситуации выбора Стресс неизбежно сопровождает интенсивные физические нагрузки у животных в естественных и экспериментальных условиях. Чтобы удостовериться в том, что поведенческие эффекты после интенсивной локомоции не обусловлены одним лишь экспериментальным стрессом, прудовики были помещены в стрессогенную ситуацию с исключением мышечной активности, связанной с локомоцией. В сосудах, наполненных аквариумной водой, животные помещались на платформу шейкера, где осуществлялось круговое покачивание (200-230 оборотов в минуту), достаточное для исключения возможности прилипания животных к поверхностям сосуда и движения по верхнему слою воды. Анализ поведения на экспериментальной арене показал следующее: различий в латентном периоде начала движения не обнаружилось (z = 0,6, p = 0,5, U-критерий Манна-Уитни), также не было отличий в количестве поворотов перед выбором направления (z = 1,2, p = 0,2, U-критерий Манна-Уитни). Однако у животных, подвергшихся стрессовому воздействию (n=38), средняя скорость локомоции была значительно ниже (z = 1,96; p = 0,0049, U-критерий Манна-Уитни). Прудовики достигали границы арены позже, чем в контроле (n=38; z = 3,3, p = 0,0008). Таким образом, данное стрессогенное воздействие не только не воспроизвело эффекты интенсивной локомоции на поведение, но и вызвало обратный эффект - уменьшение скорости передвижения на сухой поверхности. Быстрое и отставленное влияние интенсивной локомоции на электрическую активность серотонинергических нейронов PeA кластера Быстрое влияние Серотонинергические нейроны из кластера PeA педального ганглия, контролирующие ресничную и мышечную локомоцию, в препаратах ЦНС улиток после интенсивной локомоции показали более высокую частоту электрической активности по сравнению с контрольными препаратами (n = 32, рис. 3). При изоляции из ганглия нейроны PeA снижали активность как в контрольной, так и в экспериментальной группе, однако различия между ними сохранялись (n = 29, рис. 4Б, правая панель). Нейроны, выделенные из ганглиев «тренированных» улиток, имели более деполяризованный мембранный потенциал (-50 ± 4 мВ по сравнению с контролем -58,9 ± 4,7 мВ, p <0,01 U-критерий Манна-Уитни) и более высокую частоту электрической активности (Рис. 3). Различия можно было наблюдать в течение как минимум одного часа, несмотря на потерю как морфологических, так и химических связей после изоляции. Данные указывают на то, что опыт интенсивной локомоции изменяет биофизические (электрические) свойства нейронов. Эти изменения могут сохраняться даже после изоляции нейронов от их функциональной сети, то есть после потери синаптических и химических связей. Рис. 3. Частота потенциалов действия в минуту нейронов PeA8 в течение 25 минут. Рис. 4. Влияние интенсивной локомоции на активность нейронов РеА в ЦНС и после изоляции. A – записи контрольных (К, контроль) и опытных (ИЛ, интенсивная локомоция) нейронов РеА во время изоляции из ганглия. Нижнее подчеркивание указывает на механическую изоляцию (вытягивание нейрона из ганглия). Выделение из ганглия приводит к снижению электрической активности и гиперполяризации мембранного потенциала в контрольных и экспериментальных клетках. Тем не менее, различия сохраняются после изоляции. Б – средняя частота потенциалов действия в минуту (ПД/мин). В левой части: контрольные нейроны (К, контроль), зарегистрированные в ЦНС, нейроны от опытных улиток (ИЛ, интенсивная локомоция), зарегистрированные в ЦНС. Измерения выполнялись через 5 минут после введения электрода в нейрон (n = 32, p <0,005). В правой части: электрическая активность нейронов через 5 минут после полной изоляции (n = 29, p <0,01). Тест Манна-Уитни. Отставленное влияние интенсивной локомоции Далее была поставлена задача проверить сохраняется ли на клеточном уровне эффект интенсивной локомоции после ее прекращения. После ползания в низкой воде улитки были помещены в глубокий контейнер с водой для двухчасового «отдыха». Затем сравнили состояние РеА кластера у «отдыхавших» и контрольных улиток. Различий в частоте активности между нейронами экспериментальных и опытных животных в условиях ЦНС обнаружено не было (рис. 5, левая часть). Однако различия проявились после изоляции нейронов из ганглия (рис. 5, правая часть). Нейроны из контрольных препаратов (n = 23) сильнее гиперполяризовались при изоляции из ганглия, чем нейроны опытной группы (n = 20). Изменение мембранного потенциала при изоляции значительно различалось между двумя группами: + 2,3 ± 3 мВ в опытной по сравнению с контролем -10 ± 3 мВ (p = 0,003). Это различие закономерно привело к разнице в частоте электрической активности нейронов, изолированных из контрольных и опытных ЦНС. Таким образом, были обнаружены изменения в эндогенной электрической активности серотонинергических нейронов «отдыхавших» улиток с опытом интенсивной локомоции, которые оказались «подавлены» внутри ганглия, но проявились при изоляции. Рис. 5. Активность нейронов PeA кластера прудовиков после 2 часов локомоции и 2 часов отдыха (ИЛ+О, интенсивная локомоция + отдых) и контрольной группы (К, контроль). Показана средняя частота потенциалов действия в минуту (ПД/мин). В левой части К и ИЛ+О нейроны в ЦНС (n = 62, p = 0,5). В правой части К и ИЛ+О нейроны после изоляции (n = 43, р <0,05). Все значения даны как медианы с квартилями. U-критерий Манна-Уитни. Быстрое и отставленное влияние интенсивной локомоции на содержание серотонина в педальных и церебральных ганглиях Lymnaea Сравнивали четыре группы улиток: (1) контрольные улитки, находящиеся в («новых») контейнерах с водой (КН); (2) улитки, после интенсивной локомоции в течение двух часов (ИЛ 2 часа); (3) улитки, которые 2 часа «отдыхали» в контейнере с водой после двухчасовой интенсивной локомоции (ИЛ+О); и (4) улитки, после четырех часов интенсивной локомоции (ИЛ 4 часа). Были измерены концентрации 5- HTP, 5-HT, Nac-5-HT и 5-HIAA в педальных и церебральных ганглиях. Педальные ганглии содержат нейроны, связанные с движением, в том числе серотонинергический кластер PeA, на активность клеток которого, как было показано, влияет интенсивная локомоция. Церебральные ганглии также содержат серотонинергические нейроны, вовлеченные в регуляцию других форм поведения, в частности, обучения и памяти. Педальный ганглий Наиболее заметные изменения в содержании исследуемых веществ наблюдались в группе, которая находилась в контейнерах с водой два часа после интенсивной локомоции (ИЛ+О, рис. 6). Концентрация предшественника серотонина 5-HTP была более чем в 10 раз выше, чем во всех других группах (тест Краскела – Уоллиса: H (3, 46) = 29,16, p = 0,0001). Сравнение по группам показало ИЛ+О / КН, p = 0,0016; ИЛ+О / ИЛ 2часа, p = 0,002; ИЛ+О / ИЛ 4 часа, p = 0,0001; ИЛ 2часа / КН, p = 0,9; ИЛ 4 часа / КН, p = 0,79). Равным образом содержание 5-HIAA было самым высоким в группе ИЛ+О, со значительными различиями по сравнению с контрольными улитками и улитками после 4 часов интенсивной локомоции (ИЛ 4 часа) (тест Краскела-Уоллиса: H (3, 46) = 13,08, p = 0,0045) ИЛ+О / КН, p = 0,029; ИЛ+О / ИЛ 2часа p = 0,49; ИЛ+О / ИЛ 4 часа; p = 0,004; ИЛ 2часа / КН, p = 0,9; ИЛ 4 часа / КН, p = 0,85). Содержание Nac-5-HT было значительно выше в группе ИЛ+О по сравнению со всеми другими группами (критерий Краскела-Уоллиса: H (3, 45) = 12,8, p = 0,0051). Сравнение по группам показало ИЛ+О / КН p = 0,019; ИЛ+О / ИЛ 2часа, p = 0,04; ИЛ+О / ИЛ 4 часа p = 0,01; ИЛ 2часа / КН, p = 0,9; ИЛ 4 часа / КН, p = 0,9). Ни два, ни четыре часа интенсивной локомоции не привели к какому-либо значительному увеличению содержания самого серотонина в педальных ганглиях (H (3, 47) = 4,07, p = 0,25), хотя в группе, двигавшейся в течение 4 часов, наблюдалась тенденция к увеличению серотонина, где p = 0,1. Церебральный ганглий Была выявлена разница в концентрации серотонина между группой после двухчасовой интенсивной локомоции (ИЛ) и группой «бег-отдых» (ИЛ+О; тест Краскела – Уоллиса: H (3, 48) = 7,94, p = 0,04, рис. 5; ИЛ ИЛ+О, p = 0,04). Содержание 5-HTP имело такой же профиль изменений, что и 5-HT (тест Краскела – Уоллиса: H (3, 48) = 9,77. р = 0,02). А именно, значительное увеличение 5-HTP было обнаружено в группе ИЛ+О (бег - отдых) по сравнению с группой двухчасовой интенсивной локомоции (сравнение post hoc: z = 3,08; p = 0,012). Содержание 5-HIAA было значительно выше во всех трех экспериментальных группах по сравнению с контролем, который не подвергался физической нагрузке (критерий Краскела – Уоллиса: H (3, 48) = 24,15, p = 0,001). Содержание Nac-5-HT было выше в группах ИЛ+О (бег - отдых) и ИЛ (бег 4 часа) по сравнению с группой после двухчасового бега (критерий Краскела – Уоллиса: H (3, 48) = 22.07, p = 0,0001). Рис. 6. Быстрое и отставленное влияние интенсивной локомоции на содержание серотонина и его катаболитов в педальных ганглиях Lymnaea. Слева направо: серотонин (5- HT); предшественник 5-HT (5-гидрокситриптофан, 5-HTP, см. также в более крупном масштабе); N-ацетилсеротонин, Nac-5-HT; 5-гидроксииндолацетоальдегид, 5-HIAA. Синим цветом обозначены контрольные улитки, которых держали в новом контейнере в течение 2 часов (КН, n = 13); светло-красным цветом обозначены улитки, которые интенсивно двигались в течение двух часов (ИЛ, интенсивная локомоция, n = 11); фиолетовым цветом обозначены улитки, «отдыхавшие» два часа в контейнере с водой после двухчасовой интенсивной локомоции (ИЛ+О или ИЛО, интенсивная локомоция + отдых, n = 13); темно- красным цветом обозначены улитки, которые интенсивно двигались в течение четырех часов (ИЛ 4 часа, n = 12). Достоверность различий оценивали с помощью критерия множественных сравнений Краскела-Уоллиса с последующими апостериорными тестами. Все значения представлены как медианы с нижним и верхним квартилями *, **, *** указывают p <0,05, 00,1 и 0,001 соответственно. Таким образом, наиболее выраженные изменения в метаболизме серотонина были выявлены в группе «покой после нагрузки». Повышенный катаболизм серотонина и прекращение его синтеза могут быть ответственны за эффекты «отдыха». Также оказалось, что уровень серотонина по-разному регулируется в разных частях ЦНС двигательной активностью у прудовика. Возможно, такое изменение распределения серотонина способствует реализации разных функций разными серотониновыми нейронами в различных поведенческих контекстах. Зависимость поведения улитки в новой среде от фармакологических вмешательств в функционирование серотонинергической системы Влияние метаболического предшественника серотонина 5- гидрокситриптофана (5-HTP) на поведение улиток в условиях выбора 5-гидрокситриптофан является непосредственным метаболическим предшественником серотонина, который при искусственном введении захватывается серотониновыми нейронами из межклеточной среды, декарбоксилируется декарбоксилазой ароматических аминокислот до серотонина, существенно повышая его содержание и секрецию [Dyakonova et al., 2009]. При введении целому животному 5-HTP увеличивает скорость передвижения у Lymnaea [Tsyganov, Sakharov, 2000; Pavlova, 2001, 2019]. Поскольку упомянутые выше эксперименты указывали на возможное участие серотонинергической системы в изменение поведения, вызванное интенсивной локомоцией, мы проверили, воспроизводит ли повышение содержания серотонина поведенческие эффекты интенсивной локомоции на тестовой арене с асимметричным освещением. Было обнаружено, что улитки (n = 27), помещенные в раствор 5-HTP 0.1 мМ на 2 часа, демонстрировали уменьшение латентного периода начала движения на арене по сравнению с контрольной группой (n = 27; z = 2,05, p = 0,3, U-критерий Манна– Уитни, рис 5А). Различий по поворотам в первой фазе движения до выбора направления не обнаружено (z = 0,4, p = 0,67, U-критерий Манна-Уитни, рис 5Б). Средняя скорость передвижения была выше у улиток после введения 5-HTP (z = 2,09, p = 0,03, U-тест Манна-Уитни, рис. 5В), также эта группа животных достигала границы арены быстрее (рис. 5Г, z = 2,47; p = 0,013, U-критерий Манна-Уитни). Соотношение выбора светлой и темной части арены было одинаковым в обеих группах. Влияние серотонина (5-HT) на поведение улиток в условиях выбора У улиток опытной группы (n = 24) латентный период первого движения был значительно меньше, чем в контрольной группе (n = 30, z = 2,54, p = 0,01, U-критерий Манна-Уитни), тогда как различий в количестве поворотов перед выбором направления не обнаружилось (возможна тенденция к различию p=0,06). Также животные после 5-HT доползали до границы арены быстрее, чем контрольные (z = 1,96; p = 0,0049, U-критерий Манна-Уитни) при этом различия по средней скорости оказалось на грани статистической значимости (p = 0,055), однако средняя скорость во время направленного движения (6я–8я минута после начала эксперимента была выше, чем в контрольной группе (z = 2, p = 0,03, U-критерий Манна-Уитни). Соотношение выбора светлой и темной части арены было одинаковым в обеих группах. Влияние кетансерина на поведение улиток в условиях выбора Кетансерин является антагонистом серотониновых 5-НТ2А рецепторов млекопитающих и 5-НТ2Lym прудовика Lymnaea stagnalis, которые сходны структурно и функционально [Gehardt et al., 1996], а также рецептора прудовика 5-НТ1Lym [Sugamori et al., 1993]. Экспериментальной группе животных вводили 100 мкл физиологического раствора, содержащего 0,02 мМ (n = 9) или 0,1 мМ (n = 13) кетансерина, за 15 минут до теста. Контрольные группы (n = 9 и n = 13 соответственно) получали 100 мкл физиологического раствора. Улитки, которым вводили 0,02 мМ кетансерина, демонстрировали тенденцию к более позднему началу активности (93 ± 32 сек., против 28 ± 12 сек., z = 1,9, p = 0,051, U-критерий Манна-Уитни). Эффект был достоверным в группе, получавшей 0,1 мМ кетансерина (424 ± 110 сек., против 78 ± 20 сек., z = 2,1, p = 0,035, U-критерий Манна-Уитни). Не было различий на этапе вращения между группой после инъекции кетансерина 0,02 мМ и контрольной (z = 0,68, p = 0,49, U-критерий Манна-Уитни). Однако более высокая концентрация кетансерина уменьшала общее число вращений (z = 1,9, p = 0,049). Скорость передвижения была значительно ниже у улиток, получавших как 0,02 мМ, так и 0,1 мМ кетансерина, чем в контроле (z = 2,0, p = 0,04 и z = 2,2, p = 0,027 соответственно, U-критерий Манна-Уитни). Животные после инъекций достигали границ арены позже, чем в контрольной группе. Время до финиша составило 808 ± 51 сек для 0,02 мМ и 837 ± 45 сек для 0,1 мМ кетансерина, в отличие от 556 ± 32 сек и 680 ± 55 сек в соответствующих контролях (z = 2,85, p = 0,004 и z = 2,29, p = 0,02; рис. 7). Рис. 7. Наложение треков улиток контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, и экспериментальной группы, которым вводили 0,1 мМ кетансерина. Таким образом, после инкубации улиток в растворе 5-HTP уменьшалось время до начала движения и время, необходимое для достижения виртуальной границы арены. Данный эффект частично можно объяснить влиянием серотонина на нейроны педального кластера, мышечные клетки и реснички подошвы, но не исключены и другие, центральные механизмы. Серотонин вызывает аналогичные, но более слабые изменения. Различие в эффективности двух веществ можно объяснить разными механизмами их действия на рецепторы серотонина. Серотонинергические нейроны сначала захватывают 5-HTP, а затем превращают в серотонин с помощью фермента AAD (декарбоксилаза ароматических аминокислот). 5-HTP действует через усиленное высвобождение серотонина [Чистопольский, Сахаров, 2000]. Инкубация в самом серотонине может привести к менее специфическому действию на различные рецепторы серотонина и моноаминов. Однако введение ни серотонина, ни его предшественника не повлияло на количество поворотов в ориентировочной фазе поведения. Вероятно, поведение, связанное с выбором, обусловлено другими нейромедиаторными механизмами. 2. Влияние интенсивной локомоции (полета) на поведение сверчка Gryllus bimaculatus в новой среде: возможное участие серотонина Влияние вызванного полета Влияние предшествующего полета на фонотаксис самок сверчка в новых условиях 38 из 39 самок после полета и 35 из 38 самок контрольной группы покинули свои контейнеры и вышли на арену в ходе эксперимента. Этих животных использовали для дальнейшего анализа. 35 из 38 летавших самок сверчков достигли зоны у динамика (92%) по сравнению с 20 из 35 в контроле (57%; p = 0,002; тест χ2). Летавшие сверчки демонстрировали явное предпочтение зоны у динамика в сравнении с другими частями арены. Контрольная группа демонстрировала большее распределение по периметру - отмечена высокая активность в углах и в области посадки на арену (Рис. 8). На рисунке 9 показаны примеры отдельных треков, характерных для самок после полета (А, В) и контрольной группы (Б, Г), а также объединенных треков всех животных: после вызванного полета (Д) и контрольная группа (Е). Самки после полета чаще попадали в зону у динамика (p = 0,001; Z = 3,17; U- критерий Манна – Уитни, рис. 10А). Они также проводили больше времени в данной зоне (p = 0,0001; Z = 3,88; U-критерий Манна – Уитни, рис. 10Б). Меньшая дистанция до зоны наблюдалась у сверчков после полета (Z = 3,98, p = 0,00004, рис. 10В), что указывает на более высокое тяготение «летавших» сверчков к этой зоне. Животные после полета значительно чаще залезали на стену напротив динамика и перелезали через нее, чтобы достичь спрятанный источник звука (20 против 7, p = 0,003). Тогда как сверчки из контрольной группы покидали арену в течение 10 минут эксперимента чаще, чем летавшие, перелезая через стену в местах, отличных от области динамика (n = 15 по сравнению с n = 3, p = 0,002, тест χ2). При этом не обнаружено существенных различий между экспериментальной и контрольной группами сверчков ни в скорости движения (p = 0,3; Z = - 1,21; U- критерий Манна – Уитни), ни во времени от посадки на арену до выхода из контейнера (z = 0,67, p = 0,49, U-критерий Манна – Уитни). Эксперимент был воспроизведен на другой арене. В новых экспериментальных условиях динамик располагался слева от места посадки животного, тогда как ранее он находился справа. Контрольная группа помимо «хендлинга» получала каплю клея на верхнюю часть грудного сегмента (после застывания перед началом эксперимента клей снимали), что в большей степени повторяло манипуляции, проводимые с экспериментальной группой. Выборка была существенно меньше, чем в первоначальном эксперименте. Также при повторном воспроизведении освещенность арены была выше (около 250 lx), чем в первоначальном опыте (140 lx). Высокая освещенность делает экспериментальую ситуацию более стресогенной для насекомых. Различий в общем количестве посещений зоны у динамика не было обнаружено, однако после полета все самки сверчка (n=14) достигли зоны, в отличие от контроля (75%, n=12, p = 0,04; тест χ2), а также провели в ней значительно больше времени (p = 0,02; Z = 2,1; U-критерий Манна-Уитни). Расстояние, преодолённое летавшими животными до источника звука, было меньше, чем в контроле (p = 0,015, Z = 2,4; U-критерий Манна-Уитни). Пять летавших самок в отличие от одной в контрольной группе перелезли через стену рядом с динамиком, чтобы добраться до источника звука. Как и в первоначальном эксперименте, не было разницы в скорости передвижения между двумя группами животных. Таким образом, влияние полета на последующее поведение сверчка воспроизводимо и носит устойчивый характер. При постановке эксперимента важно обращать особое внимание на такие факторы, как время суток (эффекты проявляются сильнее в первую половину дня), возраст сверчков (с возрастом фонотаксис ухудшается), освещенность и температура (желательно не ниже 23 градусов по Цельсию). Рис. 8. На «тепловых» картах показано общее среднее время, проведенное сверчками в определенном месте арены. Градация происходит от синего цвета (минимальное количество времени в данной точке, проведенное всеми сверчками) до тёмно-красного – черного цвета (максимальное время). Белый цвет – отсутствие сверчка в данной точке арены. A – полет. Б – контроль. Для исключения дополнительных факторов, которые могут воздействовать на самок, в ходе эксперимента было исследовано их поведение на арене при отсутствии призывной песни самца. Ни экспериментальные, ни контрольные самки не «интересовались» зоной у динамика. Средняя скорость передвижения составила 4,2 ± 2,4 см/мин в группе после полета и 4,5 ± 3,2 см/мин в контрольной группе (z = 0,04, p = 0,9); среднее количество посещений зоны у молчащего динамика было менее 1 в обеих группах: 0,55 ± 1 и 0,3 ± 0,7 (z = 0,39, p = 0,61). Ни в контрольной, ни в экспериментальной группе животные не пытались достичь зоны у динамика. Рис. 9. Треки самок сверчка на экспериментальной арене. Индивидуальные треки (A- Г): самки после полета (A, В) и контрольные (Б, Г). Треки на Д, Е показывают наложение всех треков для летавших и контрольных групп соответственно. Розовый прямоугольник - зона у динамика внутри арены, включая нижнюю часть стены. Зеленая рамка показывает положение контейнера, в котором сверчок помещался на арену и который он мог свободно покинуть. Рис. 10. Сравнение параметров поискового поведения самки сверчка на экспериментальной арене. Влияние вызванного полета на фонотаксис самца Gryllus bimaculatus 100% самцов (n=10) после полета достигли источника призывной песни, тогда как в контрольной группе только 60% (Рис. 11). Самцы после полета чаще попадали в зону у динамика (p = 0.01; Z = 2.43; U-критерий Манна-Уитни). Они также проводили там больше времени (p = 0.003; Z = 2.95; U-критерий Манна – Уитни). Сверчки после полета проделали меньший путь до зоны у динамика (Z = -2.79, p = 0.005). Средняя скорость передвижения оказалась выше в экспериментальной группе (p = 0.01; Z = - 2.49; U-критерий Манна-Уитни). При этом не было отличий по времени от начала движения до достижения источника призывной песни. Время от посадки на арену до выхода из домика не проверялось. Рис. 11. «Тепловая» карта демонстрирует треки самцов сверчков после процедуры вызванного полета (слева) и контрольной группы (справа). Влияние предшественника серотонина на поведение сверчка Gryllus bimaculatus в новой среде Влияние метаболического предшественника серотонина 5-HTP на поисковое поведение (фонотаксис) самки сверчка в новых условиях Для проверки роли серотонина в эффектах полета на фонотаксис сверчка самкам была сделана инъекция 5-гидрокситриптафана (5-HTP). Сходная схема изучения влияния повышенного синтеза серотонина на поведение G. bimaculatus уже была ранее использована в других исследованиях [Ureshi et al., 2003; Dyakonova, Krushisky, 2013]. Самки, получившие раствор 10 Мм, чаще приходили в зону у динамика (Kruskal-Wallis test: H ( 2, 75) =6.24 p =0.04; рис. 12); post hoc тесты показали различие между контролем и группой с инъекцией большей концентрации (10 мМ и 1 мМ; р=0,03), а также между двумя экспериментальными группами (р=0,02). Сверчки проводили значительно больше времени в зоне источника призывной песни (Kruskal-Wallis test: H ( 2, 75) =8.06 p =0.01); post hoc тесты показали различие между контролем и группой с инъекцией большей концентрации (10 мМ; р=0,008), а также между двумя экспериментальными группами (10 мМ и 1 мМ., р=0,04). Отличий между тремя группами в пройденном расстоянии до зоны у динамика многомерный тест не показал (Kruskal-Wallis test: H (2, 75) =3.54 p =0.1). По другим параметрам также отличий не обнаружилось. Рис. 12. График отображает время, проведенное в зоне у динамика (процент времени от общего времени нахождения на арене). Первый столбик слева – самки, получившие инъекцию 5-HTP 10 Мм; средний столбик – самки, получившие инъекцию 5-HTP 1 мМ; правый столбик – контрольная группа, получившие инъекцию физраствора. Данные представлены как среднее значение со стандартной ошибкой среднего. Влияние 5-HTP на половое и поисковое поведение (фонотаксис) самца сверчка в новых условиях После инъекции 20 мМ 5-HTP 8 из 10 самцов вышли на экспериментальную арену из своих контейнеров и 7 дошли до источника звука, тогда как в контроле из 8 вышедших на арену сверчков только 2 дошли до источника звука (т.е. 70% в опытной группе и 20% в контроле; значение критерия χ2 составляет 5.0; p=0.02). Самцы после полета чаще попадали в зону у динамика (p = 0.03; Z = 2.10; U-критерий Манна – Уитни). Они также проводили там больше времени (p = 0.01; Z = 2.41; U-критерий Манна – Уитни). По другим параметрам различий не обнаружилось. Влияние AMTP на половое и поисковое поведение (фонотаксис) самок сверчка в новых условиях Инъекция альфа-метилтриптофана (АМТP) существенно снижает содержание серотонина и его катаболита 5-HIAA в ЦНС, что было продемонстрировано на грызунах и насекомых [Sloley, Orikasa, 1988; Missala, Sourkes, 1988]. Чтобы проверить возможное участие серотонина в поведенческих эффектах полета, экспериментальной группе животных (n=12) была сделана инъекция AMTP (см. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ). Контрольной группе (n=15) сделана инъекция физраствора. Перед помещением на экспериментальную арену все животные подвергались процедуре вызванного полета. Животные после воздействия AMTP не подходили к источнику призывной песни (Рис. 13). 10 из 12 сверчков вышли на арену, но ни одна самка не достигла динамика. В контроле из 15 самок на арену вышло 14. Динамика достигло 33% самок. Значение критерия χ2 составляет 4.9, p=0.02. Рис. 13. Треки самок сверчка на экспериментальной арене. A – самки, получившие инъекцию 1.5 мг AMTP Б – контрольная группа, получившая инъекцию физ. раствора. Красный прямоугольник обозначает зону у динамика внутри арены. Серый прямоугольник обозначает положение контейнера, желтым цветом обозначена область вокруг контейнера. Таким образом, мы обнаружили, что сверчки независимо от пола реагируют на призывную песню самца, проделывая путь от места посадки на арену до источника призывной песни. Процедура вызванного полета значительно усиливала тягу к источнику звука (фонотаксис), что выражалось в увеличении числа сверчков, дошедших до динамика, частоте попадания в зону у динамика и времени, проведенном в этой зоне. Примечательно, что инъекция предшественника серотонина (5-HTP) существенно усиливала тягу сверчков к источнику звука, что воспроизводило действие полета. При этом, снижение содержания серотонина с помощью введения синтетической аминокислоты альфа-метилтриптофана (AMTP) снимало эффект полета. ЗАКЛЮЧЕНИЕ У обоих исследованных видов было выявлено влияние интенсивной локомоции на последующее поисковое поведение в новой среде. Проведено исследование возможного участия серотонина в этих эффектах. Отставленные эффекты интенсивной локомоции были обнаружены у Lymnaea на поведенческом, клеточном и метаболическом уровнях. На поведенческом уровне животные продемонстрировали уменьшение количества ориентировочных поворотов в первой фазе поведения улитки в новой среде. Данный эффект был ранее показан в другой работе, как непосредственный результат интенсивной локомоции, отражающий скорость «принятия решения» или степень «уверенности» улитки в ситуации выбора [Korshunova et al., 2016]. Теперь было выяснено, что он сохраняется по крайней мере в течение двух часов. Стрессогенное воздействие, имитирующее турбулентное течение в естественной среде, оказало влияние отчасти противоположное эффектам интенсивной локомоции, что проявилось в основном в уменьшении скорости передвижения. После интенсивной наземной локомоции в контейнере с низким содержанием воды в серотонинергических нейронах педального кластера обнаружено увеличение активности нейронов при внутриклеточной регистрации внутри ганглия, тогда как через два часа после нагрузки, активность клеток снижалась до контрольной группы. После изоляции из ганглия нейроны «упражнявшихся» прудовиков (и в группе с двухчасовым отдыхом, и сразу после двигательной нагрузки) были более активны, чем в контрольных группах. Эти данные впервые показали изменение эндогенных биофизических свойств серотонинергических нейронов после моторной нагрузки. Самое значительное изменение метаболизма серотонина педального ганглия было в группе после двух часов отдыха, что нашло свое отражение в повышении концентрации предшественника серотонина (5-HTP) и основного катаболита 5- гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA). В церебральных ганглиях этой же группы улиток содержание серотонина (5-HT) было наиболее высоким. Фармакологические воздействия позволяют сделать вывод о том, что серотонин связан с ускорением поискового поведения (быстрым началом движения и увеличением скорости передвижения) в условиях неопределенности после интенсивной локомоции, однако за эффект уменьшения ориентировочных поворотов отвечают, по-видимому, другие сигнальные молекулы. Эксперименты на сверчке Gryllus bimaculatus показали, что полет усиливает фонотаксис как у самок, так и у самцов. Данный факт заставляет задуматься о базовом механизме, лежащем в основе усиления фонотаксиса у обоих полов. Таким базовым механизмом может быть влечение животного к своей группе или «тяга к конспецифику». Группа конспецификов предоставляет возможность для размножения и указывает на относительно безопасную и благополучную территорию. Эксперименты с введением 5-HTP соответствуют результатам других исследований, показывающих значимость серотонинергической системы в социальном взаимодействии позвоночных и беспозвоночных животных [Kiser et al., 2012; Edsinger, Dölen, 2018]. Ближе всего к нашим данным оказались исследования, проведенные на пустынной саранче Schistocerca gregaria [Anstey et al., 2009; Rogers et al., 2014], показывающие, что введение серотонина обуславливает трансформацию одиночной формы саранчи в стайную, что характеризуется значительным изменением поведения, в частности, особи, которые стремились избегать сородичей, начинают собираться в группу. Таким образом, описанное влияние локомоции, в данном случае полета, подготавливают животное к попаданию в новые условия и должны способствовать выживанию. Полученные результаты удовлетворяют предположению о том, что видоспецифичная интенсивная локомоция оказывает стимулирующее действие на поисковое поведение в новой среде у представителей двух групп первичноротых животных большого прудовика Lymnaea stagnalis и сверчка Gryllus bimaculatus. У обоих видов также продемонстрировано участие серотонинергических механизмов в обеспечении данного влияния интенсивной локомоции. ВЫВОДЫ 1. У двух исследованных видов первичноротых животных предшествующая интенсивная локомоция оптимизирует поисковое поведение в новой среде, что проявляется у моллюска Lymnaea stagnalis в уменьшении количества ориентировочных поворотов перед выбором направления движения и увеличении скорости локомоции, а у сверчка Gryllus bimaculatus - в усилении конспецифичного фонотаксиса. 2. Влияние интенсивной локомоции у Lymnaea stagnalis сохраняется на протяжении двух часов после нагрузки, что проявляется в изменении поискового поведении моллюска в новой среде, повышенной эндогенной активности серотонинергических нейронов педального кластера и усилении метаболизма серотонина. Изменение в поведении моллюска после интенсивной локомоции не является следствием экспериментального стресса, так как значительно отличается от поведения после иного стрессогенного воздействия, не связанного с локомоторной нагрузкой. 3. Серотонин воспроизводит влияние интенсивной локомоции на часть поведенческих параметров, таких как время от посадки до начала движения и скорость локомоции Lymnaea stagnalis в новой среде. 4. Полет стимулирует поиск конспецифика у сверчка Gryllus bimaculatus, что проявляется в усилении фонотаксиса в новой среде. Сверчки после полета, независимо от пола, чаще подходят к источнику призывной песни и проводят там больше времени. 5. Серотонин играет важную роль в механизмах усиления фонотаксиса после полета. Введение предшественника серотонина усиливает фонотаксис сходным с полетом образом, тогда как ингибитор синтеза серотонина отменяет эффект влияния полета на фонотаксис.